高俊濤 萬(wàn) 朋 王春艷 謝 維

吉林醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室（吉林 132013）

熱應(yīng)激誘導(dǎo)雄性大鼠生殖功能改變的實(shí)驗(yàn)觀察*

高俊濤**萬(wàn) 朋 王春艷 謝 維

吉林醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室（吉林 132013）

目的 觀察熱應(yīng)激誘導(dǎo)雄性大鼠生殖功能的改變，并初步探討其生理機(jī)制。方法 清潔級(jí)Wistar大鼠64只，隨機(jī)分成4組，即正常對(duì)照組及環(huán)境溫度分別為38℃、40℃、42℃的3組熱應(yīng)激組，將大鼠暴露于高溫環(huán)境1h/d，連續(xù)14d。分別于高溫暴露后7d 和14d進(jìn)行大鼠性行為能力的觀察，包括撲捉潛伏期（capture incubation period，CIP）、撲捉次數(shù)（capture times，CT）、精子相對(duì)計(jì)數(shù)、精子畸形率；血清與睪丸組織中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）等指標(biāo)的檢測(cè)。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，42℃高溫暴露7d，14d以及40℃高溫暴露14d后大鼠的撲捉潛伏期顯著延長(zhǎng)，撲捉次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；精子相對(duì)計(jì)數(shù)明顯減少（P＜0.05）；精子畸形率明顯增加（P＜0.05）；血清和睪丸組織中SOD的活性顯著降低（P＜0.05），MDA的含量顯著增加（P＜0.05）；38℃熱應(yīng)激組上述各項(xiàng)指標(biāo)與正常對(duì)照組相比均未見(jiàn)明顯變化。結(jié)論 高溫環(huán)境暴露后，產(chǎn)生的熱應(yīng)激可改變雄性大鼠的生殖功能，其作用機(jī)制可能與生殖細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)。

熱應(yīng)激； 生殖細(xì)胞； 氧化性應(yīng)激

高溫環(huán)境導(dǎo)致人體體溫調(diào)節(jié)中樞功能紊亂，體核溫度升高，并由此引起循環(huán)系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，表現(xiàn)為高體溫、譫妄、驚厥或昏迷［1］。機(jī)體處于高溫環(huán)境，機(jī)體體溫調(diào)節(jié)失敗，最終機(jī)體出現(xiàn)動(dòng)脈血壓降低，氧分壓降低，如無(wú)法得到及時(shí)搶救將導(dǎo)致血壓迅速下降，機(jī)體各器官缺血缺氧，直至死亡。高溫環(huán)境對(duì)人類(lèi)健康和生殖功能產(chǎn)生危害，當(dāng)前各國(guó)生殖健康的狀況相當(dāng)嚴(yán)峻，高溫對(duì)睪丸組織會(huì)產(chǎn)生損害，精子對(duì)高溫環(huán)境特別敏感，使男性生殖能力下降，甚至導(dǎo)致不孕不育癥。以往的研究表明，熱應(yīng)激與雄性生殖功能存在密切的聯(lián)系，熱應(yīng)激導(dǎo)致精子發(fā)育異常［2］，熱應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白-1在雄性生殖系統(tǒng)的表達(dá)［3］，熱應(yīng)激引起的代謝改變與雄性生殖功能具有密切聯(lián)系［4］，因此，本實(shí)驗(yàn)采用不同溫度的熱應(yīng)激動(dòng)物模型，在大鼠的生精期內(nèi)，選取不同的時(shí)間點(diǎn)，分別從大鼠性行為能力和血清及組織中氧化應(yīng)激水平等方面來(lái)研究不同溫度對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)的時(shí)間毒性，探討熱應(yīng)激引起雄性大鼠生殖功能的改變及其機(jī)制，為高溫環(huán)境對(duì)生殖系統(tǒng)的影響提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

選擇清潔級(jí)Wistar大鼠（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）64只，雄性，體質(zhì)量（180±20）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4個(gè)組，即正常對(duì)照組和熱倉(cāng)內(nèi)溫度38℃、40℃、42℃的3個(gè)熱應(yīng)激組，分別設(shè)為低、中、高溫度組，每組16只。

二、儀器與試劑

DKB-501S型超級(jí)恒溫水?。ㄉ虾＞陮?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），Hitachi 7600生化分析儀（日本Tokyo公司），多通道生理記錄儀（美國(guó)BiopacMP150）；ZMN-7803型全自動(dòng)組織包埋機(jī)（常州市華利電子有限公司），RM2126型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司），BA300型數(shù)碼生物顯微鏡（中國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），酶標(biāo)儀（SUNRISE），TD5A 型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；SOD和MDA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)置于南京建成生物技術(shù)研究所（批號(hào)：20150625）。

