鮑勇陽，王 露，王德培,2

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高產(chǎn)淀粉酶黑曲霉菌種誘變選育及固態(tài)發(fā)酵條件研究

鮑勇陽1,3，王 露1，*王德培1,2

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；3.天津達美科技有限公司，天津 300457）

真菌產(chǎn)生的淀粉酶具有水解條件溫和耐酸的特性，具有廣泛的應(yīng)用價值。為了篩選高產(chǎn)淀粉酶黑曲霉菌種，通過采用微波誘變和硫酸二乙酯處理等方法聯(lián)合誘變黑曲霉出發(fā)菌株，并對篩選出的黑曲霉菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶最佳條件進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，經(jīng)過微波誘變16 s和硫酸二乙酯處理20 min篩選出了一株高產(chǎn)α-淀粉酶菌株黑曲霉MD-17，其最佳產(chǎn)酶固態(tài)發(fā)酵條件為：麩皮與玉米粉干重比為7:3，硫酸銨0.6%，初始pH = 5，料水比1:1.5，α-淀粉酶的酶活力最高達到6011 U/g濕曲。

黑曲霉；α-淀粉酶；聯(lián)合誘變；固態(tài)發(fā)酵

α-淀粉酶是一類廣泛存在于動物、植物和微生物（主要是胞外酶）中的水解酶[1]，其中微生物來源的淀粉酶具有來源豐富、性能多樣和易于工業(yè)化生產(chǎn)的特點，包括絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌等[2]。目前能夠滿足工業(yè)應(yīng)用需求的α-淀粉酶主要來源于細菌和絲狀真菌[3-4]，其中由真菌產(chǎn)生的α-淀粉酶即稱為真菌α-淀粉酶，可水解淀粉內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵，也能水解麥芽三糖，使中產(chǎn)物中不含大分子極限糊精，并具有耐酸性，在工業(yè)上有廣泛應(yīng)用[5-6]。

真菌α-淀粉酶在生產(chǎn)中主要應(yīng)用于淀粉的糖化作用。真菌α-淀粉酶與細菌α-淀粉酶相比，反應(yīng)溫度溫和，作用pH偏酸性，在工業(yè)生產(chǎn)中主要應(yīng)用在高麥芽糖漿生產(chǎn)、啤酒發(fā)酵過程中以提高原料轉(zhuǎn)化率，在面制品中作為質(zhì)改良劑，在濃縮果汁加工中分解果汁中的淀粉提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品穩(wěn)定性以及在醫(yī)藥上用作助消化劑等食品醫(yī)藥方面。

我國近年來才開始真菌α-淀粉酶的研究工作，大部分尚停留在菌種選育階段。主要生產(chǎn)菌株有：米曲霉、白曲霉、黑曲霉、青霉等[8]，一般發(fā)酵酶活力（固體濕曲）3000~5000 U/g，而國外一般發(fā)酵酶活力15000~20000 U/g，進口真菌淀粉酶壟斷國內(nèi)市場的局面一直未能被打破。本研究針對已有產(chǎn)α-淀粉酶的黑曲霉進行多重聯(lián)合誘變，通過篩選獲得高產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，并對其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶的條件進行優(yōu)化，以期實現(xiàn)飼用α-淀粉酶添加劑的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗菌種

出發(fā)菌株：黑曲霉（）AS 381由試驗室篩選并保藏。

1.1.2 實驗原料及試劑

麩皮、玉米粉、玉米漿均由天津達美科技有限公司提供，其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%，Vogel’s母液4%[9]，蛋白胨 0.1%，瓊脂2%，pH = 4.8；

篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.5%，Vogel’s母液4%[9]，玉米漿0.3%，瓊脂2%，pH = 4.8；

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉(過60目篩) 20 g，麩皮(過20目篩) 80 g， (NH4)2SO41.5 g，MgSO4.7H2O 0.05 g，K2HPO4 0.3 g，固液比（M/V）=1:1.5，初始pH = 5.5，裝料量為50 g/500 mL三角瓶。

