朱雙寧 朱辰嫻 俞菊華, 李紅霞 唐永凱 李建林于 凡 劉駿恂

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214081;2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種重點實驗室, 無錫 214081)

魚類是人類 n-3高不飽和脂肪酸(High unsaturated fatty acids, HUFA)的動物源, 研究表明n-3HUFA中DHA和EPA在預(yù)防人類心血管疾病、腦神經(jīng)發(fā)育等方面有著重要作用[1], 因此, 魚類肌肉中 n-3PUFAs含量以及n-6/n-3PUFA的比值, 為評價魚類營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織(FAO)對于脂肪酸 n-6/n-3營養(yǎng)素推薦量比值為(5—10)︰1, 而在當(dāng)今的飲食條件下, 人們對n-6PUFAs的攝入通常是過量的, n-3PUFAs相對不足。盡管海水魚類具有豐富的 n-3PUFAs, 隨著海洋捕撈漁業(yè)的停滯發(fā)展, 需要養(yǎng)殖魚類來填補(bǔ)人類對n-3 HUFA日益增加的需求, 改良和培育n-3HUFA含量高、n-3/n-6PUFA比值合理的新型養(yǎng)殖品種已經(jīng)受到重視。另一方面, 肌內(nèi)脂肪 (Intramuscular fat, IMF)可增加肉質(zhì)的柔嫩感并且是肉質(zhì)香味的重要前提, 沉積在肌肉內(nèi)的脂肪是肉類特征性香味的來源[2,3]。所以, 研究魚類肌肉中FA組成、含量以及代謝相關(guān)的分子機(jī)制, 將為進(jìn)一步篩選相關(guān)分子標(biāo)記、選育有利于人類健康的養(yǎng)殖品種提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

載脂蛋白(apolipoprotein, Apo)主要由肝臟和腸合成并結(jié)合在脂質(zhì)上, 在保持脂蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)酶的活性以及在循環(huán)系統(tǒng)中對脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、攝取過程扮演重要角色[4]。載脂蛋白CI (Apolipoprotein CI, Apo-C-I)是目前所發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白家族中分子量最小的成員, 僅為 6.6 kD,主要分布于乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)的表面。有研究報道, Apo-C-I作用于脂質(zhì)表面, 通過激活卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(Lecithincholesterol acyltransferase, LCAT)[5,6], 并抑制脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase, LPL)[7]及其他脂肪代謝酶的活性參與調(diào)節(jié)血漿脂蛋白代謝; 此外, Apo-C-I還可抑制肝臟膽固醇受體對富含甘油三酯脂蛋白的攝取, 使富含甘油三脂的脂蛋白延時清除[5,8]?？梢? Apo-C-I在脂類代謝方面有著重要的調(diào)控作用。與哺乳動物不同, 魚類利用糖類的能力很低, 主要以脂類作為能量來源, 因此脂質(zhì)代謝和脂蛋白生理機(jī)能對于魚類內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定非常重要。目前魚類Apo-C-I基因的研究不是很多, 已在GenBank中登錄有斑馬魚(Danio rerio, XR_045030.4)、朝鮮(Hemibarbus mylodon, FJ170109.1)、稀有鯽(Gobiocypris rarus)[9]、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[10]等。研究發(fā)現(xiàn),Apo-C-I在斜帶石斑魚胚胎期和仔魚早期的卵黃膜上高表達(dá), 表明該基因在卵黃降解和卵黃營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)方面有重要作用[10]; Nynca等[11]發(fā)現(xiàn)Apo-C-I是虹鱒(Rainbow trout)精液的重要成分, 并認(rèn)為其與精子包膜的防護(hù)性有關(guān)。王春玲等[9]在稀有鯽的肝臟、脾臟、肌肉、腸等主要組織均檢測到了Apo-C-I的表達(dá), 并認(rèn)為該基因可作為Cd 污染的分子指標(biāo)?？梢夾po-C-I有多種生理作用, 但魚類中Apo-C-I與IMF、脂肪酸組成的關(guān)系還沒見報道。

