李松巖， 徐搖光， 張曉東*

1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)院，北京 100037;

2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097

二十二碳六烯酸(DHA)是一種ω3系列的多不飽和脂肪酸，對(duì)人體健康有著十分重要的作用。DHA是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)及維持的一種重要元素，是大腦和視網(wǎng)膜的重要組成成分，對(duì)胎兒及嬰兒的智力和視力發(fā)育至關(guān)重要，因此又被稱為“腦黃金”［1］。DHA同時(shí)也是一種全世界比較稀缺的資源。它在人體內(nèi)參與磷脂的合成，是構(gòu)成人體組織細(xì)胞的成分，對(duì)增強(qiáng)記憶力、保護(hù)視力有顯著作用，對(duì)嬰幼兒及青少年的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，同時(shí)有減弱炎癥，調(diào)節(jié)免疫，改善老年癡呆、精神分裂癥、抗過(guò)敏和衰老等多種功能，對(duì)降低血脂和防治心腦血管疾病也有作用［2，3］。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)建立起來(lái)的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，已成功地表達(dá)了大量的分泌蛋白［4］，它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)繁殖快、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又具有原核表達(dá)系統(tǒng)所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì):如能對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行正確加工、折疊及適度糖基化，分泌表達(dá)的雜蛋白少、易于分離純化等，因此越來(lái)越廣泛地用于分泌蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)克隆了來(lái)源于深海藻類基因組的5個(gè)DHA合成相關(guān)基因，并通過(guò)密碼子優(yōu)化，為了驗(yàn)證優(yōu)化后序列是否能在真核細(xì)胞中正確表達(dá)，利用畢赤酵母表達(dá)這些蛋白，以克服用E.coli表達(dá)可能遇到的表達(dá)量低、難以純化的問(wèn)題，從而進(jìn)一步驗(yàn)證其功能。本研究為后續(xù)DHA合成關(guān)鍵酶基因在禾谷類高等植物的高效穩(wěn)定表達(dá)奠定了可靠的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌菌株(E.coli)DH5α、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastors)GS115(His－Mut+)菌株和分泌型表達(dá)載體pPIC9K，均由本實(shí)驗(yàn)室保存;帶有目的基因的質(zhì)粒由人工合成。

1.2 酶與試劑

Taq DNA聚合酶、PET-30A載體、T4 DNA連接酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、去磷酸化酶、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI、NotI購(gòu)于NEB公司;DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于上海捷瑞生物公司;彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于北京康潤(rùn)生物公司;基因與PCR引物合成、重組子的測(cè)序由北京博邁德生物公司完成;tryptone、yeast extract、酵母氮基(含硫酸銨/無(wú)氨基酸yeast nitrogen base)、D-生物素、D-山梨醇 (D-sorbitol)、SDS、TEMED、N，N-甲叉雙丙烯酰等試劑購(gòu)于北京鼎國(guó)生物公司，預(yù)染蛋白Marker購(gòu)于New England Biolabs公司。

培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基;酵母培養(yǎng)基為 YPD、RDB、BMGY、BMMY 培養(yǎng)基，配方參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.3 方法

1.3.1 合成DHA途徑中相關(guān)酶基因的克隆 高等作物自身不能合成DHA，但大多可以合成亞麻酸，由亞麻酸到DHA需要5種酶，分別是Δ4脫飽和酶(D4)、Δ5脫飽和酶(D5)、Δ6脫飽和酶(D6)、C18延長(zhǎng)酶(E18)和 C20延伸酶(E20)(圖 1)。根據(jù)已發(fā)表的文章或?qū)＠?～12］，通過(guò)比較這些基因的生物來(lái)源及酶活性等，最后選擇來(lái)自Eutreptiellacf gymnastica的Δ4脫飽和酶基因、來(lái)自Peridinium sp.CCMP626的Δ5脫飽和酶基因、來(lái)自Phaeodactylum tricornutum的Δ6脫飽和酶基因、來(lái)自Traustochytrium aureum的C18延長(zhǎng)酶基因和來(lái)自Euglena gracilis的C20延長(zhǎng)酶基因作為基礎(chǔ)，將這些基因序列通過(guò)GeneDesigner軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化，由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行人工合成，并在 http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis上進(jìn)行CAI分析，使之在玉米中高效表達(dá)。優(yōu)化后的核苷酸序列進(jìn)行人工合成，最后獲得攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒pGH-D4/D5/D6E18/E20。

圖1 DHA在藻類生物中的合成示意圖 Fig.1 Diagrammatic sketch of DHA synthesis in microalgae.

