黃曉鳳 劉海洋 郭美華 龐勤 鄒菥 楊小燕 楊成 馬驍 何黎

滇山茶、銀線草、車桑子、重樓對(duì)黑素細(xì)胞株增殖活性和酪氨酸酶影響的研究

黃曉鳳 劉海洋 郭美華 龐勤 鄒菥 楊小燕 楊成 馬驍 何黎

目的 探討滇山茶、銀線草、車桑子、重樓提取物的美白作用。方法 7種植物提取物（滇山茶枝葉提取物、滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物、滇山茶花蕾提取物、滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物、銀線草提取物、車桑子提取物、重樓提取物）分別設(shè)立10、25、50、100、200、400、800 mg/L 7個(gè)濃度作用于體外培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞株，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組和100 μg/ml熊果苷陽(yáng)性對(duì)照組。采用噻唑藍(lán)比色法測(cè)定植物提取物對(duì)黑素細(xì)胞增殖影響，體外氧化多巴反應(yīng)法測(cè)定提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響。結(jié)果 對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性的影響：400 mg/L滇山茶枝葉提取物，10～100 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物，10 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物和10～25 mg/L車桑子提取物對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性的抑制作用與100 mg/L熊果苷相當(dāng)（P＞0.05）。800 mg/L滇山茶枝葉提取物對(duì)HEM-m細(xì)胞增殖活性的抑制作用低于熊果苷（P＜0.05）。余不同濃度提取物對(duì)HEM-m細(xì)胞增殖的抑制作用均強(qiáng)于熊果苷（P＜0.05或P＜0.01）。對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響：10 mg/L滇山茶枝葉提取物，10～400 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物，50～100 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物，10～50和400 mg/L銀線草提取物，10～800mg/L車桑子提取物，10和100～200mg/L重樓提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用與100 mg/L熊果苷相當(dāng)（P＞0.05）。10～25 μg/ml滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用明顯低于熊果苷（P＜0.05）。其余不同濃度的提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性均優(yōu)于熊果苷組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 滇山茶、車桑子提取物于特定濃度時(shí)，能抑制酪氨酸酶活性。

植物提取物；黑素細(xì)胞；細(xì)胞增殖；酪氨酸酶

研究表明，天然植物有效成分除具有美白作用外，還具有安全、低毒等特性，已有學(xué)者對(duì)多種植物提取物進(jìn)行研究證實(shí)有抑制酪氨酸酶作用［1］。云南山茶花也叫滇山茶，屬于山茶科山茶屬植物，原產(chǎn)云南省。銀線草為金粟蘭科植物，民間雖已有廣泛應(yīng)用，但對(duì)銀線草的藥理學(xué)研究鮮見報(bào)道。車桑子，屬于無患子科車桑子屬，云南省紅河州、元謀等干熱河谷地區(qū)種植較多。重樓，為延齡草科重樓屬植物，云南是我國(guó)重樓最主要的產(chǎn)地之一。我們利用云南省植物資源優(yōu)勢(shì)，與中國(guó)科學(xué)院昆明植物所聯(lián)合，著眼從滇山茶的花、枝、葉，銀線草、車桑子、重樓中提取有效成分，通過作用于體外培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞株（HEM-m），與熊果苷作對(duì)比，觀察不同濃度梯度的植物提取物對(duì)細(xì)胞增殖活性、酪氨酸酶活性影響，以篩選出具有美白作用的植物提取物。

一、資料

1.細(xì)胞來源：人黑素細(xì)胞-中色（HEM-m）購(gòu)于美國(guó)Sciencell公司。

2.藥品和試劑：滇山茶提取物、銀線草提取物、車桑子提取物、重樓提取物由中國(guó)科學(xué)院昆明植物所提供。熊果苷、左旋多巴購(gòu)于北京壇墨質(zhì)檢公司，MelM基礎(chǔ)培養(yǎng)基及補(bǔ)充物、胰蛋白酶/EDTA溶液、胰蛋白酶中和溶液購(gòu)于美國(guó)Sciencell公司，噻唑藍(lán)購(gòu)于美國(guó)Biosharp公司，TritonX-100購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.實(shí)驗(yàn)儀器：倒置顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Carl Zeiss公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Biotek公司，低速自動(dòng)平衡離心機(jī)購(gòu)于長(zhǎng)沙英泰公司，CO2孵箱、超凈工作臺(tái)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