三、大鼠熱應(yīng)激模型制備

使用超級(jí)恒溫水浴，連接有機(jī)玻璃夾層水循環(huán)艙，保持室溫為23.0～24.0℃，控制水溫，保持熱循環(huán)艙實(shí)測(cè)溫度為38℃、40℃、42℃，相對(duì)濕度40%～60%，風(fēng)速0～0.2m/s，穩(wěn)定l h以上。將大鼠置于大小合適固定器中，放入溫度分別為38℃、40℃、42℃熱倉(cāng)內(nèi)，1h/d，連續(xù)14d，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熱倉(cāng)內(nèi)溫度，使倉(cāng)內(nèi)溫度保持穩(wěn)定，控制入倉(cāng)時(shí)間，對(duì)照組除不接受熱應(yīng)激外，其它處理與熱應(yīng)激組相同。

四、相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

（一）性行為能力的觀察

分別于熱應(yīng)激7d和14d，參照Agmo［5］方法進(jìn)行，在安靜的室內(nèi)分別將每組的每只雄性大鼠放置于50cm×35cm×20cm的干凈的大鼠籠中適應(yīng)5min，隨后投入到同批飼養(yǎng)的正常雌性大鼠形成1對(duì)1的配對(duì)，觀察30min。觀察放置雌性大鼠后，雄性大鼠的第一次撲捉時(shí)間即撲捉潛伏期，同時(shí)觀察雄性大鼠在30min內(nèi)對(duì)雌性大鼠的撲捉次數(shù)。

（二）精子相對(duì)計(jì)數(shù)測(cè)定

分別于熱應(yīng)激7d和14d后，大鼠脫椎處死后，取出雙側(cè)附睪，在盛有2mL生理鹽水（提前預(yù)熱至37℃）的潔凈培養(yǎng)皿中進(jìn)行剝離術(shù)，使儲(chǔ)存在附睪中的精子游離出來(lái)。剝離好的附睪放置于37℃的恒溫箱中孵育15～20min，取出過(guò)濾（4層濾紙）至EP試管。用移液槍取出100μL的精液，加入3%100μL的NaCl溶液中固定，輕輕混勻后取適量滴加至紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)精子數(shù)。計(jì)數(shù)原則：對(duì)于壓線(xiàn)精子，只計(jì)數(shù)精子頭，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。視精子密度而定，若精子密度高，則取1滴精液涂片即可。涂好的涂片自然風(fēng)干，待其干燥后，加入適量甲醇固定，待其干燥后，置于2%的伊紅染液中染色1h，染好后取出，以細(xì)小流水輕輕沖洗，自然干燥后即可在顯微鏡下觀察。在低倍顯微鏡下找到背景清晰精子重疊較少的部位。用高倍顯微鏡順序檢查精子形態(tài)，每只大鼠檢查完整的精子500條。

（三）血清和睪丸組織SOD和MDA檢測(cè)

分別于熱應(yīng)激的7d和14d后，經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血，將血液置于肝素處理過(guò)的冰浴試管內(nèi)，將睪丸組織切碎勻漿，分別置于3 000×g的離心機(jī)內(nèi)離心30min，分別取血清和上清液，進(jìn)行氧化損傷指標(biāo)的檢測(cè)，SOD和MDA試劑盒均購(gòu)置于南京建成生物技術(shù)研究所，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

（四）數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、熱應(yīng)激對(duì)雄性大鼠性行為的影響

正常雄性大鼠放置于雌性大鼠后（29.37±3.65）s開(kāi)始撲捉，在30 min內(nèi)撲捉雌鼠的次數(shù)可達(dá)（41.28±5.16）次；42℃熱應(yīng)激7d后，雄性大鼠表現(xiàn)為少動(dòng)，撲捉潛伏期明顯延長(zhǎng)至（40.20±5.31）s，在30 min內(nèi)撲捉的次數(shù)也顯著減少至（29.38±3.81）次，與正常對(duì)照組比差異異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；42℃熱應(yīng)激14d后大鼠的撲捉潛伏期顯著延長(zhǎng)、撲捉次數(shù)顯著減少，與正常對(duì)照組比差異異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），（見(jiàn)表1）。

二、熱應(yīng)激對(duì)雄性大鼠精子質(zhì)量的影響

分別于熱暴露的7d和14d后，取出雙側(cè)附睪，觀察熱應(yīng)激組大鼠與正常對(duì)照組大鼠的精子數(shù)量及精子的致畸率變化，結(jié)果顯示，高溫度組7d、14d后和中溫度組14d后精子相對(duì)計(jì)數(shù)明顯減少，精子畸形率明顯增加（P＜0.05），差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（見(jiàn)表2）。

表1 熱應(yīng)激7 d和14 d后對(duì)雄性大鼠性行為的影響（n=8）

表2 熱應(yīng)激7 d和14 d后對(duì)雄性大鼠精子質(zhì)量的影響（n=8）

三、熱應(yīng)激對(duì)雄性大鼠組織和血清中SOD活性和MDA含量的影響

分別于熱應(yīng)激的7d和14d后，經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血并收集血清，將睪丸組織切碎勻漿取上清液，取待測(cè)樣本嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，高溫組7d、14d后和中溫度組14d后與正常對(duì)照組相比，血清和睪丸組織中SOD的活性顯著降低（見(jiàn)圖1），血清和睪丸組織中MDA的含量顯著增加（P＜0.05），差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖2）。

