李情 祝逸平 許愛娥

茶多酚、吡美莫司、他克莫司外用對莫諾苯宗誘導(dǎo)白癜風(fēng)樣模型小鼠的療效比較

李情 祝逸平 許愛娥

目的 探討茶多酚、吡美莫司、他克莫司對莫諾苯宗誘導(dǎo)的白癜風(fēng)樣模型小鼠的療效差異。方法 45%莫諾苯宗誘導(dǎo)C57BL/6三周齡雌小鼠脫色，建立白癜風(fēng)樣動(dòng)物模型。并研究他克莫司、吡美莫司、茶多酚對白癜風(fēng)樣模型小鼠脫色的治療效果。通過肉眼觀察毛發(fā)脫色及脫色面積，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取非用藥部位脫色皮膚行組織學(xué)檢查，HE染色檢測淋巴細(xì)胞浸潤情況，共聚焦激光掃描顯微鏡（RCM）觀察小鼠皮膚的黑素和黑素細(xì)胞，免疫熒光檢測CD8+T細(xì)胞。結(jié)果 模型組小鼠在用藥部位及非用藥部位均有脫色現(xiàn)象。他克莫司組、吡美莫司組、茶多酚組小鼠脫色減少，出現(xiàn)時(shí)間晚和面積指數(shù)均較模型組低；且用藥部位脫色斑局部淋巴細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤減少。其中他克莫司組療效優(yōu)于其他組。結(jié)論 他克莫司、吡美莫司、茶多酚對白癜風(fēng)樣模型小鼠均有療效。

莫諾苯宗；茶多酚；他克莫司；吡美莫司；白癜風(fēng)，動(dòng)物模型

目前，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑他克莫司和吡美莫司已在臨床廣泛應(yīng)用，對特應(yīng)性皮炎（AD）、白癜風(fēng)均有療效。針對白癜風(fēng)的氧化應(yīng)激發(fā)病學(xué)說，可開發(fā)抗氧化劑治療白癜風(fēng)，其中茶多酚是一種天然的抗氧化劑，有抗菌、清除自由基作用。本實(shí)驗(yàn)用他克莫司、吡美莫司作為陽性對照，比較他克莫司、吡美莫司、茶多酚對莫諾苯宗誘導(dǎo)的白癜風(fēng)樣模型小鼠的治療作用，以便臨床篩選藥物。

資料與方法

一、材料

1.動(dòng)物來源：C57BL/6小鼠，雌性，質(zhì)量（14 ± 2）g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號SCXK滬2007-0005），在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

2.主要試劑和儀器：莫諾苯宗（美國Sigma公司）由本院制劑室制備成45%乳膏，0.03%他克莫司購于安斯泰來制藥（中國）有限公司，1%吡美莫司乳膏購于諾華制藥（中國）有限公司，10%茶多酚購于美國Sigma公司，由本院制劑室制備成10%軟膏。皮膚共聚焦激光掃描顯微鏡（RCM）Vivascope1500購于美國Lucid公司，波長830 nm，最大輸出16.0 mW，免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）Fluo View FV1000型購于日本Olympus公司，波長488 nm。

二、方法

1.建立白癜風(fēng)樣模型并分組［1-2］：C57BL/6 小鼠25只，依次編號后用隨機(jī)數(shù)字表分組，25只小鼠隨機(jī)分為陰性對照組、模型組、茶多酚組、吡美莫司組和他克莫司組共5個(gè)組，每組5只，脫去小鼠背部2 cm×2 cm區(qū)域黑色毛，用刮勺稍用力涂藥直至吸收。陰性對照組：每天涂抹凡士林50 mg 1次；模型組：每天涂抹45%莫諾苯宗50 mg 1次；茶多酚組：每天涂抹茶多酚50 mg 1次和45%莫諾苯宗50 mg 1次；吡美莫司組：每天涂抹吡美莫司50 mg 2次和45%莫諾苯宗50 mg 1次；他克莫司組：每天涂抹他克莫司50 mg 2次和45%莫諾苯宗50 mg 1次。各組小鼠連續(xù)用藥40 d，停藥后連續(xù)15 d肉眼觀察小鼠毛發(fā)顏色和脫色面積變化，通過RCM觀察皮膚黑素顆粒。

