姜奇彥, 牛風(fēng)娟, 胡 正, 張 輝

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

植物丙酮酸磷酸雙激酶研究進(jìn)展

姜奇彥, 牛風(fēng)娟, 胡 正, 張 輝*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate orthophosphate dikinase,PPDK)作為C4光合途徑中一個(gè)非常重要的限速酶，其功能已經(jīng)清楚，但在C3植物中以及逆境條件下的作用尚不明確。在闡述PPDK基本生物學(xué)特征的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)介紹了PPDK在C4植物和C3植物中的功能、活性調(diào)控、基因工程以及PPDK對逆境脅迫應(yīng)答的研究進(jìn)展，以期為植物抗逆基因挖掘及抗逆種質(zhì)創(chuàng)制提供參考。

丙酮酸磷酸雙激酶；C3植物；C4植物；逆境脅迫；活性調(diào)控

研究表明，逆境脅迫嚴(yán)重影響作物的生長發(fā)育，降低作物產(chǎn)量[1～3]。隨著自然環(huán)境的惡化及不當(dāng)人為因素影響的增加，逆境脅迫對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全構(gòu)成了極大威脅。培育抗逆作物品種具有成本低、見效快、長遠(yuǎn)持久的特點(diǎn)，是提高逆境脅迫條件下作物產(chǎn)量水平和經(jīng)濟(jì)效益的有效方法。而抗逆新基因的挖掘及抗逆新種質(zhì)的創(chuàng)制是作物抗逆育種的重要保障。

植物丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK, EC 2.7.9.1)可催化可逆反應(yīng)：丙酮酸+ ATP+Pi ?磷酸烯醇式丙酮酸+AMP+PPi+2H+。PPDK作為C4光合途徑中一個(gè)非常重要的限速酶已為人們所熟知，但是其在C3植物中的功能以及逆境脅迫下的作用還不清楚。初步研究表明PPDK在逆境條件下具有重要作用[4,5],目前對PPDK基因的逆境分子生物學(xué)研究已成為新的焦點(diǎn)。本文重點(diǎn)介紹了PPDK在C4植物和C3植物中的作用、PPDK的活性調(diào)控、基因工程以及PPDK對逆境脅迫的應(yīng)答的研究進(jìn)展，以期為植物抗逆基因挖掘及抗逆種質(zhì)創(chuàng)制提供參考。

1 PPDK的基本生物學(xué)特征

植物PPDK蛋白有大小不同的兩種形式。一種是存在于葉綠體中的葉綠體型丙酮酸磷酸雙激酶(chPPDK)，其分子量較大，蛋白N末端含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可以進(jìn)入葉綠體行使功能，chPPDK在葉綠體中大量積累，同時(shí)在莖、花等組織中也有表達(dá)[6，7]；另一種是存在于細(xì)胞質(zhì)中的胞質(zhì)型丙酮酸磷酸雙激酶(cyPPDK)，其分子量較小，蛋白N末端不含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，在胞質(zhì)中發(fā)揮作用[8]，cyPPDK一般在植物的非光合組織如根、種子中表達(dá)[9，10]。在玉米、水稻和擬南芥中都發(fā)現(xiàn)，PPDK基因具有特殊的雙啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，即同一個(gè)PPDK基因位點(diǎn)通過2個(gè)啟動(dòng)子分別從2個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄，從第一個(gè)外顯子開始轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)生chPPDK，從第二個(gè)外顯子開始轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)生cyPPDK，長轉(zhuǎn)錄物包含的第一外顯子編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽[7]。

2 PPDK的功能、活性調(diào)控及基因工程的研究進(jìn)展

2.1 PPDK在C4植物中的作用

目前，PPDK在C4植物中作為高光效基因的作用已經(jīng)研究的相對清楚。PPDK是C4植物光合途徑中一個(gè)非常重要的限速酶，催化ATP及丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP作為初始CO2受體在NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-malate dehydrogenase, NADP-MDH) 的作用下進(jìn)一步生成蘋果酸。蘋果酸進(jìn)入維管束鞘細(xì)胞在NADP-蘋果酸酶(NADP-malate enzyme, NADP-ME)作用下釋放CO2，并生成丙酮酸再進(jìn)入葉肉細(xì)胞被PPDK重新利用，而CO2被Rubisco固定進(jìn)入三羧酸循環(huán)[11]。正是由于C4植物具有這個(gè)“CO2泵”、特殊的葉片解剖結(jié)構(gòu)和包括PPDK在內(nèi)的高效光合作用酶，使得C4植物的光合效率高于C3植物。因此很多研究者將C4高光效基因PPDK轉(zhuǎn)入C3植物，希望提高C3植物的光合效率和產(chǎn)量。

2.2 PPDK在C3植物中的功能

PPDK在C3植物中具有多種非光合作用功能。C4途徑高光效酶PPDK的非光合作用同型體在C3植物中分布非常廣泛，目前已經(jīng)檢測到在C3植物的花、葉片、子葉、葉柄、根、胚芽鞘、種子中都有PPDK的表達(dá)[7，9，12]。但由于C3植物很多組織中PPDK的表達(dá)量很低[12]，對PPDK在C3植物中的功能研究很少[12，13]。相對而言，C3植物的種子中PPDK的含量最高，所以關(guān)于PPDK在C3植物種子中的功能研究相對多一些，研究者認(rèn)為在C3植物的種子中PPDK主要控制氨基酸的相互轉(zhuǎn)化和淀粉的合成[4,10]。

