丁艷 何小解 廖旺 楊慧蘭 向偉 黨西強 易著文

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患兒Epstein-Barr病毒基因異常表達的研究

丁艷 何小解 廖旺 楊慧蘭 向偉 黨西強 易著文

目的 探討Epstein-Barr病毒（EBV）基因在兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）中的表達和意義。方法分離20例SLE患兒和12例健康對照外周血單一核細胞（PBMC），用酶聯免疫吸附測定（ELISA）鑒定出血清中編碼EBV衣殼抗原-IgG/IgM抗體陽性的SLE患兒，取其分泌EBV的細胞上清液與提取的PBMC共同培養(yǎng)12 d，提取培養(yǎng)前后的PBMC的RNA，用反轉錄實時定量PCR（RT-PCR）的方法檢測EBV基因的表達。結果10例患兒和1例健康對照檢測到LMP1表達，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。4例患兒和1例健康對照檢測到LMP2表達，13例患兒和3例健康對照檢測到EBNA1表達，3例患兒和1例健康對照檢測到BCRF1表達，5例患兒和2例健康對照檢測到BLLF1表達，但患兒和健康對照比較，差異均無統(tǒng)計學意義。用分泌EB病毒的細胞上清液培養(yǎng)PBMC后，發(fā)現患兒組和健康對照組潛伏期基因和裂解期基因表達均有不同程度的增加，潛伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1和裂解期基因BCRF1、BLLF1的表達與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 兒童SLE患者存在EBV基因的異常表達，EBV基因可能參與了SLE的發(fā)病。

紅斑狼瘡，系統(tǒng)性；EB病毒感染；基因表達；兒童

對象和方法

一、對象

2012年1月至2013年11月，海南省婦幼保健院皮膚科與中南大學湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學中心小兒腎臟?？剖罩蜸LE患兒20例，男8例，女12例，年齡3～14歲，平均（8.2±2.9）歲。海南省婦幼保健院兒童保健科體檢健康兒童12例，男5例，女7例，年齡4～13歲，平均（8.7±2.4）歲，家族中無自身免疫性疾病史。SLE的診斷依據1982年美國風濕病協會修正的診斷標準［4］。經方差分析和χ2檢驗，各組之間年齡和性別分布差異均無統(tǒng)計學意義。本文研究通過海南省婦幼保健院倫理會的批準，每例患兒家長均簽署了知情同意書。

二、方法

1.細胞分離：抽取SLE患兒及健康對照組肝素抗凝靜脈血10 ml。用淋巴細胞分離液常規(guī)分離PBMC。

2．細胞培養(yǎng)：用酶聯免疫吸附測定（ELISA）鑒定出血清中編碼EBV衣殼抗原（VCA）-IgG/IgM抗體陽性的患兒，取其分泌EBV的細胞上清液與提取的PBMC共同培養(yǎng)12 d。

3.RNA提?。河肨rizol誖試劑（美國Invitrogen公司），依據說明書操作分別提取培養(yǎng)前及培養(yǎng)后SLE患兒組及健康對照組PBMC RNA。

4.實時定量RT-PCR法檢測EBV基因的表達：cDNA的合成用反轉錄試劑盒（美國Fermentans公司），反應體系：18 μl（1～5 μg）RNA，5 × 反應緩沖液 5 μl，2.5 U/μl Poly A 聚合酶 1 μl，RT 混合1 μl，總體積 25 μl混勻，短暫離心，37 ℃反應 1 h，然后85℃5 min使反轉錄酶失活，取出置－20℃冰箱保存。

實時PCR：在Icycler IQ實時熒光定量PCR儀（美國Bio-rad公司）進行PCR技術檢測EBV基因EBV 核抗原 1（EBNA1），潛伏膜蛋白 1（LMP1），潛伏膜蛋白 2（LMP2），即刻裂解基因（BZLF1），晚期裂解基因（BcRF1），晚期裂解基因（BLLF1）。引物序列由上海博亞生物技術有限公司合成：EBNA1：上游引物 5′-TGCCCCCTCGTCAGACATGATT-3′和下游引物 5′-AGCGTGCGCTACCGGAT-3′；LMP1:上游引物 5′-TTGGTGTACTCCTACTGATGATCACC-3′和下游引物5′-AGTAGATCCAGATACCTAAGACAA GT-3′；LMP2：上游引物 5′-ATGACTCATCTCAACA CATA-3′和下游引物 5′-CATGTTAGGCAAATTGCA AA-3′；BZLF1：上游引物 5′-CGCCTGGGCATTCGTG TTAGTATAT-3′和下游引物 5′-AAGAATCGGGTGG CTTCCAGAA-3′；BcRF1：上游引物 5′-AGGGCCTGT TTGATTTCTCCAAGAG-3′和下游引物5′-TTTGTCA CGTTCGCCGAATGTC-3′；BLLF1：上游引物 5′-CAT TGGTAGCCGTTCGTGTGATAAT-3′和下游引物 5′-GCGAGCAATCGGACATTTGACAT-3′。PCR 反應體積為20 μl，反應體系為2×SYBR Green qPCR混合 10 μl，（10 μmol/L）上下游引物各 1 μl，cDNA 1 μl，水 7 μl。PCR 反應條件為：95 ℃預變性，3 min，之后每一步95℃變性，10 s，58℃退火延伸30 s，共進行35個循環(huán)，每次在延伸階段讀取熒光值。采用標準曲線相對定量法進行結果分析。