2.毛發(fā)脫色評估［3］：每日肉眼觀察毛發(fā)脫色情況，并記錄積分。將脫色部位分為用藥部位和非用藥部位，每個(gè)部位總分為5分，每只小鼠共10分。小鼠毛發(fā)脫色評分標(biāo)準(zhǔn)：0分為毛發(fā)無脫色；1分為毛發(fā)脫色面積0～10%；2分為毛發(fā)脫色面積11%～25%；3分為毛發(fā)脫色面積26%～50%；4分為毛發(fā)脫色面積26%～75%：5分為毛發(fā)脫色面積76%～100%。

3.組織病理：模型組在背部白斑處取皮，對照組在正常處取皮，筋膜以上組織必須新鮮，即處死后立刻進(jìn)行。脫毛后，鑷子夾起，剪下組織，放入福爾馬林中按常規(guī)制備切片，行HE染色。

4.免疫熒光：檢測CD8+T細(xì)胞的熒光定量表達(dá)，采用單一綠色熒光通道觀察，在488 nm波長以上掃描觀察。觀察并由計(jì)算機(jī)自帶掃描分析軟件測定，每張切片選取熒光表達(dá)最強(qiáng)的5個(gè)視野（×200）中單位面積CD8+T細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

5.皮膚CT：應(yīng)用RCM實(shí)時(shí)觀察建模前后小鼠正常區(qū)和脫色區(qū)皮膚處在同一層面的皮膚內(nèi)黑素細(xì)胞。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS軟件17.0進(jìn)行分析，測定結(jié)果以±s表示，兩組間定量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組小鼠脫色時(shí)間比較

模型組：用藥部位在實(shí)驗(yàn)第14天開始出現(xiàn)點(diǎn)狀脫色，第16天全部小鼠的用藥部位出現(xiàn)脫色且脫色斑逐漸擴(kuò)大，第21～23天形成斑片狀，用藥40 d時(shí)，皮損擴(kuò)大并部分融合；軀干的非用藥部位在實(shí)驗(yàn)第23天出現(xiàn)脫色斑，第40天有3只小鼠在軀干部位有脫色斑（圖1箭頭）。停藥后連續(xù)15 d觀察小鼠毛發(fā)脫色部位的顏色和面積變化。結(jié)果顯示，4只小鼠脫色斑穩(wěn)定，僅1只小鼠有少量復(fù)色，2只小鼠非用藥部位的脫色斑擴(kuò)大。陰性對照組：涂抹凡士林40 d，未出現(xiàn)脫色斑（圖2）。茶多酚組、吡美莫司組和他克莫司組脫色的發(fā)生率較模型組降低，開始脫色時(shí)間推遲，非用藥部位出現(xiàn)脫色斑的時(shí)間和平均時(shí)間均延遲。見表1。

圖1 模型組小鼠用藥部位脫色斑（箭頭），軀干可見大量脫色斑塊

圖2 陰性對照組小鼠未見脫色斑（箭頭）

二、組織病理

HE染色顯示，模型組脫色斑及其周圍皮膚的真皮淺層有淋巴細(xì)胞浸潤（圖3A），陰性對照組僅有少量淋巴細(xì)胞浸潤（圖3B）；免疫熒光顯示模型組脫色斑及其周圍皮膚的CD8+T細(xì)胞浸潤（圖4A），陰性對照組（4B）極少量CD8+T細(xì)胞浸潤；皮膚CT顯示模型組小鼠非用藥部位的脫色斑可見色素缺失（圖5A），折光弱；陰性對照小鼠正常皮膚色素正常，分布均勻，折光強(qiáng)（5B）。

圖3 模型組（3A）顯示真皮淺層淋巴細(xì)胞多量浸潤圖；陰性對照組（3B）真皮淺層淋巴細(xì)胞浸潤少（HE×400）

圖4 CD8+T細(xì)胞浸潤的情況 模型組小鼠（4A）在真皮淺層CD8+T細(xì)胞浸潤（箭頭）；陰性對照組小鼠（4B）在真皮淺層幾乎無CD8+T細(xì)胞浸潤（箭頭）

圖5 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察小鼠黑素及黑素細(xì)胞 模型組小鼠（5A）非用藥部位的脫色斑可見色素缺失，折光弱；陰性對照小鼠（5B）正常皮膚色素正常，且分布均勻，折光強(qiáng)