鯉(Cyprinus carpio)分布廣, 產(chǎn)量高, 遺傳多樣性豐富, 僅我國就有 10多個地理種群, 經(jīng)過地理種群間雜交培育的具有新特征的鯉品種也比較多。建鯉(Cyprinus carpio var. jian)是人工培育的體型長、生長快的養(yǎng)殖良種[12],而荷包紅鯉(Cyprinus carpio var. wuyuanensis)則是在江西原有地理種群基礎(chǔ)上, 經(jīng)過多代選育, 具有肉質(zhì)細(xì)嫩、紅色體表、型如荷包的優(yōu)質(zhì)種群, 這兩種鯉形態(tài)、肉質(zhì)差異較大。由于魚類的肌肉脂肪含量和脂肪酸組成與人類飲食營養(yǎng)密切相關(guān), 所以篩選了影響這兩個指標(biāo)的基因, 闡明相關(guān)的分子機(jī)制, 將為選育相關(guān)性狀的優(yōu)良養(yǎng)殖品種奠定基礎(chǔ)。由于對相同養(yǎng)殖品種肉質(zhì)差異個體的選擇難度較大, 因此選擇養(yǎng)殖在同一池塘的建鯉和荷包紅鯉進(jìn)行比較分析。該研究結(jié)果再一次驗證了鯉基因組中存在 2個重復(fù)基因[13], 首次報道了兩鯉品種肌肉脂肪含量和脂肪酸組成方面存在明顯差異, 最后, 通過比較 Apo-C-1s在兩品種鯉的組織表達(dá)差異, 表明 Apo-C-1s對肌肉脂肪含量有影響, 可作為篩選相關(guān)分子標(biāo)記的目標(biāo)片段。本實驗結(jié)果也可為研究其他動物的 Apo-C-1對脂肪代謝的影響及篩選肌肉脂肪相關(guān)分子標(biāo)記提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗用的建鯉和荷包紅鯉繁殖于2012年4月, 飼養(yǎng)于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地,同池塘混養(yǎng)。于2013年3月27日取建鯉35尾, 平均體重(400.09±85.65) g; 荷包紅鯉 26尾, 平均體重(361.8±68.3) g。

1.2 樣品采集

使用丁香油麻醉實驗魚后, 從尾靜脈采血, 取去除鱗片和表皮的背部肌肉(頭后部、背鰭前、側(cè)線上區(qū)域的白肌)(20—50) g, 用錫箔包好放入–20℃冰箱, 用于水分和粗脂肪測定, 另保存部分肌肉和肝臟入液氮中預(yù)冷,然后放入–80℃冰箱, 用于RNA抽提。并取6尾鯉的心臟、腦、腎臟、前腸、性腺等組織, 編號并放入液氮中冷凍后,轉(zhuǎn)藏于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肌肉粗脂肪和脂肪酸的測定

將肌肉絞碎至肉糜狀, 稱重后置于預(yù)先洗凈烘干稱重的玻璃皿中, 置于烘箱中75℃烘20h, 然后, 105℃繼續(xù)烘 3h后, 移入干燥器冷卻并再次稱重, 計算肌肉水分含量, 用研磨粉碎機(jī)(德國, IKA A11型)研磨肌肉至粉末狀。105℃再次烘干3h后, 取干重為1 g左右的肌肉粉末進(jìn)行粗脂肪含量測定, 儀器為 ANKOM XT15i型全自動脂肪分析儀, 操作步驟按照脂肪抽提儀推薦方法進(jìn)行。

脂肪酸由江南大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)國家重點實驗室測定, 分析采用氣相色譜-質(zhì)譜方法, 條件如下: 分析儀器:GC-2010;Shimadzu, Kyoto, Japan; 色譜柱: VF-23ms,Varian, USA, 毛細(xì)柱, 規(guī)格: 30 m×0.25 mm×0.25 μm; 色譜條件: 氫火焰離子化檢測器(FID)氫氣流45 mL/min, 空氣流量 500 mL/min, 氮氣為載氣, 其流量為 60 mL/min,尾吹45 mL/min。采取程序120 ℃ 3min, 10 ℃ /min 升溫到190℃, 然后 2℃/min升溫到 220℃, 保持 15min; 檢測器和進(jìn)樣孔的溫度為 250℃, 脂肪酸標(biāo)樣由 SIGMA公司提供。脂肪酸的百分含量計算采用面積歸一化法。

