尤耀東 陳帝昂 張培海 俞旭君 李廣森 常德貴**

1.成都中醫(yī)藥大學 （成都 610075）； 2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院； 3.四川省中西醫(yī)結合醫(yī)院

強精片對不育大鼠睪丸內(nèi)FasL、ABP及Occludin蛋白表達影響的實驗研究*

尤耀東1陳帝昂2張培海3俞旭君1李廣森2常德貴2**

1.成都中醫(yī)藥大學 （成都 610075）； 2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院； 3.四川省中西醫(yī)結合醫(yī)院

目的 觀察強精片對不育大鼠睪丸生精微環(huán)境血-睪屏障（BTB）的影響及可能的機制。方法 70只雄性SD大鼠隨機分為空白組（BG組）20只和雷公藤多甙片（GTW）灌胃的造模組50只，灌胃3周后兩組各取10只進行模型驗證。其余40只造模大鼠隨機分為模型組（MG組）和強精片低劑量組（QJPL組）、中劑量組（QJPM組）、高劑量組（QJPH組），灌胃4周后處死分離睪丸，檢測相關指標。結果 與BG組相比，MG組睪丸組織中FasL、ABP表達量明顯上調(diào)（P＜0.01），而緊密連接蛋白Occludin表達降低（P＜0.01）。應用藥物強精片干預后，F(xiàn)asL、ABP蛋白在睪丸內(nèi)表達降低，其中高劑量組更為顯著（P＜0.01）；Occludin蛋白較MG組表達上調(diào)，差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 通過上調(diào)睪丸組織內(nèi)FasL、ABP蛋白的表達，改變支持細胞功能，同時抑制Occludin蛋白的表達，破壞BTB完整性，增加其通透性，最終影響生精微環(huán)境，這可能是GTW致不育的原因之一。而強精片能夠降低睪丸內(nèi)FasL、ABP表達量，提高Occludin蛋白表達，修復BTB功能，可能是中藥制劑改善精子功能的機制之一，但在這一過程中中藥介導的具體機制尚需進一步研究。

不育，男性； 大鼠； 強精片； Fas配體蛋白質(zhì)； 雄激素結合蛋白質(zhì)

前期研究已證實中藥制劑“強精片”能夠改善不育患者精液指標，提高附睪內(nèi)多種活性物質(zhì)含量，但尚未進行對睪丸生精微環(huán)境影響的相關研究。血-睪屏障（blood- testis barrier， BTB）內(nèi)各種生殖細胞（支持細胞、生精干細胞、各級生精細胞和精子）以及各種調(diào)節(jié)因子共同構成的一個相對封閉的細胞環(huán)境，參與生精過程的調(diào)節(jié)，為精子發(fā)生的必要基礎。本實驗在“腎主生殖”理論指導下，生精微環(huán)境中多種蛋白的影響，探討其對不育大鼠生殖的保護作用。

資料和方法

一、實驗動物與試劑

（一）實驗動物

清潔級青春期雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠70只，2.5～3月齡，體質(zhì)量210～230g。由成都中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供（川實動管質(zhì)第114號）。實驗期間飼養(yǎng)于室溫（20～30）℃，l2h光、l2h暗的條件下，自由攝食全價大顆粒飼料、飲水，馴養(yǎng)l周后使用。

（二）藥物與試劑

強精片（QJP），某院提供，規(guī)格0.35g/片，100片/瓶，批號：000613。用時將強精片研末，溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液（CMC-Na）分別配制成相應濃度的混懸液備用。

雷公藤多甙片（GTW），上海醫(yī)科大學紅旗制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格l0mg/片，批號：9902l9。同時將GTW 研末，溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中，配制成濃度為2mg/mL的黃褐色混懸液備用。

一抗ABP蛋白抗體、Occludin抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；二抗生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（SP-9001）、FAS-L蛋白抗體、辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素（HRP/A-V）、封閉用正常山羊血清和濃縮型DAB試劑盒（北京中衫金橋生物有限公司）；HRP標記羊抗鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；BA200 Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；DYCZ-24DN型電泳儀、DYY-7C型轉(zhuǎn)印電泳儀器（北京六一儀器廠）；Gel-Pro Analyzer 免疫印跡分析軟件（中國上海Informax公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

