張明海 戴前梅 胡春艷 陳晨 陳朋

·論著·

慢性蕁麻疹患者外周血白細(xì)胞介素9和轉(zhuǎn)錄因子PU.1的表達(dá)及意義

張明海 戴前梅 胡春艷 陳晨 陳朋

目的 探討白細(xì)胞介素9（IL-9）和Th9細(xì)胞與慢性蕁麻疹的關(guān)系。方法 收集門診慢性蕁麻疹患者30例，另30例健康志愿者作為對照組。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測外周血IgE水平，流式細(xì)胞儀檢測外周血CD4+IL-9+細(xì)胞比例，實(shí)時熒光定量PCR檢測外周血單一核細(xì)胞（PBMC）IL-9、PU.1 mRNA的表達(dá)。兩組間定量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson分析。結(jié)果 慢性蕁麻疹患者PBMC IL-9及PU.1 mRNA的表達(dá)水平均顯著高于健康對照組（4.44±1.90比3.20±1.78，3.26±1.59比2.34±1.47，t=2.60，2.34，均 P ＜ 0.05）。慢性蕁麻疹患者外周血 CD4+IL-9+細(xì)胞比例 ［（0.63 ± 0.44）%］、IgE 水平［（82.04± 31.72）IU/ml］與健康對照組［（0.22± 0.12）%、（60.74± 28.26）IU/ml］比較均明顯升高（t=5.04，2.75，均P＜0.01）。慢性蕁麻疹患者外周血CD4+IL-9+細(xì)胞比例、IL-9及PU.1 mRNA與IgE水平均呈正相關(guān)（R=0.596，0.767，0.746，均P＜0.01）。結(jié)論 Th9細(xì)胞和IL-9可能參與慢性蕁麻疹的發(fā)病。

蕁麻疹；白細(xì)胞介素9；Th9細(xì)胞

既往認(rèn)為白細(xì)胞介素9（IL-9）主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生。最近研究表明，IL-9主要來源于新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群即Th9細(xì)胞，并且人Th9細(xì)胞只特異性分泌 IL-9［1］。PU.1 即 PU.1 boxes是 Ets家族中最重要的轉(zhuǎn)錄因子，因其能結(jié)合富含嘌呤的GAGGAA序列而得名，是Th9細(xì)胞分化及IL-9介導(dǎo)過敏反應(yīng)的重要且必需的轉(zhuǎn)錄因子［2］。最近研究表明，記憶性Th9細(xì)胞主要定居于皮膚，能自分泌或旁分泌促炎癥細(xì)胞因子，其異常激活會導(dǎo)致過敏性皮膚病的發(fā)生［1，3］。國內(nèi)關(guān)于Th9細(xì)胞與慢性蕁麻疹的發(fā)病關(guān)系未見報道。本研究通過檢測慢性蕁麻疹患者的外周血Th9細(xì)胞IL-9及其轉(zhuǎn)錄因子PU.1的表達(dá)水平，探討Th9細(xì)胞是否參與慢性蕁麻疹的發(fā)病。

對象與方法

一、對象

1．對象：我院皮膚科門診慢性蕁麻疹患者30例，男11例，女19例，年齡15～51歲，平均（30.9±9.1）歲；對照組為健康獻(xiàn)血者30例，男13例，女17例，年齡 18～46歲,平均（26.5±9.4）歲。兩組間年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。

2.入選和排除標(biāo)準(zhǔn)：入選標(biāo)準(zhǔn)：①風(fēng)團(tuán)每天發(fā)作且持續(xù)時間超過6周；②年齡＞12歲；③無明顯的誘發(fā)原因如，食物、藥物、運(yùn)動；④發(fā)病無規(guī)律。排除標(biāo)準(zhǔn)：①風(fēng)團(tuán)持續(xù)時間超過24 h；②有明顯的誘因如，人工劃痕癥、膽堿能性蕁麻疹、水源性蕁麻疹，日光性蕁麻疹等；③過去1個月內(nèi)系統(tǒng)使用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等；④過去3 d用過抗組胺藥；⑤合并其他皮膚病、系統(tǒng)性疾病、感染性疾病等。