1.4 RNA和DNA抽提

RNA抽提使用E.Z.N.A.TMHP Total RNA Kit (OMEGA)并按照其推薦方法進(jìn)行, RNA使用紫外分光光度計(Eppendorf)測定濃度, A260/280介于1.9—2.0, 稀釋RNA濃度為1 μg/μL于–80℃保存?zhèn)溆? DNA抽提使用酚-氯仿法,A260/2801.8左右。

1.5 CcApo-C-Is基因的克隆

使用NCBI網(wǎng)站中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫檢索已有的斑馬魚 Apo-C-I (XR_045030.4), 在鯉肝臟轉(zhuǎn)錄組中篩選到斑馬魚 Apo-C-I同源序列, 根據(jù)此序列設(shè)計分離全長cDNA的引物ApoCI-TF和ApoCI-TR, 考慮到鯉染色體數(shù)是鯉科模式魚類斑馬魚的 2倍, 通過挑選多個克隆并測序, 結(jié)果分離到兩種 cDNA。根據(jù)已分離到的序列, 參照斑馬魚 Apo-C-I基因設(shè)計引物, 分段分離兩 CcApo-C-Is的DNA序列, 并進(jìn)行拼接。實驗所用引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成, 具體信息見表1。

以2 μg肝臟總RNA為模板, 使用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(大連, TaKaRa), PolyT為引物, 在總體積為20 μL的體系進(jìn)行RT反應(yīng), 合成cDNA第一鏈, 然后以2 μL RT液為模板, 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增, PCR反應(yīng)液依據(jù)Taq酶(天根生化科技有限公司)說明書要求, ApoC I-TF和ApoC I-TR為引物擴(kuò)增CcApo-C-Is。PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性2min; 94℃變性30s, (55—65)℃退火40s, 72℃延伸1min, 30個循環(huán); 72℃延伸8min, 4℃保存, 其中退火溫度根據(jù)引物Tm值確定, 延伸時間根據(jù)擴(kuò)增片段大小確定。鯉ApoC-Is DNA序列分別使用引物對ApoC Ia -E1F/E3R、ApoC Ia -E2F/E4R以及ApoC I-TF /ApoC Ib -E2R、ApoC Ib-E2F/ ApoC I-TR獲得, 建鯉和荷包紅鯉基因組DNA模板100 μg, 反應(yīng)液和反應(yīng)條件如上。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、分離后, 切取所需條帶, 用凝膠回收試劑盒(上海申能博彩生物有限公司)回收DNA。回收產(chǎn)物與pMD18-T載體(大連, TaKaRa)連接, 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E. coli) DH5α敏感態(tài)細(xì)胞中并在LB Amp+平板篩選陽性克隆, 抽提質(zhì)粒, EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切檢測后, 陽性克隆送至上海鉑尚生物公司測序。

表1 分離CcApo-C-Is基因所使用的引物Tab. 1 Primers used in isolation of CcApo-C-Is gene

1.6 序列分析

使用 DNA star軟件查找開放閱讀框(ORF)并翻譯成氨基酸序列, 運(yùn)用 SignalP4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽位置, 用Clustal W方法與其他動物Apo-C-I氨基酸序列進(jìn)行比較, 并用Mega5.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 半定量RT-PCR檢測CcApo-C-Is的表達(dá)水平