5.統(tǒng)計方法：本研究用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計數資料比較采用χ2檢驗或使用Fisher精確概率法；兩組間比較用t檢驗。。

結 果

一、兒童SLE血液中異常潛伏和裂解基因表達

用RT-PCR檢測了SLE患兒及健康對照PBMC EBV基因表達，發(fā)現10例患兒和1例健康對照檢測到潛伏期基因LMP1表達，兩者有統(tǒng)計學意義差異（P<0.05）。4例患兒和1例對照檢測到潛伏期基因LMP2表達，13例患兒和3例對照檢測到潛伏期基因EBNA1表達，3例患兒和1例對照檢測到裂解期基因BCRF1表達，5例患兒和1例對照檢測到裂解期基因BLLF1表達，但差異均無統(tǒng)計學意義。結果見表1。

表1 SLE患兒組及健康對照組PBMC EBV基因的陽性表達

二、培養(yǎng)后兒童SLE血液中異常潛伏和裂解基因的表達

用分泌EBV的細胞上清液培養(yǎng)SLE患兒和健康對照PBMC后，RT-PCR檢測EBV基因表達，結果發(fā)現患兒組和健康對照組潛伏期基因和裂解期基因表達均有不同程度的增加，潛伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1 和裂解期基因 BCRF1、BLLF1 的表達與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表2。

表2 培養(yǎng)后SLE患兒組及健康對照組PBMC EBV基因的表達（±s）

表2 培養(yǎng)后SLE患兒組及健康對照組PBMC EBV基因的表達（±s）

注：P值為SLE患兒組與健康對照組比較

組別 例數SLE患兒組 20健康對照組 12 t值P值LMP1 LMP2 EBNA1 BZLF1 BCRF1 BLLF1 1.011±0.141 1.001±0.093 1.012±0.163 0.889±0.191 1.015±0.167 1.038±0.264 0.383±0.171 0.208±0.082 0.188±0.129 0.713±0.278 0.344±0.161 0.117±0.081 10.680 25.109 14.591 1.935 11.268 14.513 0.000 0.000 0.000 0.069 0.000 0.000

討 論

在健康人血液中，EBV感染的細胞保持較低的頻率，但穩(wěn)定較長時間。而在SLE患者中，EBV受SLE免疫功能障礙影響，它可能導致血液中不合適的病毒基因的表達［5］。本實驗用RT-PCR方法分別檢測了SLE患兒組和健康對照組PBMC中EBV基因表達，發(fā)現SLE患兒組和健康對照組均有EBV潛伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1的表達和裂解期基因BCRF1、BLLF1的表達，但SLE患兒組潛伏基因和裂解期基因表達的陽性率均高于健康對照組，其中SLE患兒組潛伏期基因LMP1的表達顯著高于健康對照（P<0.05），與國外對于成人SLE中EBV的研究一致［5］，提示LMP1可能在兒童SLE的發(fā)病中起到一定的致病作用。本研究結果表明，SLE患兒及部分健康對照均有EBV基因的表達，但SLE患兒本身存在異常的B細胞亞群、活化標記物的表達以及細胞內信號的紊亂等免疫功能障礙，導致EBV基因的異常表達，可能是兒童SLE致病的原因之一。為進一步驗證實驗結果，本研究用分泌EBV的細胞上清液培養(yǎng)SLE患兒組和健康對照組PBMC共12 d，用RT-PCR方法檢測6種不同基因的表達，結果發(fā)現培養(yǎng)后潛伏期基因和裂解期基因表達均有不同程度的增加，其中除BZLF1外，潛伏期基因 LMP1、LMP2、EBNA-1 和裂解期基因 BCRF1、BLLF1的表達與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），提示它們可能參與了兒童SLE發(fā)病的過程。

LMP1和LMP2提供替代B細胞的存活和分化的信號（分別為CD40和BCR）［3］。國外的研究表明，LMP-1能夠通過多種機制加重SLE的自身反應性，包括直接激活B細胞，增強B細胞活化的協同刺激信號［6-7］，刺激 B細胞活化因子（BAFF）的產生，能夠協助打破自我耐受等［8］。本研究中，20例SLE患兒中有10例LMP1陽性，培養(yǎng)后患者的LMP1表達顯著增加，提示LMP1在兒童SLE的發(fā)病中可能起著重要作用。