二、方法

（一）模型的建立

70只SD雄性成年大鼠馴化喂養(yǎng)1周后，隨機抽取20只作為空白組（blank group， BG），其余50只作為模型對照組用GTW混懸液灌胃。按濃度2mg/ ml?100g-1，每天1次，連續(xù)3周。大鼠每周稱量1次，以調(diào)整給藥劑量，造成大鼠不育模型［2，3］。3周后各組隨機抽取10只作模型評價。

（二）實驗分組與給藥

模型對照組再按體質(zhì)量分層后隨機等分為4組分別給藥：（1）模型組（medol group， MG）：每天GTW 20mg/kg；（2）強精片低劑量組（Qiangjing Tablets low-dose group， QJPL）：每天GTW 20mg/kg +QJP 58mg/kg；（3）強精片中劑量組（Qiangjing Tablets middle-dose group， QJPM）：每天GTW 20mg/kg+QJP 105 mgkg；（4）強精片高劑量組（Qiangjing Tablets high-dose group， QJPH）：每天GTW 20mg/kg+QJP 233mg/kg。空白組給予的等量生理鹽水灌胃。

（三）取材

以上5組大鼠飼養(yǎng)和藥物干預4周后，于末次灌胃2h后處死，摘取大鼠雙側(cè)睪丸。將右側(cè)睪丸對半切開；左側(cè)睪丸去除白膜及大血管，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

（四）睪丸病理觀察

將大鼠右側(cè)睪丸組織用自來水沖洗過夜，梯度脫水，二甲苯浸泡至組織透明，石蠟包埋，輪轉(zhuǎn)式切片機切片5μm；置于載玻片上，進行HE染色，加拿大樹膠封片供鏡檢。

（五）免疫組化測定睪丸FasL、ABP、Occludin

用免疫組化S-P法測定右側(cè)睪丸內(nèi)FasL、ABP和Occludin蛋白含量，染成棕色的組織即為陽性區(qū)域。陰性表達為藍色，底色為白色。每張切片先于顯微鏡（×100）下觀察全部組織，再根據(jù)組織大小及表達情況分別選取1～3個區(qū)域400倍采集圖像。

采用圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的平均光密度（IOD），以均數(shù)±標準差（±s）的形式表示。

（六）蛋白印跡測定睪丸內(nèi)Occludin含量

1. 睪丸組織總蛋白的提?。喝∶拷M的各大鼠液氮冷凍睪丸組織l00mg，放入預冷RIPA組織裂解液中，勻漿破碎細胞5次，4℃下放置2h后離心取上清液，分裝少量上清液用于總蛋白濃度的測定，其余的加入等體積2×加樣緩沖液，100℃水浴10min，分裝后-20℃保存。

2. 睪丸組織總蛋白濃度的測定（BCA法）：依照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行操作：配置濃度為0.5mg/mL的蛋白標準（BSA）液，用于標準曲線的繪制。并依據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白濃度，見圖1。

標準曲線方程 y=0.4671x+0.2663，將樣品平均OD值代入標準曲線方程，求出睪丸組織裂解液蛋白含量（稀釋比例為5/20）y=0.5003mg/mL，即原裂解液蛋白含量為2.0006mg/mL。估計western blot每泳道上樣量約5～10μL。

將蛋白裂解液與SDS上樣緩沖液（5X）按照1:4體積比混勻后煮沸加熱5～10min， 使蛋白充分變性，冷卻至室溫后-20℃保存，參考使用說明，完成樣品的上樣、轉(zhuǎn)膜、NC膜的封閉與抗體孵化、顯影。

3. 圖像處理與結果分析：在X光片機下對曝光后的X片照相，應用Gel-Pro Analyzer 4.0圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值參數(shù)進行測量計算。采用Gel-Pro Analyzer免疫印跡分析軟件對圖像多次檢測條帶OD值，取平均值。

三、統(tǒng)計學處理

使用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件單因素方差分析（ANOVA）比較各組之間的差異，方差齊性用LSD，S-N-K檢驗，方差不齊采用秩和檢驗。以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義；P＜0.01時，表示差異具有極顯著性。

結 果

一、造模結果

模型對照組在灌服雷公藤多甙片混懸液3周后，附睪精子密度下降、精子活力下降，存活率減低，與空白組比較有極顯著差異（P＜0.01）。說明模型大鼠睪丸內(nèi)存在生精障礙，本實驗造模成功。試驗中有MG組2只和QJPH組1只大鼠死亡。