由于兩CcApo-C-Is cDNA序列一致性很高, 推測功能差異不是很大, 此外特異定量引物的設(shè)計也有難度, 本實驗設(shè)計了共用引物, 其中正向引物ApoCIs-DF設(shè)計在外顯子1, 反向引物ApoCIs-DR設(shè)計在外顯子2、3的交界處, 以排除DNA的干擾, 使用熒光定量PCR, 分析鯉CcApo-C-Is基因在肝臟和肌肉組織的表達(dá)。肝臟、肌肉樣品來自肌肉脂肪酸C18:1含量低于20%的12個建鯉個體, 高于20%的12個荷包紅鯉個體。以0.5 μg總RNA為模板, 根據(jù)M-MLV(大連, TaKaRa)進(jìn)行RT反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)體系為20 μL, 其中cDNA 2 μL, 引物各0.8 μL (10 μmol/L), 根據(jù)SYBR?Pemix Ex TaqTMⅡ(大連, TaKaRa)使用說明, 在TaKaRa TP800型實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量RT-PCR實驗。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30s; 95℃變性5s, 60℃復(fù)性20s, 35個循環(huán), 最后溶解曲線檢測確定產(chǎn)物的特異性。參照Winner等方法[14],用2–DDCt法計算CcApo-C-Is基因的轉(zhuǎn)錄水平, 內(nèi)標(biāo)基因為EF-1 (elongation factor1)。

1.8 統(tǒng)計分析

建鯉和荷包紅鯉肌肉脂肪含量、脂肪酸含量、熒光定量結(jié)果差異性比較采用SPSS 18.0中的獨立樣本T檢驗分析(Independent-samples T test), 差異顯著水平為(P<0.05),差異極顯著水平為(P<0.01), 數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SEM)表示。

2 結(jié)果

2.1 建鯉和荷包紅鯉肌肉含水量、粗脂肪及脂肪酸組成

同池混養(yǎng)的 1齡建鯉和荷包紅鯉, 建鯉體重[(400.09±85.65) g]顯著高于荷包紅鯉[(355.75±63.97) g](P<0.05)。背部肌肉脂肪、水分含量測定結(jié)果顯示, 建鯉肌肉粗脂肪顯著低于荷包紅鯉(P<0.01), 水分高于荷包紅鯉(P<0.05)(表 2)。脂肪酸組成測定結(jié)果顯示, 有19種脂肪酸(表2), 其中, 飽和脂肪酸(SFA)5種, 以棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)為主; 不飽和脂肪酸(UFA)13種, 單不飽和脂肪酸(MUFA)含量最多的為油酸(C18:1), 多不飽和脂肪酸(PUFA)主要為亞油酸(C18:2n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6)、二十碳五烯酸(C20:5n-3,EPA)、二十二碳四烯酸(C22:4n-3)、二十二碳六烯酸(C22:6n-3, DHA)。

建鯉肌肉∑SFA占總脂肪酸的 26.99%, 高于荷包紅鯉(25.62%)(P<0.01), ∑MUFA(19.97%)低于荷包紅鯉(28.20%)(P<0.01), 而∑PUFA 恰恰相反, 建鯉(48.94%)顯著高于荷包紅鯉(43.38%)(P<0.01)。高不飽和脂肪酸(HUFA)中, 建鯉的DHA和EPA總量(13.16%)顯著高于荷包紅鯉(8.26%)(P<0.01), 建鯉、荷包紅鯉的∑n-3PUFA/∑n-6PUFA比值分別為0.50、0.35, 差異顯著(P<0.01)。

2.2 油酸(C18:1)與IMF含量及DHA(C22:6n-3)的關(guān)系

將建鯉、荷包紅鯉所有測定樣品中C18:1含量分別與IMF、DHA做散點圖及線性回歸分析, 結(jié)果顯示 IMF與油酸(C18:1)呈正相關(guān)(R2=0.60), 回歸關(guān)系顯著(P<0.01) (圖1A); DHA與C18:1呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(R2=0.73), 回歸關(guān)系同樣顯著(P<0.01) (圖1B)。圖中建鯉、荷包紅鯉區(qū)分明顯, 建鯉肌肉C18:1和脂肪含量低, DHA含量較高; 相反, 荷包紅鯉肌肉C18:1和脂肪含量較高, DHA含量較低。