二、方法

1.主要試劑和儀器：人IgE ELISA試劑盒產(chǎn)自上海博谷生物科技有限公司；固定和改變細(xì)胞膜滲透性試劑盒（FIX＆PERM Cell Permeabilization Kit）、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鼠抗人CD4單克隆抗體、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的鼠抗人IL-9單克隆抗體、相應(yīng)熒光素標(biāo)記的同種型對照抗體均產(chǎn)自美國eBioscience公司。佛波酯（Phorbol myfismte acetate，PMA）、離子霉素（ionomycin）、布雷桿菌素 A（Brefeldin A，BFA） 工作液產(chǎn)自瑞士 Enzo Life Sciences公司。TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)自寶生物（大連）有限公司。WD-9417A型酶標(biāo)儀產(chǎn)自北京澤蘭西科技有限公司；流式細(xì)胞儀產(chǎn)自德國Partec公司；熒光定量PCR儀產(chǎn)自日本Bioer公司。

2.標(biāo)本采集：抽取所有受試者靜脈血5 ml。1 ml放入無添加劑采血管，2 ml放入肝素抗凝采血管；2 ml放入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管。

3.Th9細(xì)胞比例測定：取肝素抗凝血，F(xiàn)icoll密度梯度法提取單一核細(xì)胞（PBMC），取PBMC懸液與 100 μl 10%胎牛血清（FBS）RPMI1640 ml培養(yǎng)基混勻。在培養(yǎng)體系中加入佛波酯、離子霉素、布雷桿菌素A工作液，使其終濃度分別為50 μg/L、1 mg/L和0.4 μmol/L。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)4 h。取培養(yǎng)PBMC 100 ml，放入已標(biāo)記的流式細(xì)胞儀檢測專用管中，分別加入FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體 10 μl，設(shè)同型對照，4℃避光孵育 20 min。加入Cytofix/Cytoperm緩沖液100 μl，4℃避光孵育30 min。加入 Cytoperm Plus緩沖液 100 μl，600 ×g離心5 min，棄上清，重復(fù)本步驟一遍。向殘留物加入PE標(biāo)記的鼠抗人IL-9單克隆抗體2.5 μl，設(shè)同型對照，4℃避光孵育30 min。加入1 ml PBS，600×g離心5 min，棄上清，重復(fù)本步驟一遍。用1 ml PBS重懸，流式細(xì)胞儀分析，以CD4+細(xì)胞設(shè)門，計算CD4+IL-9+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例。

4.IL-9 mRNA和PU.1 mRNA檢測：取EDTA抗凝血，F(xiàn)icoll密度梯度法提取PBMC。Trizol法常規(guī)提取總RNA。按照TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將2 μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RTFQ PCR反應(yīng)的引物及探針由生工生物（上海）股份有限公司設(shè)計和合成。IL-9引物及探針：上游5′-CCTGGACATCAAC TTCCTCATCA-3′，下游 5′-TCAGAGGGAATGCCCA AACA-3′，探針 5′-FAM-AAGATGCAGGAAGATCBHQ1-3′；PU.1 引物及探針：上游 5′-ACGCCAAAC GCACGAGTATT-3′，下游 5′-GTCCCAGTAATGGTC GCTATGG-3′，探針 5′-FAM-CCCTATCTCAGCAGT GAT-BHQ1-3′；β肌動蛋白引物及探針：上游5′-C CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游 5′-CGCCGATC CACACGGAGTA-3′，探針 5′-FAM-TCAAGATCATT GCTCCTCCTGAGCGCAA-BHQ1-3′。反應(yīng)體系20μl Realtime mix 10 μl，上游1 μl（5 μmol/L），下游1 μl（5 μmol/L），探針1 μl（2.5 μmol/L），cDNA 2 μl，重蒸水 5 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s 45個循環(huán)，采用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量，△△Ct=△Ct目的-△Ct管家。

5.血清IgE測定嚴(yán)格按人免疫球蛋白E（IgE）ELISA試劑盒說明書操作，全自動酶標(biāo)儀450 nm波長依序測量標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的吸光度（A值），最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本相應(yīng)的濃度。

6.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

結(jié) 果

一、CD4+IL-9+細(xì)胞比例

慢性蕁麻疹患者外周血CD4+IL-9+細(xì)胞比例明顯高于健康對照組，見圖1。兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