二、方法

1.植物提取物的制備：滇山茶（Camellia reticulata Lindl）枝葉提取物：干燥滇山茶枝葉和花蕾分別粉碎，75%乙醇回流提取3次（每次2小時(shí)），回收溶劑，得到枝葉提取物。取部分該提取物溶于水，經(jīng)過D101大孔樹脂柱，水洗脫，除去糖類等物質(zhì)，70%乙醇洗脫，回收溶劑，得到滇山茶枝葉和花蕾70%乙醇洗脫物。銀線草（Chloranthus japonicas Sieb）提取物：干燥銀線草全草粉碎，95%乙醇回流提取3次（每次2小時(shí)），回收溶劑。車桑子［Dodonaea viscosa（Linn.）Jacq.Enum］提取物及滇重樓 ［Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Fr.）Hand.-Mazz］提取物：干燥車桑子枝葉及滇重樓根莖粉碎，75%乙醇回流提取3次（每次2小時(shí)），回收溶劑。

2.HEM-m的培養(yǎng)：細(xì)胞凍存管放入37℃水槽復(fù)蘇，將管內(nèi)細(xì)胞重新懸浮。按5 000個(gè)細(xì)胞/cm2分配至多聚左旋賴氨酸包被T75培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱。第2天更換培養(yǎng)基以清除殘留的二甲基亞砜（DMSO）和未附壁的細(xì)胞，細(xì)胞接近50%融合前，每隔1天更換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞接近50%融合后每天更換，融合接近80%時(shí)傳代培養(yǎng)。健康的細(xì)胞呈現(xiàn)樹枝狀形態(tài)，2～3 d細(xì)胞翻倍。

3.不同植物提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響：用噻唑藍(lán)進(jìn)行測(cè)定。用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶中和液對(duì)其進(jìn)行終止，離心后用MelM培養(yǎng)基將黑素細(xì)胞稀釋成1×105個(gè)/ml，取稀釋后液體接種于96孔板100 μl/孔，接種密度為104個(gè)/孔。過夜待細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，分別加入含藥培養(yǎng)液（7種不同植物提取物的培養(yǎng)液終濃度分別為 10、25、50、100、200、400、800 mg/L，熊果苷100 mg/L）100 μl/孔，每個(gè)濃度均設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。并設(shè)立陰性對(duì)照組（黑素細(xì)胞+黑素細(xì)胞培養(yǎng)基）和空白對(duì)照組（單純黑素細(xì)胞培養(yǎng)基）。培養(yǎng)72 h，棄上清，PBS液沖洗細(xì)胞2遍，每孔加入5 mg/ml的MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清，每孔加入DMSO 100 μl，置于振蕩器上低速振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)本吸光度（A）值，測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。細(xì)胞增殖率=［（藥物組平均吸光值-空白組平均吸光值）/（陰性對(duì)照組平均吸光值-空白組平均吸光值）］×100%