1.2 實驗方法

1.2.1 篩選高產(chǎn)菌株

采用篩選培養(yǎng)基平板涂布法培養(yǎng)30 ℃，60 h，觀察單菌落透明圈，以透明圈直徑與菌落直徑之比的大小來判斷其產(chǎn)酶能力。

1.2.2固體發(fā)酵培養(yǎng)

孢子懸液接種，250 mL三角瓶裝20 g固體培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱28~30 ℃靜置培養(yǎng)4~5 d。

1.2.3 實驗菌株誘變方法

1.2.3.1 出發(fā)菌株的活化

黑曲霉AS 381于斜面培養(yǎng)基中， 30℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，斜面培養(yǎng)基上長滿孢子。

1.2.3.2 孢子懸浮液的制備

無菌水洗斜面孢子倒入裝有玻璃珠的三角瓶中，置于180 r/min 搖床上30 ℃恒溫振蕩30 min，使孢子分散，再經(jīng)無菌脫脂棉過濾，濾液即為單孢子懸液，用血球計數(shù)板對單孢子懸液進行計數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度約為106個/mL。

1.2.3.3 微波誘變

微波誘變：選用最大功率700 W，額定微波頻率2450 MHz，按不同累積處理時間，對孢子懸浮液進行輻照處理。取10 mL孢子懸液于φ90培養(yǎng)皿中置于微波爐內(nèi)，累積處理時間分別為10、12、14、16、18、20 s，各取1 mL處理孢子懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋后（每平板10~12菌落為宜），取各稀釋度0.5 mL，涂布于篩選培養(yǎng)基表面，30 ℃，培養(yǎng)60 h，觀察單菌落透明圈，以透明圈直徑與菌落直徑之比的大小來判斷其產(chǎn)酶能力，并將產(chǎn)酶較好的單個菌落分別挑到斜面上，進行搖瓶液體發(fā)酵實驗。

1.2.3.4 硫酸二乙酯(DES)誘變

制備孢子懸浮液106個/ mL，取1 mL孢子懸液，分別DES誘變處理10、15、20、25、30、35、40 min，無菌水離心洗滌數(shù)次，停止誘變，傾注法分離。

1.2.3.5 微波(MW)、硫酸二乙酯(DES)聯(lián)合誘變

制備孢子懸浮液，取10 mL孢子懸液，φ90培養(yǎng)皿中置于微波爐內(nèi)，累積處理時間為16 s，5 mL DES誘變處理30 min，無菌水大量稀釋停止誘變，傾注法分離。

1.2.3.6 高產(chǎn)菌株的篩選

（1）高產(chǎn)菌株的初篩

將經(jīng)誘變處理過的孢子稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)60 h，挑取生長旺盛且透明圈與菌落直徑比大者接種斜面培養(yǎng)基。

（2）高產(chǎn)菌株的復(fù)篩

將初篩所獲菌株接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)72 h，得到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物，測定其酶活力，以出發(fā)菌株作對照，產(chǎn)酶活超過出發(fā)菌株為正突變株進入第二次篩選。

（3）高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性試驗

復(fù)篩獲得的突變高產(chǎn)菌株通過斜面?zhèn)鞔?2次后，測定每代的產(chǎn)酶性。

1.2.4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

將所產(chǎn)真菌α-淀粉酶酶活力作為發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的指標(biāo)，對發(fā)酵培養(yǎng)基的成份及發(fā)酵條件進行整體優(yōu)化，使發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化到產(chǎn)酶活力最大。

1.2.4.1 麩皮添加量對產(chǎn)酶的影響

麩皮占總固態(tài)原料的比例為60%、65%、70%、75%，則玉米粉所占比例分別為40%、35%、30%、25%，其它組分保持不變，滅菌后，接種孢子懸液， 30 ℃培養(yǎng)96 h，發(fā)酵測定酶活，考察其對菌株產(chǎn)酶的影響，采用最優(yōu)添加比例作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源進行后續(xù)實驗。

