劉彥彥 邵繼海 劉德明 李錦龍 陳峻峰

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128; 2. 湖南農(nóng)業(yè)作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,長(zhǎng)沙 410128)

隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展, 許多水體呈現(xiàn)富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài), 水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致水體中藻類(lèi)過(guò)度繁殖,在水體中形成水華。20世紀(jì)90年代以來(lái), 我國(guó)淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化日趨嚴(yán)重。2012年中國(guó)環(huán)境狀況公報(bào)顯示, 我國(guó)62個(gè)國(guó)控重點(diǎn)湖泊(水庫(kù))中, Ⅳ以上的水體占有的比例高達(dá)38.7%。一些大型湖泊都先后暴發(fā)了嚴(yán)重的藍(lán)藻水華, 如滇池、太湖等。目前, 城市及周邊的小型水體有90%以上均處于富營(yíng)養(yǎng)化和嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)化水平, 藍(lán)藻水華頻頻暴發(fā)[1,2]。因此藍(lán)藻水華的削減與消除對(duì)于保證水體水質(zhì)安全非常重要。

化學(xué)除藻是目前水體特別是小型水體, 藍(lán)藻水華去除的主要方法, 該方法具有除藻效果好、見(jiàn)效快的優(yōu)點(diǎn)。然而, 絕大部分化學(xué)除藻劑如CuSO4、除草劑等會(huì)給環(huán)境帶來(lái)二次污染[3]。通過(guò)對(duì)水體環(huán)境中藻類(lèi)生長(zhǎng)繁殖機(jī)理的分析, 以及對(duì)各類(lèi)抑藻技術(shù)優(yōu)劣的比較, 生物源抑藻物質(zhì)在抑藻方面的作用相對(duì)于化學(xué)方法具有安全和對(duì)水環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)危害小等優(yōu)點(diǎn), 已引起各國(guó)學(xué)者的高度重視[4]。生物堿是存在于自然界中的一類(lèi)含氮的天然有機(jī)化合物, 具有豐富的結(jié)構(gòu)和生物活性多樣性。白屈菜紅堿是從中草藥白屈菜(Chelidonium majus L)中提取的一種具有顯著生理活性的生物堿, 具有多種藥理學(xué)作用,如抗腫瘤、抑菌、抗炎作用[5]等。銅綠微囊藻是我國(guó)最常見(jiàn)的水華藍(lán)藻種類(lèi), 也是產(chǎn)微囊藻毒素的主要種類(lèi)之一。我們的研究結(jié)果顯示白屈菜紅堿對(duì)銅綠微囊藻具有很強(qiáng)的抑制作用, 因此利用白屈菜紅堿削減水體藍(lán)藻水華具有一定的應(yīng)用潛力[6]。

光合放氧生物的葉綠素光誘導(dǎo)熒光與PSⅡ及反應(yīng)中心電子供體側(cè)和受體側(cè)氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)[7]。Strasser和Strasser[8]在生物膜能量流動(dòng)理論基礎(chǔ)上建立了葉綠素光誘導(dǎo)熒光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)分析方法—JIP-test。JIP-test能較好的反應(yīng)PSⅡ反應(yīng)中心及電子供體側(cè)和受體側(cè)的生理狀態(tài), 現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境脅迫對(duì)藍(lán)藻PSⅡ結(jié)構(gòu)與功能的影響等方面的研究[9,10]。為了研究白屈菜紅堿對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)和光合系統(tǒng)的影響, 本文探討了白屈菜紅堿脅迫下銅綠微囊藻生長(zhǎng)、光合色素含量及葉綠素光誘導(dǎo)熒光動(dòng)力學(xué)特征。本試驗(yàn)為闡明白屈菜紅堿的抑藻機(jī)理提供了重要的信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa NIES-843)來(lái)自于日本國(guó)立環(huán)境研究所。藻株用CT完全培養(yǎng)基培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為光強(qiáng)30 μmol protons/(m2×s), 溫度(25±1)℃, 光周期12h︰12h (L︰D)。白屈菜紅堿(Chelerythrine)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 白屈菜紅堿抑藻試驗(yàn)