4.黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的測(cè)定：按上述方法接種黑素細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板并加入含藥培養(yǎng)基作用72 h，棄上清PBS液沖洗細(xì)胞2次，分別于每孔中加入100 μl含1%TritonX-100（PBS液配置）溶液，振蕩器上低速振蕩30 min，放置于-20℃冰箱中1 h，室溫下融化，使黑素細(xì)胞完全裂解。每孔加入100 μl濃度為0.1%L多巴溶液，繼續(xù)置于37℃孵箱2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)本吸光度（A）值，測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。酪氨酸酶相對(duì)活性=［（藥物組平均吸光值-空白組平均吸光值）/（陰性對(duì)照組平均吸光值-空白組平均吸光值）］×100%。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行整理，計(jì)算均值，兩組間計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.不同植物提取物對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性的影響：與陰性對(duì)照組比較，除10 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物和10 mg/L車桑子提取物對(duì)HEM-m細(xì)胞無明顯影響外（P＞0.05），其余不同濃度植物提取物均顯示對(duì)細(xì)胞增殖活性有一定的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照組熊果苷比較，400 mg/L滇山茶枝葉提取物，10～100 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物10 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L車桑子提取物對(duì)HEM-m細(xì)胞增殖活性的抑制作用與100 mg/L熊果苷相當(dāng)（P＞0.05）。800 mg/L滇山茶枝葉提取物對(duì)HEM-m細(xì)胞增殖活性的抑制作用低于熊果苷（P＜0.05）。余不同濃度提取物對(duì)HEM-m細(xì)胞增殖的抑制作用均強(qiáng)于熊果苷（P＜0.05）。見表 1。

2.不同植物提取物對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響：與陰性對(duì)照組比較，100 mg/L熊果苷和各濃度的植物提取物對(duì)HEM-m細(xì)胞酪氨酸酶活性均具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組熊果苷比較，10 mg/L滇山茶枝葉提取物，10～400 mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物，10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物，50～100 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物，10～50和400 mg/L銀線草提取物，10～800 mg/L車桑子提取物，10和100～200 mg/L重樓提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用與100 mg/L熊果苷相當(dāng)（P＞0.05）。10～25 mg/L滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用明顯低于熊果苷（P＜0.05）。其余不同濃度的提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性均優(yōu)于熊果苷組。見表2。

表1 不同植物提取物對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性的影響（%，±s）

表1 不同植物提取物對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性的影響（%，±s）

注：n=3。a：與陰性對(duì)照組比較，P ＜ 0.05；b：與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P ＜ 0.05

組別樣品（mg/L）800 400 200 100 50 25 10熊果苷滇山茶枝葉提取物 74.82±7.60ab47.88±2.01a 7.07±4.83ab 1.67±0.57ab 6.09±0.65ab 9.11±7.65ab 12.59±7.72ab57.32±4.72a滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物10.07±1.85ab28.89±1.57ab24.34±5.39ab51.68±12.88a66.37±4.00a 66.42±14.00a 71.82±14.14 57.32±4.72a滇山茶花蕾提取物 44.25±1.36ab22.54±0.75ab 9.8±2.0ab 3.72±2.25ab18.59±9.86ab55.16±9.04a 55.64±1.84a 57.32±4.72a滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物9.59±1.85ab 0.67±0.50ab 0.07±0.03ab 2.44±1.70ab19.54±3.19ab36.81±8.41ab 34.41±10.88a57.32±4.72a銀線草提取物 7.35±4.86ab 6.60±5.87ab 1.22±0.91ab11.46±2.42ab28.34±3.63ab26.87±7.47ab 31.33±7.90ab76.79±8.01a車桑子提取物 48.43±0.51ab26.69±1.62ab28.19±4.93ab44.68±2.95ab58.32±2.56ab60.87±5.85a 76.61±15.67 76.79±8.01a重樓提取物 0.063±0.049ab0.48±0.49ab 2.84±0.62ab 4.42±0.95ab 5.23±1.21ab 2.19±1.15ab 23.91±0.72ab76.79±8.01a

表2 不同植物提取物對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響（%，±s）

表2 不同植物提取物對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響（%，±s）

注：n=3。a：與陰性對(duì)照組比較，P ＜ 0.05；b：與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P ＜ 0.05