1.2.4.2 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

分別用硫酸銨、尿素、草酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、玉米漿等量代替固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，接種孢子懸液，30 ℃培養(yǎng)96 h，測定酶活力。每種氮源設(shè)置3個重復(fù)，取其平均值作為實際酶活力。

1.2.4.3 培養(yǎng)基起始pH對產(chǎn)酶的影響

將固體培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)整為pH為3、4、5、6、7，滅菌后，孢子接種培養(yǎng)于30 ℃恒溫箱72 h，發(fā)酵測定酶活，采用最優(yōu)初始pH值作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值。

1.2.4.4 固體培養(yǎng)基外加入水量對產(chǎn)酶的影響

將固體培養(yǎng)基配制時，按照固體物質(zhì)與外加水的重量體積比分別為1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8配制，滅菌后孢子接種，培養(yǎng)于30 ℃恒溫箱72 h，測定酶活。

1.2.4.5 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分的正交優(yōu)化

選擇培養(yǎng)基組成成份中影響較大的四個因素即麩皮與玉米粉比例、硫酸銨加入量、外加水量、初始pH為實驗因素，進行四個因子的三水平正交試驗，所選因素的代碼、水平代碼及實際取值如表1所示。

表1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交試驗的因素水平表

1.2.5 酶活力的測定方法

1.2.5.1 真菌α-淀粉酶測定[11]

酶活力定義：在上述條件下反應(yīng)30 min，反應(yīng)液中產(chǎn)生相當(dāng)于10 mg葡萄糖的還原糖所需的酶量定義為1個淀粉糖化酶活力單位。

淀粉糖化酶活力按式(1)計算

酶活力(U/g) = (T0-T30)×f×1.62×1/10×n (1)

式中：T30：酶反應(yīng)液滴定消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

T0：空白溶液滴定消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

f：0.05 mol/L硫代硫酸鈉溶液濃度的校正系數(shù);

1.62：換算系數(shù)；

1/10：該分析方法的常數(shù)(相當(dāng)于10 mg葡萄糖的還原糖)；

n：樣品的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 聯(lián)合誘變對孢子致死率的影響

以黑曲霉（）AS381為出發(fā)菌株，先采用微波誘變，然后進行硫酸二乙酯(DES)聯(lián)合誘變，以期獲得高產(chǎn)菌株。

2.1.1 微波誘變致死率

黑曲霉孢子懸液經(jīng)2400 Hz 70 W微波照射不同時間后，取樣稀釋，傾注培養(yǎng)，30 ℃，48 h，計算致死率，繪制曲線，結(jié)果如圖1。由圖1可見，隨著微波處理時間的延長，孢子致死率越高，上16 s之后孢子致死率達到90%以上。一般認為，致死率在90%~95%之間突變率最高。采用孢子致死率達到80%~85%的致死劑量時，正突變率較高[10]，因此擬采用微波誘變時間為16 s。

微波處理時間(s)

2.1.2 硫酸二乙酯（DES）誘變致死率

黑曲霉孢子經(jīng)DES（濃度為0.05%）處理不同時間后，取樣稀釋，傾注培養(yǎng)，30 ℃，48 h，計算致死率，結(jié)果如圖2。如圖2，誘變15~30 min時，隨時間的增加，致死率上升；在30 min以后，致死率達到92%左右。

DES處理時間(s)

2.1.3 微波與硫酸二乙酯（DES）聯(lián)合誘變致死率

黑曲霉孢子經(jīng)微波處理16 s后再由DES處理不同時間后，取樣稀釋，傾注篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，計算致死率。結(jié)果如圖3，聯(lián)合誘變效果明顯，孢子經(jīng)DES誘變處理20 min后，致死率達到92.91%以上，致死效果顯著。

復(fù)合誘變處理時間(s)