二、大鼠睪丸FasL、ABP、Occludin蛋白表達分布情況

大鼠睪丸中FasL、ABP表達情況：MG組表達量高于空白組，具極顯著差異（P＜0.01），QJPL組和QJPM組表達量低于MG組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），QJPL組低于模型組，但兩者間無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Occludin表達情況：MG組蛋白表達明顯低于空白組（P＜0.01），而QJPL組、QJPM組和QJPH組較MG組蛋白表達均有上調(diào)，差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1，圖2、圖3、圖4。

表1 大鼠睪丸FasL、ABP、Occludin表達量（OD值）（s）

表1 大鼠睪丸FasL、ABP、Occludin表達量（OD值）（s）

與BG組比較， *P＜0.05， **P＜0.01； 與MG組比較，▲P＜0.05， ▲▲P＜0.01

組別 n FasL ABP Occludin BG 10 0.2009±0.0191 0.2049±0.0086 0.1826±0.0050 MG 8 0.2529±0.0172 ** 0.2241±0.0058 ** 0.1617±0.0041 ** QJPL 10 0.2308±0.0220 0.2136±0.0083 0.1749±0.0104 ▲QJPM 10 0.2244±0.0113 ▲ 0.2109±0.0022 ▲ 0.1807±0.0142 ▲QJPH 9 0.2115±0.0084 ▲▲ 0.2110±0.0086 ▲ 0.1795±0.0049 ▲

圖1 上樣量與OD值標準曲線

圖2 大鼠睪丸FasL免疫組化圖片注：箭頭為免疫組化陽性部全；A: BG （×400）； B: MG （×400）； C: QJPL （×400）； D: QJPM （×400）；E: QJPH （×400）

圖3 大鼠睪丸ABP免疫組化圖片注：箭頭為免疫組化陽性部全；A: BG （×400）； B: MG （×400）； C: QJPL （×400）； D: QJPM （×400）；E: QJPH （×400）

三、蛋白印跡測定各組大鼠睪丸組織中Occludin蛋白表達情況

Occludin表達量在MG組降低明顯，其與空白組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而強精片各劑量組Occludin表達量升高，與MG組比較差異也具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5。

討 論

BTB位于生精上皮近基底膜處相鄰支持細胞（Sertoli cell，SC）間，將生精微環(huán)境與機體內(nèi)環(huán)境相分隔，阻止某些機體內(nèi)環(huán)境的大分子物質(zhì)或有害物質(zhì)（來自血液或淋巴）進入生精小管管腔，并調(diào)節(jié)生物活性物質(zhì)在生精上皮內(nèi)的濃度［1］；同時，BTB還發(fā)揮免疫屏障作用，為睪丸的免疫豁免狀態(tài)提供物質(zhì)基礎。BTB將生精小管的上皮分隔成兩個部分，一個部分是與生精小管上皮基膜相貼的基底小室，另一部分則是連著生精小管管腔的近腔小室。位于基底室內(nèi)的前細線期和細線期初級精母細胞必須穿過BTB才能進入近腔室發(fā)育成成熟的精子細胞。BTB對精子發(fā)生過程的連續(xù)性和完整性起著決定性作用。BTB是哺乳動物體內(nèi)最為嚴密的血-組織屏障之一，其結構的基礎是支持細胞間的緊密連接（tight junction，TJ），這種SC間的TJ與粘著連接（adherens junction）、縫隙連接（gap junction）一起構建了連接復合體，鏈接復合體順序性的開放為精母細胞穿過BTB提供了重要通道，成為精子發(fā)生的的必要條件［2-5］。

圖4 大鼠睪丸Occludin免疫組化圖片注：箭頭為免疫組化陽性部全；A: BG （×400）； B: MG （×400）； C: QJPL （×400）； D: QJPM （×400）； E: QJPH （×400）