用二甲基亞砜配制10、20、40、80、160、320 μg/mL的白屈菜紅堿母液。實(shí)驗(yàn)在250 mL的三角瓶中進(jìn)行,取各濃度的母液100 μL加入到無(wú)菌的CT培養(yǎng)基中, 另取100 μL二甲基亞砜做空白, 再向其中加入用CT培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M. aeruginosa NIES-843, 終體積為100 mL, 白屈菜紅堿最終濃度為0、10、20、40、80、160、320 μg/L, M. aeruginosa NIES-843起始OD680值為0.090。所有處理均置于光強(qiáng)30 μmol protons/(m2×s),溫度(25±1)℃, 光周期12h︰12h(L︰D)條件下培養(yǎng),在實(shí)驗(yàn)的第2、第4、第6天取樣。藻細(xì)胞密度用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。藻細(xì)胞葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素用80%丙酮提取測(cè)定, 測(cè)定藻細(xì)胞OD450、OD645、OD663吸光值, 按照以下關(guān)系式計(jì)算: 葉綠素濃度Ca=12.72×A663—2.7×A645; 類(lèi) 胡 蘿 卜 素 濃 度 Cx.c=4.1×A450—0.0435×Ca[11—12]。M. aeruginosa NIES-843葉綠素光誘導(dǎo)熒光多相瞬態(tài)上升動(dòng)力學(xué)用Handy-PEA (Handy-Plant Efficiency Analyser, Hansatech Instruments, UK)測(cè)定, 熒光測(cè)定前所有樣品暗適應(yīng)15min, 光化光強(qiáng)度為3000 μmol potons/(m2×s), 熒光瞬時(shí)上升曲線(xiàn)的記錄時(shí)間為50 μs—1 s, 采樣速率在前2 ms之內(nèi)是105次/s,2 ms之后為103次/s[6]。

1.3 葉綠素?zé)晒舛嘞嗨矐B(tài)上升動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

根據(jù) Strasser和 Strasser[8]的能量流動(dòng)模型, 分析 PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動(dòng)比活性能參數(shù)(ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC)和 PSⅡ能量分配比率參數(shù)(ψ0、j P0、j E0)。各參數(shù)具體含義如表 1 所示[13]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.1進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析和單因素方差分析(One-Way ANOVA, LSD), P小于0.05被認(rèn)為具有顯著差異。

表1 葉綠素?zé)晒舛嘞嗨矐B(tài)上升動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab. 1 Parameters derived from polyphasic rise in chlorophyll fluorescence transients

2 結(jié)果

2.1 白屈菜紅堿對(duì)M. aeruginosa NIES-843生長(zhǎng)的影響

圖 1顯示了白屈菜紅堿脅迫下 M. aeruginosa NIES-843在第2和第6天細(xì)胞數(shù)變化情況。在白屈菜紅堿脅迫的第 2天, 當(dāng)濃度為 10 μg/L時(shí), M.aeruginosa NIES-843的生長(zhǎng)即受到顯著抑制。隨著白屈菜紅堿濃度增加, M. aeruginosa NIES-843生長(zhǎng)被抑制的現(xiàn)象也愈加嚴(yán)重。到第6天, 10—80 μg/L白屈菜紅堿脅迫處理組的細(xì)胞數(shù)還是顯著低于對(duì)照,但是10—80 μg/L處理組間無(wú)明顯差異。采用SPSS 13.1分析軟件, 以白屈菜紅堿的濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo), 第2天白屈菜紅堿的生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo), 做回歸分析和統(tǒng)計(jì)推斷, 得到第 2天白屈菜紅堿對(duì) M.aeruginosa NIES-843 生長(zhǎng)的EC50為(30.62±1.32) μg/L。

2.2 白屈菜紅堿對(duì)M. aeruginosa NIES-843細(xì)胞色素含量的影響

圖1 白屈菜紅堿脅迫對(duì)M. aeruginosa NIES-843細(xì)胞數(shù)(a)和生長(zhǎng)抑制率-濃度回歸分析(b)的影響“*”代表 P<0.05; 下同F(xiàn)ig.1 Effect of chelerythrine stress on the cells and growth inhibition rate of M. aeruginosa NIES -843 (a) and the regress analysis of inhibitory rae versus Lg (concentration) on day 2 (b) “*” is P<0.05; the same applies bellow

圖2 白屈菜紅堿脅迫對(duì)M. aeruginosa NIES -843單位細(xì)胞內(nèi)Chl.a含量(a)和類(lèi)胡蘿卜素含量(b)的影響Fig. 2 Effect of chelerythrine stress on the cellular Chl. a contents (a) and cellular carotenoids contents (b) of M. aeruginosa NIES -843