表1 各組小鼠脫色時(shí)間比較（d）

三、脫色面積指數(shù)、穩(wěn)定性和CD8+T細(xì)胞表達(dá)

茶多酚組、吡美莫司組和他克莫司組小鼠的脫色面積均較模型組?。≒<0.05），在非用藥部位脫色面積差異更明顯（P<0.05）。停藥后15 d內(nèi)模型組中有1只小鼠出現(xiàn)少量復(fù)色，他克莫司組3只小鼠有不同程度復(fù)色，吡美莫司組有2只，茶多酚組也有2只小鼠出現(xiàn)復(fù)色跡象，他克莫司、吡美莫司、茶多酚這3組小鼠均未出現(xiàn)擴(kuò)大現(xiàn)象。模型組表達(dá)CD8+T細(xì)胞明顯，茶多酚、吡美莫司組在綠色背景中可見少量高亮CD8+T細(xì)胞；茶多酚組、吡美莫司組和他克莫司組CD8+T細(xì)胞表達(dá)量與模型組比均較低（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吡美莫司、茶多酚組CD8+T細(xì)胞表達(dá)量相比P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。茶多酚、模型組CD8+T細(xì)胞表達(dá)量相比P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組小鼠脫色面積指數(shù)CD8+T細(xì)胞表達(dá)量差異（±s）

表2 各組小鼠脫色面積指數(shù)CD8+T細(xì)胞表達(dá)量差異（±s）

注：n=5。a：以上3個(gè)組用藥部位、非用藥部位脫色面積、CD8+T細(xì)胞表達(dá)與模型組比較，P<0.05

組別 用藥部位 非用藥部位 CD8+T細(xì)胞表達(dá)量茶多酚組 2.11±0.35 1.03±0.46 178.486±9.373吡美莫司組 2.37±0.39 1.45±0.29 168.237±9.891他克莫司組 2.49±0.58 1.58±0.28 97.469±8.365模型組 3.37±0.16a 1.73±0.33a 287.545±9.034a陰性對照組 - - 59.934±3.236

討 論

CD8+T細(xì)胞可能是白癜風(fēng)自身免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，CD8+T介導(dǎo)細(xì)胞間免疫反應(yīng)，通過釋放顆粒酶特異殺傷黑素細(xì)胞［4］。莫諾苯宗對酪氨酸酶的泛素化作用可以直接誘導(dǎo)CD8+T的反應(yīng)，從而殺滅黑素細(xì)胞，引起皮膚脫色［5］。模型組小鼠局部皮損處CD8+T浸潤增加，可能由于莫諾苯宗通過黑素小體自噬作用和酪氨酸酶的泛素化作用，提呈黑素小體相關(guān)抗原并在表面產(chǎn)生MHCⅠ和Ⅱ分子，直接誘導(dǎo)CD8+T和CD4+T反應(yīng)［6］。模型組血清中IL-6和TNF-α的含量明顯高于正常組，這與人白癜風(fēng)的自身免疫反應(yīng)符合［7-8］。

茶多酚可以通過抗氧化作用治療白癜風(fēng)［9］。它可以對抗CD8+T殺傷黑素細(xì)胞［6］，其機(jī)制可能是通過降低TNF-α的分泌治療白癜風(fēng)［10］。非節(jié)段型白癜風(fēng)發(fā)病的主要機(jī)制可能為CD8+T細(xì)胞對黑素細(xì)胞的殺傷作用［11］。茶多酚有效成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯可以上調(diào)水通道蛋白3A的表達(dá)，增強(qiáng)皮膚屏障功能［12］。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察10%茶多酚軟膏對莫諾苯宗誘導(dǎo)小鼠脫色的影響，以吡美莫司和他克莫司組作為陽性對照，結(jié)果顯示茶多酚、吡美莫司和他克莫司組均有治療效果，他克莫司組療效更明顯，主要表現(xiàn)在開始出現(xiàn)脫色斑時(shí)間遲，面積小，非用藥部位脫色斑的發(fā)生率降低及復(fù)色現(xiàn)象明顯。茶多酚組亦有療效，脫色斑出現(xiàn)時(shí)間、脫色指數(shù)均較模型組低，真皮淺層淋巴細(xì)胞浸潤較模型組少。停藥后15 d內(nèi)，茶多酚組有2只小鼠出現(xiàn)復(fù)色跡象，吡美莫司組2只小鼠有復(fù)色跡象，他克莫司3只小鼠出現(xiàn)不同程度復(fù)色，這3組小鼠均沒有出現(xiàn)擴(kuò)大現(xiàn)象。茶多酚組、吡美莫司組和他克莫司組脫色的發(fā)生比例和開始脫色時(shí)間較模型組明顯推遲，非用藥部位出現(xiàn)脫色斑的時(shí)間和平均時(shí)間也延遲。