二、Th9細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)水平

慢性蕁麻疹患者組PBMC IL-9 mRNA、PU.1 mRNA表達(dá)水平均高于對照組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

三、相關(guān)性分析

圖1 流式細(xì)胞儀檢測外周血CD4+IL-9+細(xì)胞比例 1A：患者；1B：健康對照

表1 兩組外周血CD4+IL-9+細(xì)胞比例、IL-9 mRNA、PU.1 mRNA表達(dá)水平（±s）

表1 兩組外周血CD4+IL-9+細(xì)胞比例、IL-9 mRNA、PU.1 mRNA表達(dá)水平（±s）

組別 例數(shù) CD4+IL-9+細(xì)胞（%） IL-9 mRNA PU.1 mRNA IgE（IU/ml）慢性蕁麻疹組 30 0.63±0.44 4.44±1.90 3.26±1.59 82.04±31.72健康對照組 30 0.22±0.12 3.20±1.78 2.34±1.47 60.74±28.26 t值 5.04 2.60 2.34 2.75 P值 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01

慢性蕁麻疹患者血清IgE水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.75，P＜ 0.01），且患者CD4+IL-9+細(xì)胞比例、IL-9 mRNA、PU.1 mRNA 與IgE 水平呈正相關(guān)，r值分別為 0.596、0.767、0.746，r2分別為 0.355、0.589、0.557，均P＜ 0.01。

討 論

目前認(rèn)為I型變態(tài)反應(yīng)是慢性蕁麻疹主要發(fā)病機(jī)制之一。I型變態(tài)反應(yīng)由IgE介導(dǎo)，肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞以釋放生物活性介質(zhì)的方式參與反應(yīng)。IgE的產(chǎn)生涉及Th2細(xì)胞的分化和IgE類別轉(zhuǎn)換。Th9細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，使人們對Th2的在過敏性疾病中的作用有了新的認(rèn)識。Th9細(xì)胞和Th2細(xì)胞的分化都需要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）和GATA結(jié)合蛋白3（GATA-3）的調(diào)控，因此Th9與Th2細(xì)胞可能存在共同的分化通路，并在一定條件下相互轉(zhuǎn)化［4］。研究表明，PU.1在Th9細(xì)胞分化中起著重要的作用，并調(diào)控IL-9，參與過敏性炎癥的發(fā)生和發(fā)展［2］。Th9細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞因子IL-9能夠提高肥大細(xì)胞的生存和功能，增加IL-4誘導(dǎo)IgE的產(chǎn)量，IL-9單獨(dú)或與干細(xì)胞因子或與FcεRI結(jié)合能夠提高培養(yǎng)的肥大細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，并刺激上皮細(xì)胞表達(dá)或產(chǎn)生趨化細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的浸潤［1］；IL-9還能增加腸道肥大細(xì)胞數(shù)量，參與食物過敏的病理過程［5］。因此，我們猜測Th9細(xì)胞可能與Th2細(xì)胞共同參與I型變態(tài)反應(yīng)，并與蕁麻疹發(fā)病有關(guān)。