圖2分別顯示了白屈菜紅堿脅迫下M. aeruginosa NIES-843單位細(xì)胞內(nèi) Chl. a和類(lèi)胡蘿卜素含量在第2和第6 天的變化情況。單位細(xì)胞內(nèi)Chl. a與類(lèi)胡蘿卜素含量變化的趨勢(shì)基本相似。當(dāng)白屈菜紅堿濃度為10和20 μg/L時(shí), M. aeruginosa NIES- 843單位細(xì)胞內(nèi)Chl. a與類(lèi)胡蘿卜素含量在第2 與第6 天均顯著高于對(duì)照。在40 μg/L時(shí), M. aeruginosa NIES-843單位細(xì)胞內(nèi)Chl. a含量在第2 和第6 天均顯著高于對(duì)照,其類(lèi)胡蘿卜素含量只有在第2 天顯著高于對(duì)照。當(dāng)白屈菜紅堿濃度為 80和 160 μg/L時(shí), M. aeruginosa NIES-843單位細(xì)胞內(nèi)Chl. a與類(lèi)胡蘿卜素含量都低于對(duì)照, 并且在160 μg/L時(shí), M. aeruginosa NIES-843單位細(xì)胞內(nèi)Chl. a含量顯著低于對(duì)照, 在第6 天, 該濃度下其類(lèi)胡蘿卜素含量也顯著低于對(duì)照。

2.3 白屈菜紅堿脅迫下 M. aeruginosa NIES-843葉綠素光誘導(dǎo)熒光動(dòng)力學(xué)特征

圖 3分別顯示了白屈菜紅堿脅迫下 M. aeruginosa NIES-843 葉綠素光誘導(dǎo)熒光多項(xiàng)瞬態(tài)上升動(dòng)力學(xué)特征在第2和第6 天的變化情況, 均呈典型的O-J-I-P特征。各個(gè)濃度處理的葉綠素光誘導(dǎo)熒光多項(xiàng)瞬態(tài)上升動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)均有典型的 J、I、P三個(gè)波峰。在第 2天, 各個(gè)濃度處理下的 M. aeruginosa NIES-843 葉綠素光誘導(dǎo)熒光都低于對(duì)照, 10、20 μg/L處理的OJIP曲線(xiàn)基本重合。到了第6天, 這種趨勢(shì)并沒(méi)有什么變化, 并且隨著濃度的升高, 低于對(duì)照的幅度越大。

2.4 白屈菜紅堿對(duì)M. aeruginosa NIES-843 PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動(dòng)比活性能的影響

圖4分別顯示了白屈菜紅堿脅迫下M. aeruginosa NIES-843 PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動(dòng)比活性能參數(shù)(ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC)在第 2和第 6 天的變化情況。在白屈菜紅堿脅迫后的第 2 天, 白屈菜紅堿濃度為40 μg/L時(shí), M. aeruginosa NIES-843 PSⅡABS/RC 值顯著高于對(duì)照, 濃度為40、80 μg/L時(shí),M. aeruginosa NIES-843 PSⅡET0/RC 值顯著高于對(duì)照; 到了第 6 天, 白屈菜紅堿濃度為 20 μg/L時(shí)TR0/RC、ET0/RC 值都顯著低于對(duì)照, 白屈菜紅堿濃度為80 μg/L時(shí), ABS/RC、TR0/RC 值顯著低于對(duì)照, 而ET0/RC 值卻顯著高于對(duì)照。

圖3 白屈菜紅堿脅迫下M. aeruginosa NIES -843葉綠素光誘導(dǎo)熒光動(dòng)力學(xué)特征 (a. 2d; b. 6d)Fig. 3 Chlorophyll fluorescence transients of M. aeruginosa NIES -843 under chelerythrine stress (a. 2d; b. 6d)

圖4 白屈菜紅堿脅迫對(duì)M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動(dòng)比活性能參數(shù)的影響(a: 2d; b: 6d)Fig. 4 Effect of chelerythrine stress on the parameters of energy fluxes per reaction centre of M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ(a: 2d; b: 6d)

圖5 白屈菜紅堿脅迫對(duì)M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動(dòng)比活性能參數(shù)的影響Fig. 5 Effect of chelerythrine stress on the parameters of energy fluxes per reaction centre of M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ

圖 5顯示了白屈菜紅堿脅迫下 M. aeruginosa NIES-843 PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動(dòng)比活性能參數(shù)(RC/CS0)在第2和第6 天的變化情況。在白屈菜紅堿脅迫后的第 2 天, 白屈菜紅堿濃度為 40 μg/L時(shí), M. aeruginosa NIES-843 PSⅡRC/CS0值顯著低于對(duì)照; 到了第6 天, 白屈菜紅堿濃度為40、80 μg/L時(shí)RC/CS0值都顯著低于對(duì)照。