組別樣品（mg/L）800 400 200 100 50 25 10熊果苷滇山茶枝葉提取物 4.58±0.25ab 3.73±0.96ab 0.08±0.05ab 0.18±0.04ab 1.1±0.86ab 1.1±1.25ab 12.04±2.31a 30.11±11.65a滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物2.39±1.14ab14.34±2.72a 27.40±1.49a 36.89±8.47a 44.36±6.44a 46.48±22.96a 44.36±19.82a30.11±11.65a滇山茶花蕾提取物 8.91±4.46ab 2.88±0.53ab10.00±1.4ab 7.38±4.85ab 2.59±2.61ab33.08±7.25a 45.21±3.22a 30.11±11.65a滇山茶花蕾提取物70%乙醇洗脫物5.17±1.18ab 4.16±1.62ab 2.98±1.07ab22.08±25.07a34.18±5.61a 74.13±13.12ab74.81±5.51ab30.11±11.65a銀線草提取物 5.92±0.41ab 6.90±2.55a 2.47±1.26ab 4.95±3.38ab17.68±8.80a 25.29±7.09a 29.97±13.15a41.11±21.63a車桑子提取物 22.28±1.60a 25.02±1.26a 6.90±3.53a 22.01±1.86a 29.09±4.14a 42.44±7.03a 31.83±5.18a 41.11±21.63a重樓提取物 1.41±2.14ab 5.66±1.33ab 6.54±1.06a 7.34±2.11a 5.92±1.36ab 4.07±1.53ab 6.98±2.22a 41.11±21.63a

四、討論

山茶屬（CamelliaLinn）植物屬于山茶科（Theaceae），全世界約有280余種，主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，我國(guó)有250種以上，主要產(chǎn)于西南部和東南部地區(qū)。目前韓國(guó)、日本對(duì)山茶花的花、枝、葉、果實(shí)提取物的藥理學(xué)研究較多。Nakamura等［2］研究發(fā)現(xiàn)，山茶花花蕾提取物可抑制黑素生成、促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化。山茶花提取物可通過清除人類HaCaT細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS和增強(qiáng)抗氧化酶活性達(dá)到抗氧化作用［3］，山茶花油具有抗炎活性［4］，山茶花籽油提取物通過外用可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1）活性、誘導(dǎo)一型膠原蛋白合成此外［5］，山茶花籽油還可以減少經(jīng)皮水分流失，恢復(fù)皮膚屏障［6］。國(guó)外研究大多集中在抗真菌［7］、抗炎活性［8］、抗氧化和自由基清除活性［9］等作用中。Yan 等［10］從車桑子地上部分提取出Dodoviscin A作用于B16-F10黑素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該單體提取物顯著抑制黑素瘤細(xì)胞黑素合成的同時(shí)對(duì)細(xì)胞活性無影響。

本研究表明，滇山茶枝葉提取物于800 mg/L對(duì)細(xì)胞增殖影響與抑制酪氨酸酶活性作用均優(yōu)于100 mg/L熊果苷，于400 mg/L時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖影響與熊果苷相當(dāng)，但其抑制酪氨酸酶活性作用優(yōu)于熊果苷；10～100mg/L滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物、10～25mg/L滇山茶花蕾提取物及10～25mg/L車桑子提取物對(duì)細(xì)胞增殖和酪氨酸酶活性的抑制作用均與熊果苷的作用相當(dāng)。可見上述植物提取物具有植物美白劑的應(yīng)用前景。盡管銀線草、重樓提取物抑制酪氨酸酶活性的作用顯著，但其對(duì)細(xì)胞增殖率影響過大，能否作為美白劑開發(fā)，尚待研究。

將篩選出來的滇山茶枝葉提取物、滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物、滇山茶花蕾提取物、車桑子提取物這幾個(gè)提取物間進(jìn)行組間方差分析表明：從滇山茶不同提取工藝和方法來看，滇山茶枝葉提取物美白活性優(yōu)于枝葉提取物70%乙醇洗脫物（P＜0.05）；從滇山茶不同的提取部位來看，滇山茶枝葉提取物美白活性優(yōu)于花蕾提取物（P＜0.05）。滇山茶枝葉提取物具有最強(qiáng)的美白作用，各濃度滇山茶枝葉提取物70%乙醇洗脫物、滇山茶花蕾提取物及車桑子提取物之間美白作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。國(guó)外學(xué)者雖已提取出一部分具有抑制黑素生成的化學(xué)成分，但是涉及成分少，而且這類植物種屬繁多，加至提取工藝、提取部位不同而各具功效。因此對(duì)滇山茶、車桑子在皮膚美白劑中的研發(fā)空間還很大。