目前關(guān)于慢性蕁麻疹患者外周血免疫細(xì)胞相關(guān)炎性介質(zhì)如組胺、IL-6、IL-18、IL-31等的研究報道不一。有研究表明，慢性蕁麻疹患者外周血組胺、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-6、IL-18、IL-31等明顯高于對照組［6-9］。也有研究顯示，慢性蕁麻疹患者外周血組胺、TNF、IL-6、IL-18、IL-31、IL-9 等并不升高［10-11］。蕁麻疹的發(fā)病往往呈間斷性、短暫性、此起彼伏，病情不穩(wěn)定，患者數(shù)分鐘就有可能癥狀完全消失。同時有的天然細(xì)胞因子半衰期很短，如組胺半衰期一般為30 min，而IL半衰期可能更短，有的只有幾分鐘［12］。以上原因易造成實(shí)驗(yàn)時間差，可能是引起研究差異的部分因素。本研究結(jié)果表明，慢性蕁麻疹患者組外周血CD4+IL-9+細(xì)胞比例、PBMC表達(dá)的IL-9及PU.1 mRNA均高于健康，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P分別＜0.01，＜0.05，＜0.05），支持Th9細(xì)胞參與慢性蕁麻疹的發(fā)病過程。但慢性蕁麻疹病發(fā)病過程中存在多種免疫細(xì)胞失衡現(xiàn)象［13-14］，因此Th9細(xì)胞在慢性蕁麻疹發(fā)病中充當(dāng)何種角色，仍需研究。本研究結(jié)果表明，慢性蕁麻疹患者外周血IgE水平高于健康，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與既往研究一致［6，15］。慢性蕁麻疹患者外周血CD4+IL-9+細(xì)胞比例、PBMCIL-9 mRNA及PU.1 mRNA水平均與血清IgE濃度呈正相關(guān)，提示慢性蕁麻疹患者外周血IgE水平的高低與Th9細(xì)胞異?？赡苡嘘P(guān)。重癥過敏患者血清IgE水平可增加1 000倍，特異性IgE一旦產(chǎn)生，即與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面FcεRI結(jié)合，調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面FcεRI表達(dá)，只有與肥大細(xì)胞表面FcεRIα結(jié)合的IgE與相應(yīng)特異性抗原結(jié)合才能激發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，而血清IgE還沒有與肥大細(xì)胞FcεRIα結(jié)合，因此慢性蕁麻疹患者血清IgE升高機(jī)制以及其在慢性蕁麻疹發(fā)病中的作用仍需深入研究。

總之，本研究結(jié)果表明，Th9細(xì)胞及IL-9可能在慢性蕁麻疹發(fā)病過程中起作用。因此，IL-9有可能成為慢性蕁麻疹免疫學(xué)治療另一個新的靶點(diǎn)。由于慢性蕁麻疹患者存在多種免疫細(xì)胞異常，因此需要深入研究Th9細(xì)胞與其他CD4+T細(xì)胞亞群如Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞在慢性蕁麻疹發(fā)病過程中的相互關(guān)系。

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2015年英夫利西單抗（類克?）臨床應(yīng)用有獎?wù)魑耐ㄖ?/p>

銀屑病是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，其患病率呈上升趨勢，估計中國至少有600萬銀屑病患者。隨著科學(xué)的進(jìn)步和對疾病的認(rèn)識，生物制劑已經(jīng)成為治療銀屑病的新選擇。為了促進(jìn)皮膚科醫(yī)師對生物制劑的認(rèn)識和交流，西安楊森制藥有限公司與中華皮膚科雜志編輯部聯(lián)合舉辦英夫利西單抗（類克?）臨床應(yīng)用有獎?wù)魑幕顒印?014年征文收到數(shù)十篇高質(zhì)量的文章，將擇優(yōu)刊登在中華皮膚科雜志上。本次征文活動得到皮膚科醫(yī)師的歡迎，因此，從2015年繼續(xù)進(jìn)行有獎?wù)魑幕顒?，旨在與皮膚科醫(yī)生攜手，交流生物制劑治療銀屑病的經(jīng)驗(yàn)，共同促進(jìn)銀屑病治療的發(fā)展。

一、征文范圍：英夫利西單抗治療重度斑塊型銀屑病的圖片和內(nèi)容展示。

二、征文要求：①未在公開出版的雜志上發(fā)表，未在全國性學(xué)術(shù)會議上交流；②應(yīng)征論文寫作格式請參考中華皮膚科雜志稿約要求；③至少提供患者3組照片，治療前、2周、6周的照片；④請注明第一作者姓名、單位、職稱、地址、郵編、電子郵箱以及聯(lián)系電話；⑤只接受電子郵箱投稿（Word排版），征文電子版發(fā)至郵箱beauty_life2014@163.com，并注明“美麗人生征文”字樣。所有征文恕不退稿，請自留底稿。征文截稿時間：2015年9月30日。

三、評選方法和獎項(xiàng)設(shè)置：由知名專家及相關(guān)專業(yè)專家組成評審委員會，對征文稿件進(jìn)行評審。獎項(xiàng)設(shè)置：獲前10名文章作者資助第一作者參加2016年中華醫(yī)學(xué)會皮膚性病學(xué)學(xué)術(shù)年會；其余參與投稿第一作者，均贈閱中華皮膚科雜志2016年全年雜志。