2.5 白屈菜紅堿對(duì)M.aeruginosa NIES-843 PSⅡ能

量流動(dòng)分配比率的影響

圖 6分別顯示了白屈菜紅堿脅迫下 M.aeruginosa NIES-843 PSⅡ能量分配比率參數(shù)(ψ0、j P0、j E0)在第 2 和第 6 天的變化情況。第 2 天, 在白屈菜紅堿濃度為40 μg/L時(shí), ψ0值顯著高于對(duì)照,而j P0值顯著低于對(duì)照, 在白屈菜紅堿濃度為 10、20 μg/L時(shí), j E0值顯著高于對(duì)照; 到了第6天, 在白屈菜紅堿濃度為 80 μg/L 時(shí), ψ0、j P0、j E0值均顯著高于對(duì)照。

3 討論

通過(guò)線(xiàn)性回歸分析, 在第 2天白屈菜紅堿脅迫M. aeruginosa NIES-843生長(zhǎng)的EC50為(30.62±1.32) μg/L。而幾種典型的生物源抑藻物質(zhì)如連苯三酚(Pyrogallol) EC50為 650 μg/L, 壬酸(Nonanoic acid)EC50為 500 μg/L, 2-甲基乙酰乙酸乙酯 EC50為650 μg/L[14,15]。由此可見(jiàn), 白屈菜紅堿是一種抑藻效應(yīng)極強(qiáng)的生物源物質(zhì)。

圖6 白屈菜紅堿脅迫對(duì)M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ能量分配比率參數(shù)的影響(a: 2d; b: 6d)Fig. 6 Effect of Chelerythrine stress on the parameters of flux ratios of M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ(a: 2d; b: 6d)

研究表明藻類(lèi)和植物PSⅡ?qū)Νh(huán)境脅迫很敏感,葉綠素?zé)晒獠粌H能反映光能吸收、激發(fā)能傳遞和光化學(xué)反應(yīng)等光合作用的原初反應(yīng)過(guò)程, 而且與電子傳遞、質(zhì)子梯度的建立及ATP的合成和CO2固定等過(guò)程有關(guān)。由于葉綠素光誘導(dǎo)熒光對(duì)環(huán)境脅迫響應(yīng)非常靈敏, 所以葉綠素光誘導(dǎo)熒光動(dòng)力學(xué)現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于植物和藍(lán)藻對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)[14]。

根據(jù)Strasser和Strasser的能量流動(dòng)模型圖, j P0可以反應(yīng) PSⅡ反應(yīng)中心電子供體側(cè)的電子傳遞性能。在白屈菜紅堿脅迫的第二天, 當(dāng)其濃度為40 μg/L時(shí), j P0值顯著低于對(duì)照, j P0綜合了 ABS/RC 和TR0/RC 兩個(gè)指標(biāo), 即(TR0/RC)/(ABS/RC)。從圖 3可以看出, 當(dāng)白屈菜紅堿濃度為 40 μg/L時(shí),ABS/RC值顯著升高, 而TR0/RC值卻變化不大, 這說(shuō)明此時(shí)單位反應(yīng)中心吸收的光能顯著增加, 而單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原 QA的能量卻沒(méi)有很大變化, 由此我們可以推測(cè), 微囊藻光合系統(tǒng)反應(yīng)中心電子供體側(cè)電子為白屈菜紅堿作用的把位點(diǎn)之一。RC/CS0可以反應(yīng)PSⅡ反應(yīng)中心的狀態(tài), 從圖5可以看出白屈菜紅堿脅迫導(dǎo)致了 RC/CS0的降低, 這說(shuō)明PSⅡ反應(yīng)中心也是白屈菜紅堿作用的把位點(diǎn)之一。ψ0可以反應(yīng) PSⅡ反應(yīng)中心電子受體側(cè)的性能, 代表了光和系統(tǒng)電子傳遞超過(guò) QA的概率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在第2天, 在白屈菜紅堿各個(gè)處理濃度下ψ0值均高于對(duì)照, 并在20、40 μg/L時(shí)顯著高于對(duì)照。這一升高現(xiàn)象可能是因?yàn)镸. aeruginosa NIES-843受到脅迫后需要更多的生物能來(lái)對(duì)抗脅迫, 而微囊藻 PSⅡ反應(yīng)中心電子供體側(cè)受到損傷, 導(dǎo)致 PSⅡ反應(yīng)中心電子受體側(cè)處于過(guò)氧化狀態(tài), 進(jìn)而引起ψ0值升高。