許海棠，盧建芳，趙彥芝，周菊英

（廣西民族大學化學化工學院，廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室，廣西南寧530006）

山豆根提取物抗氧化和抑菌活性的研究

許海棠，盧建芳，趙彥芝，周菊英

（廣西民族大學化學化工學院，廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室，廣西南寧530006）

研究山豆根不同溶劑（氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇）提取物的抗氧化活性和抑菌活性，通過測定四種提取物的DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基的清除能力以及還原能力來評估其抗氧化能力；并通過測試各提取物對7種實驗菌的最低抑菌濃度（MIC）來評估它們的抑菌活性。結(jié)果表明：山豆根四種溶劑提取物均具有一定的抗氧化能力和抑菌活性，其中，對DPPH自由基的清除效果最佳，EC50均小于0.2mg/mL；乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，其MIC為0.313mg/mL。

山豆根，提取物，抗氧化，抑菌

山豆根為豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep．）的干燥根及根莖，主產(chǎn)于廣西、云南、貴州等地。始載于《開寶本草》，藥性苦寒，有毒。具有清熱解毒，消腫利咽之功效。近代臨床常用于治療咽喉腫痛、濕熱黃疸以及心律失常等病癥。山豆根化學成分豐富，主要成分有生物堿和黃酮化合物，還含有香豆素、蒽醌、甾醇、咖啡酸、脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等成分。

據(jù)目前已有的研究表明，山豆根具有抗炎［1-2］、抗病毒［3］、免疫［4］、保肝［5］、抗腫瘤［6-8］以及改善心血管系統(tǒng)循環(huán)［9-10］的作用。胡庭俊等研究發(fā)現(xiàn)山豆根醇提取物、多糖具有抗氧化及抑菌作用［11］。但是，迄今為止，尚未見有關(guān)系統(tǒng)考察山豆根不同極性部位的抗氧化性能及抑菌效果的報道。本文采用4種體外抗氧化評價方法對山豆根不同極性溶劑提取物進行抗氧化能力的測定，并測定其對7種常見病原菌的最低抑菌濃度，以評估山豆根不同溶劑提取物的抗氧化性和抑菌性，旨在更好地指導臨床用藥，并進一步篩選活性成分，為促進山豆根的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

山豆根購于廣西南寧老百姓大藥房，產(chǎn)地廣西；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS［2，2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽］均購于sigma公司；牛肉浸膏、蛋白胨、標準菌種（金黃色葡萄球菌CMCC26003、大腸埃希菌CMCC44102、銅綠假單胞菌CMCC10104、普通變形桿菌CMCC49027、肺炎克雷伯氏菌CMCC46117、乙型溶血性鏈球菌ATCC21059、白色念珠球菌ATCC10231）均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑國產(chǎn)分析純。

UV-1800島津紫外可見分光光度計蘇州島津儀器有限公司；RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；PL203電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；SPS401F型電子天平奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；AJF-1001-U型基礎(chǔ)性純水器艾科浦公司；DP-06A高速中藥粉碎機浙江大鵬機械有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；SPH-2102型恒溫搖床上海世安實驗設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1山豆根提取物的制備山豆根經(jīng)粉碎后過40目篩，稱取100g，用600mL石油醚回流1.5h，揮干濾渣中的石油醚后，用氯仿回流提取2h，過濾，共提取2次，合并兩次濾液，得氯仿提取液。同樣，揮干濾渣中上次溶劑后，接著依次用乙酸乙酯、正丁醇、乙醇回流提取，每種溶劑各提取2次，每次2h，過濾，分別合并兩次濾液。四種濾液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，濃縮物真空干燥至干，得到山豆根不同溶劑提取物，備用。

1.2.2樣品溶液的制備抗氧化活性樣品溶液：先用二甲基亞砜（DMSO）溶解山豆根各提取物，配成20mg/mL的樣品溶液，用之前用乙醇稀釋至適宜濃度，進行測試。抑菌實驗的樣品溶液：先用DMSO溶解山豆根各提取物，配成100mg/mL的樣品溶液，用之前用無菌水稀釋至10mg/mL，備用。

1.2.3抗氧化活性測定

1.2.3.1清除DPPH自由基能力的測定參照文獻［12］的方法，在517nm波長處測定樣品及對照品抗壞血酸（VC）對DPPH自由基的清除能力，平行測定3次，計算清除率。