2.3 CcApo-C-Is序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化

建鯉、荷包紅鯉中均獲得兩種CcApo-C-Is基因序列,長度分別為 1636、1576 bp, 記作CcApo-C-Ia(GenBank登錄號: KJ011130)和 CcApo-C-Ib (GenBank登錄號:KJ011131), 序列分析表明, 這兩個基因與斑馬魚一樣,由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成,翻譯起始密碼子(ATG)位于外顯子2, 終止密碼子(TAA)位于外顯子4; 兩基因內(nèi)含子序列和長度有較大差異, 閱讀框(ORF)長度一致, 均為 255 bp, 一致性 90%, 編碼氨基酸 84個,相似性為90%。CcApo-C-Is與斑馬魚Apo-C-I cDNA (XR_045030.4)相似性均在 80%左右, 氨基酸相似性分別為 86%、89%,建鯉和荷包紅鯉序列一致。經(jīng)分析, CcApo-C-Is中, 前20個氨基酸為信號肽, 后 64個氨基酸構(gòu)成成熟肽, 分子量為7.6 kD, 理論等電點(PI)分別為4.61、5.08, 兩種蛋白屬不穩(wěn)定型蛋白質(zhì)且親水性差。

表2 建鯉、荷包紅鯉肌肉水分、粗脂肪含量及脂肪酸組成(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab. 2 Contents of water, crude fat and fatty acid profiles in muscle of jian carp and red purse carp (Mean±SE)

圖1 油酸(C18:1)與IMF含量(A)、DHA含量(B)的關(guān)系Fig. 1 Relation of Oleic acid (C18:1) with content of intramuscular fat (A) and DHA (B)

CcApo-C-Is與鯉科魚類斑馬魚、稀有 鯽、朝鮮 相似性 89%—92%, 與鱸形目的羅非魚(Oreochromis niloticus)、金頭雕(Sparus aurata)和鮭形目大西洋鮭(Salmo salar)的相似性均為 70%左右, 與兩棲類的非洲爪蛙(Xenopus laevis)和哺乳動物小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)等的差異較大, 相似性在 50%—60%。對來自不同物種的Apo-C-I, 包括不同魚類如鯉科的斑馬魚、稀有、朝鮮, 鱸形目的羅非魚、金頭雕、斜帶石斑魚, 鮭形目大西洋鮭, 鳉 鳉形目青 (Oryzias latipes), 兩棲類的非洲爪蛙, 爬行類的揚(yáng)子鱷(Alligator sinensis)、綠變色蜥(Anolis carolinensis), 以及哺乳類的鼠、人等的 Apo-C-I進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 2)。結(jié)果顯示, 魚類Apo-C-I獨立形成一支, 其中鯉科魚類先和鮭形目的大西洋鮭合成一小支, 然后再與鳉形目和鱸形目構(gòu)成的一支合并, 魚類與其他綱動物的遺傳距離從近到遠(yuǎn)依次是兩棲類、爬行類, 最后是哺乳類。相較于 CcApo-C-Ib,CcApo-C-Ia與朝鮮 、稀有 鯽親緣關(guān)系更近。

圖2 Apo-C-I的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Apo-C-I

2.4 CcApo-C-Is mRNA的組織表達(dá)水平

實時熒光定量結(jié)果顯示鯉CcApo-C-Is在建鯉和荷包紅鯉腦、心臟、腎臟、腸、性腺等組織均能檢測到, 但在肝臟表達(dá)量最高為腦的6倍, 其次是腦, 為心臟和精巢的4倍, 其他組織均微量表達(dá), 表現(xiàn)出較明顯的組織特異性(圖 3)。