圖1 熱應(yīng)激后7d和14d對(duì)大鼠血清和睪丸組織中的SOD活性的影響圖2A為熱應(yīng)激后7d和14大鼠血清中SOD活性的變化；圖1B為熱應(yīng)激后7d和14d大鼠睪丸組織中SOD活性的變化；C：正常對(duì)照組，L：低溫度組，M：中溫度組，H：高溫度組；與正常對(duì)照組相比較，*：P＜0.05， **：P＜0.01

圖2 熱應(yīng)激后7d和14d對(duì)大鼠血清和睪丸組織中的MDA含量的影響圖2A為熱應(yīng)激后7d和14d大鼠血清中MDA含量的變化，圖2B為熱應(yīng)激后7d和14d大鼠睪丸組織中MDA含量的變化；C：正常對(duì)照組，L：低溫度組，M：中溫度組，H：高溫度組； 與正常對(duì)照組相比較，*：P＜0.05， **：P＜0.01

討 論

雄性生殖系統(tǒng)對(duì)溫度變化敏感，熱應(yīng)激對(duì)雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良的影響，由于睪丸中血管相對(duì)缺乏，血流不暢，散熱困難，所以易出現(xiàn)過(guò)熱而造成睪丸損傷。研究表明，短時(shí)間的熱應(yīng)激可引起雄性大鼠可逆性的睪丸損傷［6］。本研究表明，持續(xù)高溫環(huán)境可引起精子活力下降，存活率降低，畸形率增加等。有研究表明熱應(yīng)激能夠引起代謝改變，從而影響雄性生殖系統(tǒng)［4］。熱應(yīng)激過(guò)程中睪丸和生精細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化物、一氧化氮等活性氧族（ROS）和活性氮族物質(zhì)（RNS）［7］，它們與精子的生理功能有關(guān)。當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過(guò)生殖系統(tǒng)抗氧化系統(tǒng)的清除能力時(shí)，精子受活性氧的過(guò)氧化傷害則會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生毒性作用，引起精子膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致其形態(tài)、功能及代謝異常，甚至導(dǎo)致雄性不育。丙二醛（MDA）是過(guò)氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物，通過(guò)MDA的測(cè)定可反應(yīng)體內(nèi)自由基產(chǎn)生的程度。超氧化物歧化酶（SOD）是細(xì)胞中主要的抗氧化酶之一，它在機(jī)體清除氧自由基（ROS）的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究分別在熱應(yīng)激的第7天和第14天，進(jìn)行了大鼠的性行為觀察，并完成了精子相對(duì)計(jì)數(shù)和精子畸形率的分析，同時(shí)測(cè)定了睪丸組織和血清中SOD的活性以及MDA的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，高溫環(huán)境暴露的過(guò)程中熱應(yīng)激可以隨時(shí)間和強(qiáng)度聚集，導(dǎo)致精子的相對(duì)數(shù)量減少而精子的畸形率增加，熱應(yīng)激模型組大鼠血清和睪丸組織內(nèi)MDA含量均較正常對(duì)照組高，而熱應(yīng)激模型組大鼠血清和睪丸組織內(nèi)SOD水平顯著下降。這些結(jié)果提示，熱應(yīng)激對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響，其作用機(jī)制可能與生殖細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)。

1 Bouchama A， Knochel JP， Heat stroke. N Engl J Med 2002； 346 （25）: 1978-1988

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（2015-08-28收稿）

Heat-stress-induced male reproductive function changes in rats*

Gao Juntao**， Wan Peng， Wang Chunyan， Xie Wei
Department of Physiology， Jilin Medical College， Jilin 132013， China
Corresponding author: Gao Juntao， E-mail: 15948628662@163.com

Objective To investigate the heat-stress-induced male reproductive function changes in rats and exploreits mechanism. Methods Total of 64 male wistar rats with clean degree were randomly divided into the control group and the heat stress groups with 38℃， 40℃， 42℃. Heat exposure （1h/d） lasted for 14 d. Sex ability of rats was assessed including the capture incubation period （CIP） and the capture time （CT）. After heat exposure， the number of sperm count and sperm deformity， the superoxide dismutase （SOD）， and malondialdehyde （MDA） were detected. Results Under 42℃ heat exposure， capture incubation period （CIP） of rat was prolonged and the capture time （CT） was reduced signifi cantly （P＜0.05）on 7d， 14d and under 40℃ heat exposure on 14d. Under 42℃ heat exposure， relative sperm count and the activity of SOD in serum and testicular tissue were decreased signifi cantly （P＜0.05）， whereas sperm malformation rate and the content of MDA in serum and testicular tissue were increased signifi cantly （P＜0.05） on 7d， 14d and under 40℃ heat exposure on 14d.. All the above-mentioned indexes had no signifi cant changes compared with those of the control group. Conclusion Heat stress can affect male reproductive system， and its mechanism may be related to the oxidative damage of germ cells.

heat； germ cells； oxidative stress

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.11.004

R 691.6

資助: 國(guó)家自然科學(xué)基金（31071042）； 吉林省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2012Z066）

**通訊作者: E-mail: 15948628662@163.com