1.2.3.2清除ABTS自由基參考文獻［13］的方法，稍作修改。在734nm波長處測定樣品及對照品VC對ABTS自由基的清除能力，平行測定3次，計算清除率。

1.2.3.3清除羥自由基參照文獻［14］的方法，在536nm波長處測定樣品及對照品VC對羥自由基的清除能力，平行測定3次，計算清除率。

1.2.3.4還原力測定參照文獻［15］，在700nm波長處測定樣品及對照品VC的還原能力，平行測定3次，記錄吸光值。

1.2.4抑菌性研究

1.2.4.1菌懸液的制備挑取適量菌種到50mL無菌肉湯，放置恒溫搖床培養(yǎng)，細菌在37℃培養(yǎng)24h，白色念珠球菌于28℃培養(yǎng)48h。各菌株活化后，用無菌生理鹽水稀釋并校正菌液濃度至0.5號麥氏比濁管，相當于1.5×108cfu/mL，再稀釋100倍作為上樣菌懸液，備用。

1.2.4.2最低抑菌濃度的測定參照文獻［16］，采用試管二倍稀釋法測定MIC。取10支滅菌試管，各管分別加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基1mL。在第1管中加入1mL滅菌的10mg/mL山豆根各提取物溶液，混勻后吸取1mL加入到第2管中，依此類推，直至第8管。第8管吸取1mL棄去，使其形成1∶2、1∶4、1∶8等濃度梯度。向1～8管中分別加入0.1mL菌懸液。第9管只加菌液0.1mL作為陽性對照，以觀察細菌生長情況；第10管不加菌液，作為陰性對照。重復實驗3次，將各細菌管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，白色念珠球菌管置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1抗氧化活性的測定

2.1.1清除DPPH自由基能力由圖1可知，在實驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各提取物對DPPH自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，并呈明顯的量效關(guān)系，但各提取物的清除能力都稍弱于VC。

當樣品濃度為0.1mg/mL時，4種提取物的清除DPPH自由基能力最強的是乙酸乙酯部，其清除率可達80%；而清除力最差的是乙醇部位，未達40%；氯仿和正丁醇部位能力接近，達到50%左右。

隨著濃度的增大，各提取物的清除能力也相應(yīng)增大，當濃度為0.5mg/mL時，4個部位的樣品清除能力相差很小，都達到了90%以上。說明山豆根各提取部位對DPPH自由基的清除能力較好。

圖1　樣品和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.1　Scavenging effect of sample and VCon DPPH radical

2.1.2清除ABTS自由基能力由圖2可知，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各個溶劑提取物對ABTS自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，并且其清除率（Y）與各提取部位的質(zhì)量濃度（x）呈近似線性關(guān)系，擬合直線，得到各線性方程如表1所示。

圖2　樣品和VC對ABTS自由基的清除作用Fig.2　Scavenging effect of sample and VCon ABTS radical

通常，清除自由基的活性用清除率為50%時的抗氧化劑質(zhì)量濃度（EC50）表示，EC50值與抗氧化活性呈負相關(guān)，EC50值越小，抗氧化劑清除自由基能力越強。從表1可以看出，清除率與各提取部位質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系，利用線性方程計算出氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部、乙醇部的EC50值分別為1.08、0.55、1.27、3.08mg/mL。由此可知，山豆根不同溶劑提取物清除ABTS自由基的能力依次是乙酸乙酯部＞氯仿部＞正丁醇部＞乙醇部。

表1　ABTS自由基清除率與各部位質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Table 1　The linear relationship between ABTS radical scavenging ratio and the concentration of different extracts

2.1.3清除羥自由基能力由圖3可知，在實驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各個溶劑提取物對羥自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，并呈明顯的量效關(guān)系。山豆根不同溶劑提取物清除羥自由基的能力相差比較明顯，大小順序依次是氯仿部＞乙酸乙酯部＞正丁醇部＞乙醇部。氯仿部清除羥自由基的能力遠優(yōu)于其他部位，與VC的清除能力接近；而乙醇部的清除能力很弱。將清除率（Y）與各提取部位的質(zhì)量濃度（x）關(guān)系線擬合直線，得到各線性方程如表2所示。由線性方程計算出氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部的EC50值分別為1.33、2.80、5.00mg/mL。

圖3　樣品和VC對羥自由基的清除作用Fig.3　Scavenging effect of sample and VCon hydroxyl radical

表2　羥自由基清除率與各部位質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Table 2　The linear relationship between hydroxyl radical scavenging ratio and the concentration of different extracts

山豆根各提取物均具有清除自由基的能力。胡庭俊等報道的山豆根多糖、醇提物的清除自由基的實驗中［11，17］，也得到山豆根具有清除自由基的作用的結(jié)論。在本實驗中，山豆根各提取物對DPPH自由基的清除作用最強，其次是清除ABTS自由基的能力，清除羥自由基的能力稍弱。實驗結(jié)果表明，清除DPPH自由基與清除ABTS自由基的能力的強弱順序是一致的，而清除羥自由基的能力則不盡相同?？梢?，相同極性部位的提取物，在不同的抗氧化體系中，其抗氧化能力也不同。這可能是由于山豆根提取物不同極性部位中所含抗氧化成分的種類和結(jié)構(gòu)不同，從而對不同類型的自由基具有選擇性清除作用的結(jié)果。