圖3 CcApo-C-Is mRNA的組織表達(dá)Fig. 3 Tissues expression pattern of CcApo-C-Is mRNA

2.5 CcApo-C-Is在建鯉、紅鯉肝臟和肌肉的表達(dá)及與C18:1的關(guān)系

建鯉、荷包紅鯉肝臟和肌肉中Apo-C-Is基因表達(dá)比較, 由圖4可以看出, 兩品種鯉肝臟中Apo-C-Is的表達(dá)量均高于肌肉組織(P<0.01)。Apo-C-Is在荷包紅鯉肝臟、肌肉中的表達(dá)量均高于建鯉, 其中肝臟 Apo-C-Is的表達(dá)量差異顯著(P<0.05), 荷包紅鯉是建鯉的 1.5倍(圖 5)肝臟CcApo-C-Is表達(dá)量與 C18:1回歸分析發(fā)現(xiàn), 兩者回歸關(guān)系顯著, 但相關(guān)系數(shù)不高 (P<0.01, R2=0.40)。

圖4 建鯉、荷包紅鯉肝臟和肌肉中CcApo-C-Is基因表達(dá)比較Fig. 4 Expression levels of Apo-C-Is in liver and muscle of C.carpio var. jian and C. carpio var. wuyuanensis

3 討論

3.1 脂肪酸組成及肌內(nèi)脂肪含量

圖5 肝臟CcApo-C-Is基因表達(dá)量與IMF C18:1的相關(guān)性分析Fig. 5 Correlation analysis of CcApo-C-Is expression level in liver with IMF C18:1

魚類肌肉 IMF和脂肪酸組成具有種間差異性, 還受到飼養(yǎng)狀況、季節(jié)因素、性腺發(fā)育程度等多種因素影響[15,16],本研究結(jié)果顯示同池養(yǎng)殖的建鯉和荷包紅鯉 IMF差異顯著, 荷包紅鯉 3.56%顯著高于建鯉 2.28% (P<0.05), 由于養(yǎng)殖條件一致, 本研究認(rèn)為差異來自建鯉和荷包紅鯉的遺傳差異。從養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn), 荷包紅鯉體型肥短, 活動遲緩, 生長明顯比建鯉慢(從本文采集的樣本重量可以看出), 這表明荷包紅鯉活動和生長耗能會比建鯉少, 從而積累的脂肪比較多。本文測定的建鯉、荷包紅鯉脂肪酸組成中∑MUFA(19.97%、28.20%, P<0.01)和∑PUFA(48.94%、43.38%, P<0.01), 分別與羅永康、徐如衛(wèi)等[17,18]報道的鯉∑MUFA(38%—46%)、∑PUFA(25%—29%)差異比較明顯,推測可能與魚的品種、養(yǎng)殖所采用的飼料配方以及樣品采集時間有關(guān)。如本次測定的鯉于初春采樣, 經(jīng)過越冬長期饑餓階段, 鯉體內(nèi)部分 MUFA被氧化用于能量供給, 所以∑MUFA 明顯低。Zajic等[19,20]對鯉選擇性氧化FA的研究表明, 在運(yùn)動過程中或在饑餓開始階段, 魚類消耗脂肪酸時優(yōu)先利用 MUFA來供應(yīng)能量, 而將長鏈 PUFA保存下來, 導(dǎo)致 PUFA比例增加。而∑SFA (26.99%、25.62%, P<0.01)則和羅等報道的∑SFA (24%—28%)相差不大, 原因可能是SFA中95%左右的C16:0、C18:0是魚類可以自身合成的脂肪酸, 雖然也受飼料中脂肪酸含量及其他因素的影響, 但差別不大[21]。

鯉肌肉脂肪酸(FA)組成和肌內(nèi)脂肪(IMF)含量的關(guān)系分析, 可以發(fā)現(xiàn) C18:1與 IMF含量正相關(guān)(R2=0.61), 已有分析顯示, 鯉C18:1主要存在于三酰甘油(TAG)內(nèi), 且鯉肌肉脂肪中TAG的含量高達(dá)60%—80%[15,19], 這些和本文發(fā)現(xiàn)的C18:1與IMF的關(guān)系一致, 荷包紅鯉IMF含量高于建鯉, C18:1的含量也比建鯉高。此外, 本研究首次顯示鯉C18:1與DHA呈明顯負(fù)相關(guān)(R2=0.73), 這與杜冰在破囊弧菌中的結(jié)果一致[22]。由于微生物體內(nèi)多不飽和脂肪酸的合成機(jī)制與高等動物基本一致, 杜冰在破囊弧菌培養(yǎng)基中添加不同含量的C18:1, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), C18:1含量越高, DHA的合成越少, 并認(rèn)為可能是油酸抑制了脫飽和酶的活性或阻礙了脫飽和酶的合成所致。本實驗發(fā)現(xiàn)荷包紅鯉與建鯉脂肪酸組成的差異主要在C18:1和DHA的比例。雖然建鯉IMF比荷包紅鯉低, 但建鯉肌肉中DHA、EPA含量相對較高, n-3/n-6PUFA比值(0.50±0.10)也比荷包紅鯉(0.35±0.08)高, 從對人體健康角度考慮, 建鯉具有更高的營養(yǎng)價值。