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)所需要的載體構(gòu)建方案如圖2所示:以攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒pGH-D4/D5/D6/E18/E20為模板，用表1所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，去除終止密碼子，同時(shí)引入EcoRI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，產(chǎn)物連接T載體并測(cè)序正確后，用EcoRI和XhoI酶切，然后與pET-30a載體(XhoI位點(diǎn)后有His-Tag)相連，構(gòu)建成pET-D4/D5/D6/E18/E20;再以HisR(表1)為反向引物(引物中加入 NotI位點(diǎn))，正向引物(D4F/D5F/D6F/E18F/E20F)不變進(jìn)行擴(kuò)增，得到D4his/D5his/D6his/E18his/E20his等片段;最后再通過(guò)EcoRI和NotI兩個(gè)酶切位點(diǎn)構(gòu)建到pPIC9K載體上。將這些質(zhì)粒命名為pPIC9K-D4his、 pPIC9K-D5his、 pPIC9K-D6his、pPIC9K-E18his和 pPIC9K-E20his。

PCR反應(yīng)所用試劑為 KOD-Plus-Neo酶(ToYoBo公司)，PCR體系參照說(shuō)明書(shū)。擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:95℃預(yù)變性1 min;95℃變性10 s，58～62℃退火 10 s，72℃ 延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。實(shí)驗(yàn)中所有引物均由上海生工生物有限公司合成。

圖2 pPIC9K-D4his/D5his/D6his/E18his/E20his載體構(gòu)建示意圖 Fig.2 Construction of pPIC9K-D4his/D5his/D6his/E18his/E20his vectors.

1.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒載體的線性化及電擊轉(zhuǎn)化 將獲得的重組載體質(zhì)粒 pPIC9K-D4his、pPIC9K-D5his、pPIC9K-D6his、pPIC9K-E18his 和pPIC9K-E20his，分別用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行酶切線性化，37℃保溫1 h，回收已被線性化的質(zhì)粒，隨后電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母(畢赤酵母感受態(tài)準(zhǔn)備、電擊轉(zhuǎn)化均參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè))。取80 μL新鮮制備的感受態(tài)酵母細(xì)胞與5 μg線性化的重組質(zhì)?；旌希靹蚝筠D(zhuǎn)移至0.2 cm預(yù)冷的電擊杯中，冰浴5 min，電擊轉(zhuǎn)化(電擊條件:2 000 V，25 μF，200Ω)，電擊完畢后，加入1 mL預(yù)冷的山梨醇溶液，將菌體混勻，轉(zhuǎn)至新的EP管中;將菌體懸液涂布于RDB平板上，每200～600 μL涂布一塊平板;將平板置于30℃培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。

1.3.4 篩選穩(wěn)定表達(dá)的畢赤酵母重組質(zhì)粒 將除了模板之外的其他PCR反應(yīng)液的組分準(zhǔn)備好，并分裝。由于受體菌酵母GS115為組氨酸缺陷型(his)，pPIC9k載體攜帶HIS4基因，所以只有線 性 化 pPIC9K-D4his、pPIC9K-D5his、pPIC9KD6his、pPIC9K-E18his和 pPIC9K-E20his片段整合到酵母基因組中才能在RDB平板上生長(zhǎng)，因此在RDB平板上生長(zhǎng)迅速的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。在組氨酸缺陷型培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)時(shí)(約12 h);用滅菌的牙簽挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)。

表1 DHA相關(guān)基因引物序列 Table 1 Primers of genes involved in DHA synthesis pathway.

1.3.5 重組畢赤酵母的培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá) 挑選一單菌落，接種于裝有50 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于 28℃、230 r/min培養(yǎng)至OD600=2～6(約 24 h)，4℃、4 000 r/min 離心5 min，收集菌體重懸于10 mL BMMY培養(yǎng)基，加入甲醇至終濃度0.5%，用雙層紗布封口，放置于28℃、230 r/min的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)，每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%。分別在誘導(dǎo)后的2 d、3 d、4 d和5 d取樣2 mL，置于EP管中，9 100 r/min、4℃離心 5 min，收集上清用于分析表達(dá)水平及確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時(shí)間。

1.3.6 表達(dá)產(chǎn)物的濃縮處理SDS-PAGE及蛋白定量 三氯乙酸(TCA)沉淀法將表達(dá)上清液濃縮10倍:10 mL表達(dá)上清液中加入1 mL 100%三氯乙酸，振蕩混勻，放入4℃冰箱沉淀2～3 h，12 000 g離心15 min，去上清，再用10%三氯乙酸洗滌沉淀2～3遍，最大轉(zhuǎn)速離心，倒掉洗滌液，晾干沉淀，經(jīng)分離膠濃度11%，濃縮膠濃度5%，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，在電泳過(guò)程中，濃縮膠中恒流10 mA，分離膠中恒流 20 mA，樣品上樣量為20 mg/μL，預(yù)染蛋白 Marker上樣量為 5 μL，根據(jù)電泳結(jié)果，利用微孔酶標(biāo)儀對(duì)目的蛋白定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆和重組表達(dá)載體構(gòu)建