2.2 誘變菌種的篩選

將黑曲霉AS318孢子通過微波16 s誘變，然后由DES處理20 min，離心洗滌兩次后涂布于含有淀粉的篩選培養(yǎng)基中。已有研究經(jīng)驗表明，在淀粉培養(yǎng)基平板上生長的微生物，如果其菌落所產(chǎn)透明圈較明顯，且菌落直徑、所產(chǎn)透明圈直徑和二者之比較大，則為真菌α-淀粉酶高產(chǎn)菌株，見圖4。采用透明圈法進行初篩，從微波誘變中篩選挑取3株菌為MW-161、MW-182、MW-163，從DES誘變種篩選挑取2株菌DES-304、DES-305，從微波和DES復(fù)合誘變中篩選挑取4株菌MD-64、MD-17、MD-58、MD-9。

圖4 菌株MD-17在篩選培養(yǎng)基平板上所產(chǎn)透明圈

選取初篩結(jié)果較好的9株菌株進行固體發(fā)酵復(fù)篩, 結(jié)果如表2。

表2 固態(tài)發(fā)酵α-淀粉酶復(fù)篩結(jié)果

從表2中看出，聯(lián)合誘變處理所獲得的四株菌產(chǎn)酶活力均高于單一誘變處理，證明聯(lián)合誘變處理具有協(xié)同作用，效果優(yōu)于單一誘變處理。挑選獲得兩株高產(chǎn)菌MD-64、MD-17，其固態(tài)發(fā)酵酶活力分別為4049 U/g和4190 U/g。

將兩株高產(chǎn)菌經(jīng)過12 次傳代培養(yǎng)后，黑曲霉MD-17仍保留了較高的真菌α-淀粉酶產(chǎn)酶能力，具有較好的遺傳穩(wěn)定性，將其作為后續(xù)試驗的出發(fā)菌株。

2.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶的工藝優(yōu)化

2.3.1不同碳源比例對黑曲霉MD17產(chǎn)酶的影響

碳源中麩皮由于富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等成分，既為微生物提供碳源又是氮源，而且在潮濕條件下能保持較松散的狀態(tài)，利于空氣擴散，是固態(tài)發(fā)酵的常用原料。但麩皮過多，培養(yǎng)基粘性增大，不利于透氣，影響酶的生產(chǎn)和產(chǎn)量。

配制固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基添加麩皮占總固態(tài)原料的比例為60%、65%、70%、75%，則玉米粉所占比例分別為40%、35%、30%、25%，接種后培養(yǎng)72 h，測其酶活力。固態(tài)發(fā)酵麩皮添加比例在65%~75%時菌株的生長都很旺盛，由圖5可見其中加入70%的麩皮可以使產(chǎn)酶活力達到最高，這可能是因為麩皮中含有微量的微生物生長促進因子。當(dāng)添加量為65%以上，生長因子刺激菌體生長旺盛，從而使菌體產(chǎn)酶增加；而當(dāng)麩皮添加量超過75%以后物料粘性增加，影響固態(tài)發(fā)酵過程中氧的傳質(zhì)，對菌體產(chǎn)酶產(chǎn)生了一定的負作用，表現(xiàn)出發(fā)酵產(chǎn)酶活力低的現(xiàn)象。所以，麩皮與玉米粉的添加比例以7:3為宜。

麩皮添加量(%)

2.3.2 不同氮源對黑曲霉MD17產(chǎn)酶的影響

氮源對微生物的生長有重要作用，主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)。添加氮源一方面是為了滿足菌株的快速生長，另一方面是為了調(diào)節(jié)碳氮比，保證菌株的正常生長。向培養(yǎng)基中分別添加不同種類的氮源，進行固態(tài)發(fā)酵試驗，結(jié)果如圖6。由圖6可以看出，在氮元素添加量相同的情況下，以硫酸銨為氮源時菌株的產(chǎn)酶活性顯著高于其它氮源。

不同氮源

2.3.3 培養(yǎng)基起始pH對黑曲霉MD17產(chǎn)酶的影響

由表3可以看出，起始pH為5時，發(fā)酵效果最好，酶活力最高。初始pH = 6、pH = 7的條件下生長情況良好，但產(chǎn)酶活力未達到最高值，可見該菌株的pH值適應(yīng)性較強，起始pH對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較大，應(yīng)控制在pH = 5。