3.2 CcApo-C-Is基因序列和組織表達(dá)

Apo-C-1在脂質(zhì)運(yùn)輸和攝取過程中起著重要作用,本實驗在鯉肝臟中分離到了兩種 CcApo-C-Is基因, 與斑馬魚同源基因有較高的相似性, 兩者ORF序列相似性較高,但內(nèi)含子序列和長度差異明顯, 可判定是來自兩個不同位點。這再一次證明了鯉基因組中存在兩種重復(fù)基因,這與已有的鯉功能基因研究結(jié)果一致, 是鯉特有的基因加倍事件[13]。荷包紅鯉和建鯉 CcApo-C-Is的序列一致,特別是閱讀框部分, 因此, 從基因序列上不能反映出鯉品種的分化。Apo-C-I進(jìn)化樹較好地反映了動物由水生到陸生進(jìn)化過程, 可作為系統(tǒng)分類的分子標(biāo)記。此外CcApo-C-Ia和CcApo-C-Ib與稀有 鯽、朝鮮 、斑馬魚Apo-C-I的遺傳距離不完全一致, 推測是兩基因本身起源存在差異, 或者進(jìn)化過程中所受的選擇壓力不同。熒光定量結(jié)果表明CcApo-C-Is在建鯉、荷包紅鯉主要組織包括肝臟、腦、心臟、腸、性腺、肌肉等中均能檢測到有表達(dá), 其中肝臟豐度最高, 腦次之, 心臟、腎臟、肌肉、腸、性腺等其他組織表達(dá)量較低, 這與人[23]和稀有 鯽[9]的Apo-C-I mRNA主要在肝臟表達(dá)的結(jié)果一致, 也反映了Apo-C-I功能的保守性。

3.3 CcApo-C-Is mRNA的表達(dá)對IMF、肌肉脂肪酸組成的影響

肝臟、肌肉以及腹腔腸系膜組織是魚類主要的脂肪蓄積部位, IMF均勻地分布于肌肉組織中, 其含量是脂肪合成、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和降解三個方面綜合作用的結(jié)果, 機(jī)體可以通過控制相關(guān)酶的活性來調(diào)節(jié)體脂的沉積。本實驗結(jié)果表明 CcApo-C-Is在荷包紅鯉肝臟、肌肉的表達(dá)水平均高于建鯉, 其中肝臟差異顯著(P<0.05)。