2.1.4還原能力測定山豆根不同溶劑提取物的還原力結(jié)果見圖4。通常，吸光值越大，還原能力就越強。由圖4可以看出，4個提取部位的吸光度值（A）與各部位的質(zhì)量濃度（x）呈明顯的量效關(guān)系，擬合直線，得到各線性方程如表3所示。令吸光值為0.5，由表3中的線性方程計算出氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部、乙醇部的EC50值分別為0.60、0.64、0.51、0.84mg/mL。從圖4可以看出，當樣品濃度較低時，山豆根各溶劑提取物的還原能力相差不大。隨著濃度的增大，各提取物還原能力逐漸增大，差距也增大。當濃度為1.0mg/mL時，還原能力大小依次是正丁醇部＞氯仿部＞乙酸乙酯部＞乙醇部，均弱于VC的還原能力。

圖4　樣品和VC的還原能力Fig.4　Reducing power of sample and VC

表3　還原能力吸光值與各部位質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Table 3　The linear relationship between reducing power and the concentration of different extracts

2.2山豆根提取物最低抑菌濃度（MIC）

表4是山豆根4種溶劑提取物對6種細菌和1種霉菌的抑制結(jié)果，MIC越低，則抑菌效果越好。從表4可以看出，山豆根各提取部位對6種常見細菌的抑制作用最強的是乙酸乙酯提取部位，尤其是對金黃色葡萄球菌，其MIC只有0.313mg/mL，而活性最差的乙醇提取物抑制金黃色葡萄球菌的MIC是5mg/mL。這結(jié)果明顯優(yōu)于胡庭俊等［11］研究的山豆根總生物堿的最小抑菌濃度62.5mg/mL，山豆根醇提物的最小抑菌濃度為31.25mg/mL。說明采用本實驗的提取方法所獲得的提取物抑制金黃色葡萄球菌的能力比山豆根總生物堿和醇提物的抑菌能力強。

其次是氯仿部位，它對普通變形桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用最強，抑制其他實驗菌的能力僅次于乙酸乙酯部位。正丁醇提取部位對這6種細菌的抑制作用都比較弱，乙醇提取部位對這6種細菌的抑制作用是4種溶劑提取物中最弱的。乙酸乙酯、氯仿提取物均能抑制白色念珠球菌，這與吳榮達等在研究山豆根水煎液對白色念珠菌的抗菌作用得到的結(jié)論吻合［18］。

表4　樣品對實驗菌的最低抑菌質(zhì)量濃度（mg/mL）Table 4　MIC of samples to the test bacteria（mg/mL）

3　結(jié)論

本實驗采用了4種體外抗氧化活性評價方法對山豆根不同溶劑提取物進行實驗篩選。結(jié)果表明，山豆根的不同溶劑提取物都具有一定的抗氧化活性，但它們的抗氧化活性差別較大，其中乙酸乙酯部位和氯仿部位抗氧化性較強，正丁醇部位和乙醇部位抗氧化性較弱。此外，在抑菌活性測試實驗中，乙酸乙酯部位和氯仿部位對7種實驗菌都顯示了一定的抑制作用，尤其是乙酸乙酯提取物表現(xiàn)了較強的抑菌性。綜合上述結(jié)果可得出山豆根乙酸乙酯提取部分和氯仿提取部分的抗氧化及抑菌活性最好，可將其作為研究重點，進一步分離有效活性成分，確定山豆根抗氧化及抑菌的化學物質(zhì)。

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Antioxidant and antibacterial activity of extracts from Sophora tonkinensis Gagnep

XU Hai-tang，LU Jian-fang，ZHAO Yan-zhi，ZHOU Ju-ying
（Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products，College of Chemistry and Chemistry Engineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006，China）

To study the antioxidant and antibacterial activity of different extracts from Sophora tonkinensis Gagnep. The chloroform，ethyl acetate，butanol and ethanol extracts were obtained by backflow-extraction.DPPH，ABTS，OH radical scavenging assays and reducing power assay were used to measure the antioxidant activity. And seven common test bacterias were employed to test the antibacterial activity in vitro.The result indicated that different extracts from Sophora tonkinensis Gagnep exhibited good antioxidant activity，especially for DPPH radical，which EC50＜0.2mg/mL.The antibacterial experiments in vitro showed that the ethyl acetate extract had the obvious antibacterial effect on the Staphylococcus aureus and the minimum inhibitory concentration was 0.313mg/mL.

Sophora tonkinensis Gagnep；extracts；antioxidant；antibacterial

TS201.2

A

1002-0306（2015）14-0111-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.013

2014－11－03

許海棠（1975-），女，碩士，高級實驗師，研究方向：藥用植物資源開發(fā)。

廣西高校科學技術(shù)研究項目（YB2014100）；廣西自然科學基金（2013GXNSFBA019035）；國家自然科學基金（51203027）。