EBNA-1基因編碼的EBNA-l是病毒復制所需的唯一的病毒編碼蛋白，能被病毒特異性CTL識別，引起免疫應答［1］。EBNA-l與Sm B自身免疫抗體靶向的開始序列有很大的同源性［9］，通過分子模擬機制，打破自身免疫耐受，產生大量抗Sm B抗體。此外，EBNA-1的部分序列與Ro開始序列也存在交叉反應，產生抗Ro抗體［9］。裂解期基因BCRF1主要編碼VIL-10，VIL-10與人IL-10有83%的同源性，具有與人IL-10類似調節(jié)B淋巴細胞增殖和分化的功能［10］。晚期裂解基因BLLF1，其編碼產物gp350/220作為膜抗原結合B細胞上表達CD21分子，進人細胞內,感染B淋巴細胞［11］。本研究發(fā)現，SLE患兒組中BCRF1與BLLF1表達較健康對照組增加，且用分泌EBV的細胞上清液培養(yǎng)后SLE患兒組較健康對照組表達有顯著增加，與國外Cross對于成人SLE的研究一致［5］，提示SLE患兒中亦可能存在更多的裂解期EBV感染。BZLF1是EBV的早期即刻基因，是病毒從潛伏狀態(tài)活化進入裂解期后最早表達的基因。本研究SLE患兒及培養(yǎng)后的PBMC的BZLF1表達均為陰性，與陳官芝等［12］研究結果相似，提示EBV增殖復制的激活可能通過其他途徑。

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Aberrant expression of Epstein-Barr virus genes in children with systemic lupus erythematosus

Ding Yan*,He Xiaojie,Liao Wang,Yang Huilan,Xiang Wei,Dang Xiqiang,Yi Zhuwen.*Graduate School of Southern Medical University,Guangzhou 510015,China

s:Yang Huilan,Email:huilany88@hotmail.com;Xiang Wei,Email:xiangwei@163.com

Objective To investigate the expression and significance of Epstein-Barr virus（EBV）genes in children with systemic lupus erythematosus （SLE）.Methods Peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）were isolated from 20 children with SLE and 12 healthy human controls.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect anti-EBV viral capsid antigen（VCA）IgG/IgM antibodies.The culture supernatants of cells from patients with anti-EBV VCA IgG/IgM antibodies were collected,and PBMCs from the patients and controls were co-cultured with the supernatants respectively for 12 days.RNA was extracted from PBMCs before and after the coculture,and reverse transcription-PCR was performed to detect the expression of EBV genes,including LMP1,LMP2,EBNA1,BCRF1,BLLF1 and BILF1 genes.Results LMP1 gene was detected in fresh PBMCs from 10 out of 20 patients and 1 out of 12 controls （P<0.05）.No significant differences were observed between the patients and controls in the detection rate of LMP2 gene（4/20 vs.1/12）,EBNA1 gene（13/20 vs.3/12）,BCRF1 gene（3/20 vs.1/12）or BLLF1 gene （5/20 vs.2/12）in fresh PBMCs.After co-culture with the supernatants of cells from patients with anti-EBV VCA IgG/IgM antibodies,the expressions of EBV genes in these PBMCs were increased to different degrees,and there was a significant difference in the expressions of EBV latent genes LMP1,LMP2 and EBNA-1 as well as EBV replicative genes BCRF1 and BLLF1 between the patient-derived and control-derived PBMCs（allP<0.05）.Conclusions There is an aberrant expression of EBV genes in children with SLE,and EBV genes may contribute to the development of SLE.

Lupus erythematosus,systemic;Epstein-Barr virus infections;Gene expression;Child

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是累及全身多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，表現為T、B淋巴細胞異?；罨痛罅孔陨砜贵w產生［1］。兒童SLE通常臨床表現較嚴重，起病時急而重，是兒童時期預后較差的一種疾病。近年來SLE的病毒病因學研究受到高度重視，Epstein-Barr病毒（EBV）感染與SLE發(fā)生發(fā)展的關系已成為研究的熱點［2-3］。EBV具有嗜B淋巴細胞的特性，對機體免疫系統(tǒng)造成持續(xù)和慢性刺激，EBV在體內存在潛伏感染和裂解感染兩種形式［3］。潛伏感染只表達潛伏基因：包括EBV核抗原（EBNA），潛伏膜蛋白（LMP）；裂解感染主要表達即刻裂解基因（BZLF1）、晚期裂解基因（BCRF1、BLLF1）等。本研究通過研究兒童SLE患者中外周血單一核細胞（PBMC）及用分泌EBV的細胞上清液培養(yǎng)PBMC后EBV的表達，探討EBV在兒童SLE中的發(fā)病機制。

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.006

海南省自然科學基金（814314，309079）

510015廣州，南方醫(yī)科大學研究生院［丁艷（現在海南省婦幼保健院，570206?？冢?；中南大學湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學中心小兒腎臟?？疲ê涡〗狻Ⅻh西強、易著文）；海南省人民醫(yī)院心內科（廖旺）；廣州軍區(qū)總醫(yī)院皮膚科（楊慧蘭）；海南省婦幼保健院皮膚科（向偉）

楊慧蘭，Email：huilany88@hotmail.com；向偉，Email：xiangwei@163.com

2014-08-05）

（本文編輯：吳曉初）