肝臟是脂肪酸 β-氧化的重要部位, 也是魚類改變脂肪蓄積的主要調(diào)節(jié)性貯脂器官[24], 魚類肝臟擁有較哺乳動物肝臟更有效的脂質(zhì)攝取能力, 其攝取 TAG脂蛋白的途徑受到限制或其內(nèi)脂肪分解酶的活性受到調(diào)控, 都會不同程度影響脂肪代謝。肝臟攝取TAG脂蛋白殘粒依賴于 Apo-E, Weisgraher等[5]研究認(rèn)為, Apo-C-I能夠置換β-VLDL中的 Apo-E或改變、掩蓋其結(jié)構(gòu)而抑制 Apo-E介導(dǎo)的β-VLDL與LDL受體相關(guān)蛋白(LRP)結(jié)合, 結(jié)果降低了肝臟對富含 TAG脂蛋白的攝取能力, 從而, 增加了外周組織獲得 TAG脂蛋白的機(jī)會。此外, 已有的研究表明Apo-C-I是LPL的一種有效抑制劑[5,7], LPL作為魚類肝臟內(nèi)的一種主要脂肪分解酶, 可水解未被其他組織利用的過量乳糜微粒和 VLDL中的 TAG, 為肝臟提供游離脂肪酸(FFA)[25], 而 Apo-C-I能夠抑制其介導(dǎo)的VLDL-TAG脂解產(chǎn)生FFA過程[26]。Apo-C-I還可與已產(chǎn)生的FFA結(jié)合從而降低了FFA的反應(yīng)活性, 減少了細(xì)胞對其的利用[27]。肝臟中 CcApo-C-Is表達(dá)量過高, 致使肝臟分解代謝脂肪酸受到一定程度的限制。因此, CcApo-C-Is在荷包紅鯉肝臟內(nèi)高表達(dá), 一方面與 Apo-E競爭減少了肝臟TAG的攝取, 另一方面通過抑制LPL酶的活性,減少了肝臟對TAG的分解利用, 結(jié)果有更多的TAG脂蛋白通過血液運(yùn)輸?shù)酵庵芙M織。在對虎河豚(Fugu ocellatus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、真鯛(Pagrosomus major)等[28]魚類研究中表明, 肝臟、腸通過分泌TAG脂蛋白(主要是VLDL-TAG)的方式將吸收或合成的脂質(zhì)通過血液運(yùn)輸?shù)酵庵芙M織, 如在脂肪組織儲存或在肌肉組織氧化。肌細(xì)胞攝取VLDL中的TAG同樣需要LPL的參與, 為其提供非酯化的FA。荷包紅鯉肌肉中CcApo-C-Is的高表達(dá)也可通過抑制LPL酶活及與FFA結(jié)合而降低肌肉組織對脂肪酸的β-氧化水平, 從而使更多的TAG轉(zhuǎn)至肌內(nèi)脂肪組織被重新酯化儲存, 但CcApo-C-Is在肌肉和肝臟的表達(dá)水平差異顯示, CcApo-C-Is在脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)方面的作用更大。

綜上所述, CcApo-C-Is的高表達(dá)導(dǎo)致了荷包紅鯉IMF中TAG相對于建鯉增多, 而C18:1在鯉肌肉TAG中的含量較高[14], 由此推測, CcApo-C-Is的高表達(dá)可能是導(dǎo)致C18:1在荷包紅鯉肌肉比建鯉肌肉中含量高的原因之一。相關(guān)性分析表明, CcApo-C-Is與 C18:1之間存在相關(guān)性(P<0.01),由于影響肌肉C18:1的因子不止CcApo-C-Is一個, 因此相關(guān)系數(shù)不高(R2=0.40)。以上分析表明 CcApo-C-Is的表達(dá)水平對肌肉 C18:1有影響, 但要全面了解荷包紅鯉和建鯉肌肉C18:1差異的機(jī)制, 需要挖掘更多的基因。

4 小結(jié)

本文比較了建鯉與荷包紅鯉IMF和肌肉脂肪酸組成,發(fā)現(xiàn)建鯉DHA、EPA含量優(yōu)于荷包紅鯉, n-3/n-6PUFA的值比荷包紅鯉高, 因此從人類飲食營養(yǎng)方面考慮, 建鯉的脂肪酸組成對人體健康更有益。本文分離了鯉的CcApo-C-Is基因, 并確定其在鯉肝臟表達(dá)最豐富。建鯉、荷包紅鯉肝臟 CcApo-C-Is的轉(zhuǎn)錄水平比較發(fā)現(xiàn)荷包紅鯉的表達(dá)量明顯偏高, 鑒于Apo-C-I與ApoE的競爭性、抑制LPL酶的能力和可與游離FFA結(jié)合的特征, 推測建鯉、荷包紅鯉肝臟和肌肉 CcApo-C-Is的差異是導(dǎo)致兩者肌肉C18:1差異的原因之一。