白癜風(fēng)患者復(fù)色區(qū)可見樹突狀，高折光性的黑素細(xì)胞［13］，這與各治療組復(fù)色部位皮膚表現(xiàn)一致。茶多酚組血清中和腫瘤壞死因子α的含量低于模型組，原因可能為，氧自由基導(dǎo)致的黑素細(xì)胞破壞或功能障礙，T細(xì)胞免疫和氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)發(fā)病中相互影響［14］。茶多酚具有抗炎的作用，抑制腫瘤壞死因子α、干擾素γ、巨噬細(xì)胞增殖從而抗氧化、抑制脫色。他克莫司組局部CD8+T細(xì)胞浸潤明顯減少，可能是由于抑制各種T細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，從而減少黑素細(xì)胞損傷，促進(jìn)復(fù)色。吡美莫司組局部組織CD8+T細(xì)胞浸潤減少與抑制的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶阻止胞質(zhì)內(nèi)和T細(xì)胞激活有關(guān)的核網(wǎng)子的去磷酸化有關(guān)，因此吡美莫司抑制早期T細(xì)胞激活基因IL-2的基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞毒型T細(xì)胞的生長和增殖。本研究以他克莫司、吡美莫司作為陽性對照，結(jié)果表明茶多酚治療白癜風(fēng)有效。我國茶資源豐富，茶多酚安全且毒性極地，具有開發(fā)利用價(jià)值。茶多酚治療白癜風(fēng)的機(jī)制還需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Comparison of topical application of tea polyphenol versus pimecrolimus versus tacrolimus for the treatment of monobenzone-induced vitiligo-like depigmentation in a mouse model

Li Qing,Zhu Yiping,Xu Ai′e.Department of Dermatology,Third People′s Hospital of Hangzhou,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310053,China

Xu Ai′e,Email:xuaiehz@msn.com

Objective To compare the therapeutic effect of topical application of tea polyphenol versus pimecrolimus versus tacrolimus for monobenzone-induced vitiligo-like depigmentation in mice.Methods Twentyfive 3-week-old female C57BL/6 mice were randomly and equally divided into 5 groups:negative control group,model group,tea polyphenol group,pimecrolimus group,tacrolimus group.Monobenzone 45%cream was applied to the back of mice in all the five groups except the negative control group once daily for 40 consecutive days to establish a model of vitiligo-like depigmentation.During the induction of depigmentation,the tea polyphenol group,pimecrolimus group and tacrolimus group were topically treated with tea polyphenol,pimecrolimus and tacrolimus respectively,and the model group remaining untreated.The depigmentation of hairs and skin was observed by naked eyes on a daily basis.Tissue specimens were obtained for histological examination from depigmented skin at nonapplication sites in mice after the end of the experiment.Hematoxylin-eosin staining was conducted to analyze lymphocytic infiltration,reflectance confocal microscopy to observe melanin and melanocytes in skin,and immunofluorescence assay to detect CD8+T cell infiltration.Results Depigmentation occurred in both application sites and non-application sites of mice in the model group.Compared with the model group,the tacrolimus,pimecrolimus and tea polyphenol groups showed delayed depigmentation,reduced degree and area index of depigmentation,and attenuated lymphocytic infiltration and CD8+T cell infiltration in depigmented maculae at application sites.In addition,the therapeutic effect of tacrolimus was stronger than that of pimecrolimus and tea polyphenol.Conclusion Tea polyphenol,pimecrolimus and tacrolimus are all effective for the treatment of vitiligolike depigmentation in mice.

Monobenzone;Tea polyphenol;Tacrolimus;Pimecrolimus;Vitiligo,animal model

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.014

杭州市重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目（20122513A02）

310053杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

許愛娥，Email：xuaiehz@msn.com

2014-04-07）

（本文編輯：吳曉初）