按照?qǐng)D1所示以pPIC9K為基礎(chǔ)載體構(gòu)建在畢赤酵母中表達(dá)的載體，目的基因的克隆和最終載體的鑒定如圖3所示。經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，顯示結(jié)果與預(yù)期相符。

圖3 酵母表達(dá)載體pPIC9K-D4his/D5his/D6his/E18his/E20his的構(gòu)建 Fig.3 Construction of pPIC9K-D4his/D5his/D6his/E18his/E20his vectors expressed in Pichia pastoris.

2.2 重組表達(dá)載體質(zhì)粒的線性化及篩選

重組質(zhì)粒pPIC9K-D4his、pPIC9K-D5his、pPIC9K-D6his、pPIC9K-E18his 和 pPIC9K-E20his經(jīng)SacI線性化后，通過(guò)電激轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母GS115中，在RDB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取上述甲醇利用型(Mut+)酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3 重組酵母菌蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及上清液SDSPAGE檢測(cè)鑒定

收集部分經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的pPIC9K-D4his誘導(dǎo)蛋白上清，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在約75 kDa下方出現(xiàn)明顯的新生蛋白帶，由于以酶切連接轉(zhuǎn)化方式整合到畢赤酵母染色體上的目的基因上游含有甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子AOX1，在培養(yǎng)基中只存在甲醇為碳源的情況下，能被誘導(dǎo)高效表達(dá)。而轉(zhuǎn)化空載體pPIC9K(CK－)的酵母菌經(jīng)誘導(dǎo)獲得的上清液在相應(yīng)位置未見(jiàn)蛋白帶，可斷定此處的蛋白帶為pPIC9K-D4his重組酵母菌的特征帶(圖5A)，其他位置的蛋白帶應(yīng)該為雜蛋白。

圖4 PCR檢測(cè)畢赤酵母重組子 Fig.4 PCR identification of yeast recombinants.

同上類似，收集部分經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的pPIC9KD5his、pPIC9K-D6his、pPIC9K-E18his 和 pPIC9KE20his誘導(dǎo)蛋白上清，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)分別在約70 kDa和35 kDa下方出現(xiàn)明顯新生蛋白帶(圖5B～E)，這些條帶大小與預(yù)測(cè)的該目的蛋白的分子質(zhì)量大小一致。

由上圖5B可以看出，當(dāng)培養(yǎng)至120 h時(shí)，酵母菌開(kāi)始裂解死亡，同時(shí)游離出的蛋白酶可降解目的蛋白，在泳道3中彌散的蛋白條帶明顯增多，因此選擇的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為96 h。

由圖5D可見(jiàn)，在72 h、96 h培養(yǎng)上清液中，在 25.0～35.0 kDa 之間，大約 30 kDa 的位置有蛋白帶，而在對(duì)照組中未出現(xiàn)該條帶，可判斷此處表達(dá)蛋白帶為E18his蛋白。雖然在72 h培養(yǎng)上清液中仍然存在30 kDa左右的條帶，但考慮到該條帶不如96 h的條帶顏色深，因此選擇的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為96 h。

2.4 重組酵母菌蛋白誘導(dǎo)上清液Western Blot檢測(cè)鑒定

通過(guò)上一步SDS-PAGE的初步驗(yàn)證，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的 pPIC9K-D4his、pPIC9K-D5his、pPIC9KD6his、pPIC9K-E18his和 pPIC9K-E20his誘導(dǎo)蛋白上清均有目的條帶出現(xiàn)，其中pPIC9K-D6his的目的條帶效果強(qiáng)于另外幾個(gè)樣品的目的條帶效果。因此對(duì)pPIC9K-D6his樣品的不同誘導(dǎo)時(shí)間收集到的表達(dá)上清進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。圖6顯示，除空載體對(duì)照外，pPIC9K-D6his的3 d、4 d樣品在64 kDa處均有明顯的雜交帶，這一條帶大小與預(yù)測(cè)的該分泌蛋白的分子質(zhì)量大小一致。同時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，分泌蛋白的表達(dá)量有所升高。

圖5 轉(zhuǎn)化載體酵母表達(dá)蛋白的SDS-PAGE檢測(cè) Fig.5 SDS-PAGE analysis of proteins from transgenic yeasts with vectors.

圖6 D6his重組酵母分泌蛋白的Western Blot分析 Fig.6 Western Blot analysis of recombinant protein with D6his protein.