英夫利西單抗（類克?）臨床應(yīng)用有獎?wù)魑慕視?/p>

為了促進(jìn)皮膚科醫(yī)師對生物制劑的認(rèn)識，西安楊森制藥有限公司與中華皮膚科雜志編輯部在2014年聯(lián)合舉辦“英夫利西單抗（類克?）臨床應(yīng)用有獎?wù)魑摹被顒?，共收到征文?shù)十篇。經(jīng)專家組評審，最終評出一等獎3名，二等獎9名?，F(xiàn)將獲獎名單公布如下。一等獎：英夫利西單抗治療重度銀屑病17例臨床觀察（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院朱晨雨等）；英夫利西單抗治療重度尋常性銀屑病的療效及對代謝綜合征和動脈粥樣硬化生化指標(biāo)的影響：7例報告及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院皮膚科張?zhí)玫碌龋活惪顺晒χ委熞焕龂?yán)重急性進(jìn)行期銀屑病患者（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院陳敏等）二等獎：英夫利西單抗治療重度斑塊狀銀屑病一例（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院吳超等）；英夫利西單抗治療紅皮病性銀屑病一例（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院皮膚科劉倫飛等）；英夫利西單抗治療重度斑塊狀銀屑病一例（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院皮膚科陳積愫等）；英夫利西單抗治療斑塊狀銀屑病一例（中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院皮膚科陸東慶等）；類克治療斑塊狀銀屑病一例（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科陶娟等）；英夫利西單抗治療關(guān)節(jié)病性銀屑病一例（廣東省皮膚病醫(yī)院王曉華等）；英夫利西單抗治療膿皰性銀屑病一例（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科梁燕華）；英夫利西單抗治療尋常性銀屑病一例（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科楊瑤）；英夫利西單抗治療尋常性銀屑病一例（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科劉清秀）。

Expressions of interleukin-9 and the transcription factor PU.1 in peripheral blood of patients with chronic urticaria and their significance

Zhang Minghai,Dai Qianmei,Hu Chunyan,Chen Chen,Chen Peng.Department of Dermatology,Anhui No.2 Provincial People′s Hospital,Hefei 230000,China

ObjectiveTo investigate the relationship of interleukin-9（IL-9）and the transcription factor PU.1 with chronic urticaria.MethodsThirty patients with chronic urticaria （patient group）and 30 healthy volunteers（control group）were included in this study.Venous blood samples were collected from these subjects.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect serum levels of IgE,flow cytometry（FCM）to determine the percentage of CD4+IL-9+T cells,real-time fluorescence-based quantitative PCR （RTFQ-PCR）to measure the mRNA expressions of IL-9 and PU.1 in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）.Measurement data were compared between the two groups by independent-samplesttest,and relationship among these parameters was assessed by Pearson correlation analysis.ResultsThe expressions of IL-9 and PU.1 mRNAs in patients with chronic urticaria were significantly higher than those in healthy controls（4.44±1.90 vs.3.20±1.78,t=2.60,P＜0.05;3.26±1.59 vs.2.34±1.47,t=2.34,P ＜ 0.05）.Compared with the control group,the patient group showed increased percentage of CD4+IL-9+T cells in peripheral blood（0.63%±0.44%vs.0.22%±0.12%,t=5.04,P＜0.01）and serum IgE levels（（82.04±31.72）vs.（60.74 ± 28.26）IU/ml,t=2.75,P ＜ 0.01）.The percentage of CD4+IL-9+T cells and levels of IL-9 and PU.1 mRNAs in peripheral blood were all positively correlated with serum levels of IgE in these patients（r=0.596,0.767,0.746,respectively,allP ＜ 0.01）.ConclusionT helper type 9 （Th9）cells and IL-9 may take part in the occurrence of chronic urticaria.

Urticaria;Interleukin-9;Th9 cells

Zhang Minghai,Email:minghai77@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.012

230000合肥，安徽省第二人民醫(yī)院皮膚科

張明海，Email：minghai77@sina.com

2014-01-22）

（本文編輯：尚淑賢）