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Effects ofCamellia retic ulata,Chloranthus japonicas,Dodonaea viscosaandParis polyphyllaon the proliferation of and tyrosinase activity in a melanocyte cell line

Huang Xiaofeng*,Liu Haiyang,Guo Meihua,Pang Qin,Zou Xi,Yang Xiaoyan,Yang Cheng,Ma Xiao,He Li.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University;Innovation Team of Ministry of Education,Collaborative Innovation Center of Yunnan Province;Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province,Kunming 650000,China

ObjectiveTo estimate the whitening effect of extracts ofCamellia reticulata,Chloranthus japonicas,Dodonaea viscosaandParis polyphylla.MethodsA human epidermal melanocyte cell line HEM-m was culturedin vitro,and classified into several groups to be treated with 7 concentrations（10,25,50,100,200,400,800 mg/L）of different plant extracts,includingCamellia reticulataleaf extract,70%ethanol-eluted fraction ofCamellia reticulataleaf extract,extract ofCamellia reticulataalabastrum,70%ethanol-eluted fraction of extract ofCamellia reticulata alabastrum,Chloranthus japonicasextract,Dodonaea viscosaextract,andParis polyphyllaextract.At the same time,the negative control group,blank control group and positive control group（treated with 100 mg/L arbutin）were set up.After 72 hours of treatment,MTT assay was performed to detect cell proliferation,and dopa-oxidation assay to estimate tyrosinase activity in melanocytes.ResultsAs far as the inhibitory effect on the proliferation of HEM-m cells was concerned,400 mg/LCamellia reticulataleaf extract,70%ethanol-eluted fraction ofCamellia reticulataleaf extract at 10－100 mg/L,extract ofCamellia reticulataalabastrum at 10－25 mg/L,70%ethanol-eluted fraction of extract of Camellia reticulataalabastrum at 10 mg/L andDodonaea viscosaextract at 10－25 mg/L were equivalent to（allP＞0.05）,800 mg/LCamellia reticulataleaf extract was significantly weaker than （P ＜ 0.05）,while the other concentrations of these plant extracts were significantly stronger than （P＜0.05 or 0.01）,100 mg/L arbutin.In the case of inhibitory effect on tyrosinase activity,100 mg/L arbutin was similar to 10 mg/LCamellia reticulataleaf extract,70%ethanol-eluted fraction ofCamellia reticulataleaf extract at 10－400 mg/L,extract ofCamellia reticulataalabastrum at 10－25 mg/L,70%ethanol-eluted fraction of extract ofCamellia reticulataalabastrum at 50－100 mg/L,Chloranthus japonicasextract at 10－50 mg/L and 400 mg/L,Dodonaea viscosaextract at 10－800 mg/L andParis polyphyllaextract at 10 and 100－200 mg/L（allP＞0.05）,stronger than 70%ethanol-eluted fraction of extract ofCamellia reticulataalabastrum at 10－25 mg/L （P＜0.05）,but weaker than the other concentrations of these plant extracts（P＜0.05 or 0.01）.ConclusionSpecial concentrations ofCamellia reticulateandDodonaea viscosecan inhibit tyrosinase activity.

Plant extracts;Melanocytes;Cell proliferation;Tyrosinase

He Li,Email:drheli2662@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.019

650000昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科、教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)、云南省協(xié)同創(chuàng)新中心、云南省工程技術(shù)研究中心（黃曉鳳、郭美華、何黎）；中國(guó)科學(xué)院昆明植物所（劉海洋）；云南薇諾娜皮膚醫(yī)療美容中心（龐勤、鄒菥、楊小燕、楊成）；昆明貝泰妮生物科技有限公司（馬驍）

何黎，Email：drheli2662@126.com

2014-05-23）

（本文編輯：吳曉初）