表3 初始 pH對產(chǎn)酶的影響

2.3.4 料水比對黑曲霉MD17產(chǎn)酶的影響

固態(tài)培養(yǎng)基含水量過高，滅菌后培養(yǎng)基容易結(jié)塊成團，通氣狀況差不利于產(chǎn)酶；培養(yǎng)基含水量過低，菌株生長不良，產(chǎn)酶量低。圖7顯示了不同料水比下菌株MD-17在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上的產(chǎn)酶情況。從圖7中可知，培養(yǎng)基中水分含量對菌株產(chǎn)酶有明顯影響，當(dāng)料水比為1:1.5時，產(chǎn)酶水平達到最高。

基質(zhì)/外加水量

2.3.5 正交實驗結(jié)果分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗法對麩皮和玉米粉的添加比例、硝酸銨添加量、外加水量、初始pH四個影響因素進行優(yōu)化，結(jié)果如表4和表5所示。

經(jīng)極差與方差分析，從表4和表5可知，不同碳源比例是主要的影響因素，此外各因素對產(chǎn)酶影響次序為A > B > C > D。最佳組合是A3B3C3D1，不在正交試驗內(nèi)，為驗證正交試驗結(jié)果，按最佳組合的配方進行驗證試驗，結(jié)果最佳組合酶活力為6011 U/g?？梢姡凑环治鏊米罴呀M合制備培養(yǎng)基，進行發(fā)酵產(chǎn)酶量更高。

表4 正交試驗結(jié)果及極差分析

表5 正交試驗酶活的方差分析

3 小結(jié)

采用聯(lián)合誘變先經(jīng)微波處理16 s由硫酸二乙酯誘變20 min篩選出一株黑曲霉高產(chǎn)菌株 MD-17。在此基礎(chǔ)上通過單因素和多因素正交實驗得到黑曲霉MD-17 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)真菌淀粉酶的最佳條件，麩皮：玉米粉= 7:3；硫酸銨：0.6%；初始pH = 5；料水比1:1.5。在此條件下，真菌α-淀粉酶的酶活力達到6011 U/g濕曲。

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Mutation breeding and Solid-state fermentation Conditions Optimization ofWITH high yield OF α-amylase

BAO Yong-yang1,3, WANG Lu1,*WANG De-pei1,2

(1.College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China; 2.Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Tianjin 300457, China;3. Tianjin Damei Technology Company, Tianjin 300457, China)

The fungalamylase has the characteristic of mild hydrolusis conditions and acid-resistance, and a wide range of application. By composite mutagenesis of microwave mutagenesis and diethyl sulfate treatment, isolate with high yield of α-amylase was screened and the solid-state fermentation conditions were optimized. The results showed that,MD-17 was obtained after 16 s microwave mutagenesis and 20 min diethyl sulfate treatment.The optimal solid-state fermentation conditions followed asbran:corn flour= 7:3; (NH4)2SO4:0.6%; initial pH 5;solid material : water 1:1.5. Fungal α-amylase enzyme activity could reached the highest 6011 U/g.

; α-amylase; mutation breeding; solid-state fermentation

1674-8085(2015)01-0040-06

TQ925+.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.008

2014-06-05；修改日期：2014-12-12

天津市科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項目(09ZXCXSH04400)

鮑勇陽(1981-)，男，天津人，碩士，主要從事有機酸發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵酶制劑研究(E-mail:byy0007@gmail.com);

王 露(1987-)，男，湖南衡陽人，碩士生，主要從事有機酸發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵酶制劑研究(E-mail:294979404@qq.com);

*王德培(1972-)，女，遼寧錦州人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事有機酸發(fā)酵和發(fā)酵飼料及固態(tài)發(fā)酵酶制劑研究(E-mail:wangdp@tust.edu.cn).