圖5 大鼠睪丸組織Occludin表達量與MG組比較：*P＜0.05， **P＜0.01

Fas/FasL信號通路參與了細胞凋亡過程，且是哺乳動物睪丸生精細胞凋亡的主要途徑［5-8］。研究［9-11］表明，睪丸生殖功能的損傷均與Fas/FasL系統(tǒng)表達異常有關，如精子成熟障礙、激素異常、化學性或物理性刺激等。這些原因均能促SC過度啟動凋亡蛋白FasL的表達，致生精細胞過度凋亡。Fas在哺乳動物睪丸組織內(nèi)的生精細胞、SC和間質(zhì)細胞膜上均有存在［5，12，13］，但主要集中分布在生精細胞［14］，而作為Fas天然配體的蛋白分子FasL，在組織中具明顯特異性，主要表達于睪丸、眼、腦等免疫豁免器官中，其在睪丸內(nèi)僅持續(xù)高表達于支持細胞［15］，因此該蛋白在睪丸組織中的表達情況能間接反映出睪丸內(nèi)SC的功能狀態(tài)：病理狀態(tài)下睪丸生精細胞的凋亡表現(xiàn)為FasL在SC的表達增加，而生精細胞膜上Fas的表達增強。本實驗免疫組化顯示，MG組FasL表達較BG組顯著升高（P＜0.01），且在SC和生精細胞相連接區(qū)域的胞漿內(nèi)可見FasL表達。這與劉東舟等［16］應用雷公藤內(nèi)酯醇誘導細胞凋亡的實驗結果相符。在應用強精片干預后，QJPM、QJPH組FasL的表達下調(diào)（P＜0.05），且SC和生精細胞相連接區(qū)域的胞漿內(nèi)陽性反應減弱，顯示強精片具有抑制凋亡蛋白FasL的過度表達的作用，推測強精片能夠改善SC功能狀態(tài)。

雄激素結合蛋白（Androgen binding protein，ABP）作為睪丸內(nèi)僅由SC合成、分泌的蛋白分子，盡管所占睪丸蛋白總量的份額極少，亦被作為從分子水平反應SC功能狀態(tài)的重要標志物。本研究結果顯示，MG組大鼠睪丸內(nèi)ABP較BG組明顯升高（P＜0.01），QJPM、QJPH組大鼠睪丸ABP表達下降（P＜0.05），提示強精片具有下調(diào)大鼠睪丸ABP的作用，推測強精片能夠改善SC功能狀態(tài)。

Occludin蛋白是TJ上的主要蛋白之一，其任何微小變化，都可能導致參與構建TJ的其他蛋白發(fā)生改變，從而影響TJ的完整性和功能發(fā)揮，導致BTB功能失常。在本實驗中，免疫組化和免疫印跡實驗結果顯示MG組大鼠的睪丸內(nèi)Occludin表達量明顯降低，較BG組有極顯著差異（P＜0.01），說明GTW能夠影響Occludin蛋白的表達，推測GTW可能通過破壞TJ功能而改變BTB通透性，進而誘導大鼠生精功能障礙的發(fā)生。應用強精片干預MG組大鼠后， QJPL組、QJPM組和QJPH組大鼠睪丸組織內(nèi)Occludin表達上調(diào)，推測強精片可能通過改善睪丸TJ功能，從而修復BTB功能。

1 Mruk DD， Cheng CY. Tight junctions in the testis: new perspectives. Philos Trans R Soc Lond Biol Sci 2010；365（1546）: 1621-1635

2 Tsukita S， Furuse M， Itoh M. Multifunctional strands in tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol 2001； 2（4）: 285-293

3 Wong CH， Mruk DD， Liu WY， et al. Regulation of bloodtestis barrier dynamics: An in vivo study. J Cell Sci 2004；117（5）: 783-798

4 Cheng CY， Wong EW， Yan HH， et al. Regulation of permatogenesis in the microenvironment of the seminiferous epithelium: new insights and advances. Mol Cell Endocrinol 2010； 315（1-2）: 49-56

5 Lee J， Riehburg JH， et al. The Fas system is a key regulator of germ cell apoptosis in the testis. Endocrinology 1997； 138（5）: 2081- 2088

6 Lee JW， Richburg JH， Younkin SC， et al. The Fas system， a regulator of testicular germ cell apoptosis， is differentially up-regulated in Sertoli cell versus germ cell injury of the testis. Endocrinology 1999； 140（2）: 852-858

7 Richburg JH， Naiez A， Gao H. Participation of the Fassignaling system in the initiation of germ cell apoptosis in young rat testes after exposure to mono-（2-ethylhexyl） phthalate （MEHP）. Toxicol Appl Pharmacol 1999； 160（3）: 271-278

8 Pentikainen V， Erkkila K， Dunkel L. Fas regulates germ cell apoptosis in the human testis in vitro. Am J Physiol 1999； 276（2 Pt 1）: E310-E316

9 Woolveridge I， de Boer-Brouwer M， Taylor MF， et al. Apoptosis in the rat spermatogenic epithelium following androgen withdrawal: hanges in apoptosis -related genes. Biol Reprod 1999； 60（2）: 461-470