3 討論

本研究采用的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是利用甲醇作為唯一碳源和能源，能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的一種較為理想的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，使用該表達(dá)系統(tǒng)，具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可靠、表達(dá)蛋白水平高，且不易被污染等特點(diǎn)［13］。本實(shí)驗(yàn)所用的巴斯德畢赤酵母GS115菌株作為一種新型外源基因表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)受由甲醇調(diào)控的AOXl基因強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)，能對(duì)外源蛋白進(jìn)行加工、折疊、翻譯后修飾，并將其分泌到培養(yǎng)基中，分泌的外源蛋白不會(huì)過(guò)度糖基化，畢赤酵母自身產(chǎn)生的分泌蛋白很少，使外源蛋白的分離純化較為簡(jiǎn)便，正因?yàn)橛羞@些優(yōu)點(diǎn)，該表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用。

由已有報(bào)道得知，畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的適宜溫度為28～30℃，在此溫度范圍畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快，理論上外源蛋白的表達(dá)量與菌體密度呈正相關(guān)［14］。一些文獻(xiàn)資料記載，畢赤酵母在較低溫度下有利于外源蛋白的表達(dá)，可能是外源蛋白在較高溫度下的穩(wěn)定性下降，不利于蛋白質(zhì)折疊，也可能是死細(xì)胞釋放更多的蛋白酶降解外源蛋白［15］。畢赤酵母pH生長(zhǎng)范圍一般在3.0～7.0，pH 通過(guò)影響蛋白酶活性，改變蛋白酶對(duì)外源蛋白的降解作用，來(lái)影響外源蛋白的表達(dá)量和活性［16］。畢赤酵母利用甲醇表達(dá)外源蛋白時(shí)需要消耗大量的氧氣，溶氧不足會(huì)抑制菌體繁殖和外源蛋白的表達(dá)，保證其通氣量充足［17］。甲醇是酵母表達(dá)的誘導(dǎo)物和唯一碳源，在甲醇誘導(dǎo)期間，由于甲醇的消耗和揮發(fā)，應(yīng)及時(shí)向培養(yǎng)基中連續(xù)補(bǔ)加甲醇。但是甲醇濃度太高會(huì)對(duì)畢赤酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒害，濃度太低則誘導(dǎo)表達(dá)的外源蛋白太少，一般甲醇的添加量為培養(yǎng)基體積的0.5%～1.0%為宜［18］。甲醇誘導(dǎo)時(shí)間也會(huì)影響外源基因的表達(dá)量，誘導(dǎo)時(shí)間太短則表達(dá)的外源蛋白量少，誘導(dǎo)時(shí)間太長(zhǎng)外源蛋白容易被蛋白酶降解，外源蛋白的表達(dá)量少，因此要選擇最合適的誘導(dǎo)時(shí)間。通過(guò)對(duì)篩選出的陽(yáng)性菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)基、pH、培養(yǎng)時(shí)間和甲醇濃度等條件的優(yōu)化，以得到三角瓶?jī)?nèi)誘導(dǎo)的最佳表達(dá)產(chǎn)物，為之后的表達(dá)產(chǎn)物活性分析奠定條件［19～22］。

本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)上根據(jù)酵母系統(tǒng)中分泌型表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了與其相應(yīng)的一對(duì)引物，并在其上游引物部分引入EcoRI位點(diǎn)，下游引物部分引入NotI位點(diǎn)，將合成DHA途徑中的相關(guān)酶基因克隆至載體pPIC9K中，經(jīng)測(cè)序分析正確，用限制性內(nèi)切酶SacI酶切質(zhì)粒DNA線性化，電擊轉(zhuǎn)化法酵母宿主菌GS115，篩選到陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步鑒定得到甲醇利用型(Mut+)轉(zhuǎn)化子，提取酵母菌轉(zhuǎn)化子DNA用PCR法鑒定，結(jié)果證明目的基因已經(jīng)穩(wěn)定地整合到畢赤酵母GS115染色體基因組中，收集部分經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的蛋白上清，經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot檢測(cè)，這些條帶大小與預(yù)測(cè)的目的蛋白的分子質(zhì)量大小一致，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為96 h。

在此研究基礎(chǔ)上，我們擬將這些來(lái)自海洋微藻的DHA合成相關(guān)基因，包括Δ4、Δ5、Δ6脫飽和酶基因和C18、C20延伸酶基因分別轉(zhuǎn)入玉米基因組中，再通過(guò)雜交等遺傳育種方式最終獲得可合成DHA的轉(zhuǎn)基因玉米，改良玉米油的品質(zhì)，提升玉米油的保健功能價(jià)值，擴(kuò)大玉米油在食品加工與保健食品等方面的應(yīng)用。

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