10 Lysiak JJ， Turner SD， Turner TT. Molecular pathway of germ cell apoptosis following ischemia preperfusion of the rat testis. Biol Reprod 2000； 63（5）: 1465- 1472

11 Nandi S， Banerjee PP， Zirkin BR， et al. Germ cell apoptosis in the testes of Sprague Dawley rats following testosterone withdrawal by Ethane 1， 2-dimethanesulfonate administration: relationship to Fas. Biol Reprod 1999； 61（1）: 70-75

12 李宏軍， 俞莉章， 郭應祿. Fas在正常睪丸組織及精原細胞瘤中的表達. 中華泌尿外科雜志 1999； 20（10）: 621

13 彭弋峰， 徐東亮， 仲皖， 等. Fas和FasL系統(tǒng)在非梗阻性無精子癥睪丸中的表達. 臨床泌尿外科雜志 2004；19（2）: 97-99

14 Ichimura T， Kawamura M， Mitani A. Co-localized expression of FasL， Fas， Caspase 3 and apoptotic DNA fragmentation in mouse testis after oral exposure to di（2 ethylhexyl） phthalate. Toxicology 2003； 194 （l-2）: 35-42

15 Yao PL， LinYC， Sawhney P， et al. Transcriptional regulation of FasL expression and participation of sTNF-alpha in response to sertoli cell injury. J Biol Chem 2007； 282（8）: 5420-5431

16 劉冬舟， 褚愛春， 齊暉， 等. 雷公藤內(nèi)酯醇誘導T淋巴細胞凋亡時Fas/FasL的表達. 實用醫(yī)學雜志 2008； 24（8）: 1295-12971

17 Mitic LL， Van Itallie CM， Anderson JM. Molecular physiology and pathophysiology of tight junctions I. Tight junction structure and function: lessons from mutant animals and proteins. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2000； 279（2）: G250-G254

（2015-07-08收稿）

The effects of Qiangjing Tablets on the expressions of FasL， ABP and Occludin in testical tissues of infertility rats*

You Yaodong1， Chen Diang2， Zhang Peihai3， Yu Xujun4， Li Guangsen2， Chang Degui2*
1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075， China；2.Teaching Hospital of Chengdu University of T.C.M； 3. Sichuan Hospital of Integration of Traditional Chinese and Western Medicine
Correspondence to: Chang Degui， E-mail: cdg998@sina.com

Objective To investigate the effects of QiangJing Tablets on the blood- testis barrier （BTB） function of spermatogenesis microenvironment in infertility rats， and explore its possible mechanism. Methods Of 70 male SD rats， 20 rats were randomly set as the blank group （BG）， and the other 50 rats were induced to be infertility rats by gavage of GTW. After 3 weeks， 10 rats were randomly selected to validate the established model. Forty rats with sterility were randomly recruited and divided into the model group （MG）， QiangJing Tablets low-dose group （QJPL）， QiangJing Tablets middle-dose group （QJPM），and QiangJing Tablets high-dose group （QJPH）. After 4 weeks of drug delivery， their testis were taken and detected. Results Compared with those of BG， the expressions of FasL and ABP in testis of MG were up-regulated signifi cantly （P＜0.01）， while the Occludin was down-regulated remarkably （P＜0.01）. Compared with those of MG， the expressions of FasL and ABP in testis of QJPL， QJPM and QJPH were decreased signifi cantly （P＜0.05）， especially the expression of FasL in the rats intervened by high doses （P＜0.01）. Simultaneously， QiangJing Tablets could improve the expression of Occludin， compare with MG，the difference were signifi cantly （P＜0.05）. Conclusion GTW could increase the expression of FasL and ABP to distract the function of sertoli cell， while inhibit the expression of Occludin. These changes could disrupt the structural integrity of BTB， increase BTB permeability and induce infertility. QiangJing Tablets could down-regulate the expression of FasL and ABP to improve the SC function， meanwhile up-regulate the Occuldin to maintain the structure of tight junction （TJ）. More generally，the Chinese herba preparation could repair the structure of BTB destroyed by GTW. But more research was needed to explore the specifi c mechanism.

infertility， male； rats； QiangJing Tablets； Fas Ligand Protein； Androgen-Binding Protein

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.11.003

R 698.2

資助: 國家自然科學基金青年基金項目資助課題（基于MAPK通路對睪丸支持細胞影響探討強精片改善弱精子癥大鼠精子質(zhì)量的研究）， 項目批準號：81302983

**通訊作者， E-mail: cdg998@sina.com