在C3植物葉片中，PPDK可能和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)以及NADP-ME協(xié)同作用，為C3植物的氨基酸合成提供碳骨架[14]，并參與CO2的再固定[15]。擬南芥葉片cyPPDK參與葉片自然衰老的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程，該酶通過加速葉片中的氮代謝來增加種子的重量和氮含量。研究者推斷其機(jī)理是：葉片在衰老過程中降解蛋白質(zhì)，降解產(chǎn)生的氨基酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，再由PPDK和PEPC催化形成PEP和草酰乙酸，通過檸檬酸循環(huán)產(chǎn)生谷氨酸和谷氨酰胺的前體α酮戊二酸，進(jìn)而調(diào)控氮循環(huán)(圖1)并提供給種子利用[16]。C3植物中PPDK參與的代謝過程在植物地上及地下不同組織之間還存在著相互關(guān)聯(lián)，代謝物質(zhì)通過木質(zhì)部和韌皮部的長途運(yùn)輸過程，調(diào)控著地上綠色組織的光合作用和地下根尖的生長過程(圖2)[17]。

2.3 PPDK的活性調(diào)控

PPDK酶活性嚴(yán)格受光調(diào)控，這種調(diào)控作用通過PPDK調(diào)控蛋白(regulatory protein, RP)實(shí)現(xiàn)。RP與一般的調(diào)控蛋白不同，它有3個(gè)顯著特點(diǎn)(圖3):①該蛋白具有雙重功能，可以催化PPDK活化/去磷酸化和失活/磷酸化;②RP用ADP而不是ATP作為磷供體;③RP催化底物去磷酸化時(shí)，依賴無機(jī)磷酸，生成焦磷酸，這與大多數(shù)蛋白磷酸酶通過水解去磷酸化的機(jī)制不同[18,19]。

在對玉米PPDK的研究中發(fā)現(xiàn)，光照條件下, RP催化PPDK活性部位的蘇氨酸(Thr-456)進(jìn)行去磷酸化，使PPDK處于活性狀態(tài)；黑暗條件下,RP催化PPDK磷酸化使其失去活性[20]。Chen等[21]最新研究發(fā)現(xiàn)了PPDK更為復(fù)雜的調(diào)控模式，是光強(qiáng)度而不簡單是光/暗變換調(diào)控PPDK的活性，并發(fā)現(xiàn)了PPDK多個(gè)磷酸化位點(diǎn)：Thr-309、Thr-527、Ser-506和Ser-528(圖4,彩圖見封三圖版)。

Casati等[22]發(fā)現(xiàn)在UV-B脅迫下，玉米PPDK的Thr-526殘基發(fā)生了磷酸化。發(fā)生了磷酸化的PPDK蛋白在大田中陽光UV-B輻射及補(bǔ)充UV-B輻射的條件下表達(dá)量下調(diào)，但是在溫室中補(bǔ)充UV-B輻射，其表達(dá)量上調(diào)。這種復(fù)雜的蛋白響應(yīng)機(jī)制暗示光質(zhì)和光量的復(fù)合差異對PPDK酶活性具有調(diào)控作用，進(jìn)而調(diào)控植物在逆境條件下的光合效率。

圖1 PPDK參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控氮代謝[16]Fig.1 Scheme of the PPDK-dependent pathway that amino acid transportation regulate nitrogen metabolism[16].

圖2 PPDK參與的煙草根和莖中的物質(zhì)代謝循環(huán)過程[17]Fig.2 The PPDK dependent-metabolic pathway in root and shoot of tobacco[17].

圖3 PPDK的催化反應(yīng)及RP對它的磷酸化調(diào)控作用[18]Fig.3 PPDK catalysis and its phospho-regulation by regulatory protein (RP)[18].

圖4 4個(gè)磷酸化殘基在PPDK三維結(jié)構(gòu)圖中的位置[21]Fig.4 Locations of the four phosphorylation residues in the PPDK three-dimensional structure[21].(彩圖見封三圖版)

2.4 PPDK基因工程研究進(jìn)展

C4植物光合產(chǎn)量比C3植物高，而PPDK是C4植物光合途徑CO2同化作用的關(guān)鍵酶之一，所以目前很多研究都集中在將C4植物的PPDK基因在C3植物中過表達(dá)，以期提高C3植物的光合效率和產(chǎn)量。目前已成功地將C4植物的PPDK基因轉(zhuǎn)入煙草[23]、馬鈴薯[24]、擬南芥[25,26]和水稻[27,28]等C3植物中，轉(zhuǎn)基因植物中的PPDK酶活性都顯著提高，但這些轉(zhuǎn)基因植株的光合生理性能大多都沒有明顯變化。Fukayama等[27]將玉米PPDK的cDNA轉(zhuǎn)化水稻，轉(zhuǎn)基因植株的PPDK活性僅提高了1～5倍，可是將完整玉米PPDK基因(包括其啟動(dòng)子，終止序列和內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu))轉(zhuǎn)入水稻植株，轉(zhuǎn)基因水稻的光合速率提高了35%，PPDK活性增加了40倍。所以PPDK基因的內(nèi)含子、終止子或者它們的聯(lián)合作用可能對PPDK基因轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性的提高以及PPDK酶的高效表達(dá)有作用。

在C3植物中過表達(dá)PPDK，除了希望提高植物的光合效率，另一方面是希望提高植物的抗逆性。如杜西河等[26]將玉米的ZmPPDK基因轉(zhuǎn)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性增強(qiáng)。還有一些研究是將來自于C3植物的PPDK基因過表達(dá)，研究其逆境脅迫下的作用。在擬南芥中過表達(dá)cyPPDK可以加速葉片中氮的活化，從而加速植株生長以及增加種子的重量及氮含量，延緩植物衰老[16]。用B33啟動(dòng)子在煙草根中特異表達(dá)來自于冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)的chPPDK和cyPPDK，二者都提高了轉(zhuǎn)基因煙草對鋁脅迫的耐受性，且轉(zhuǎn)chPPDK的煙草耐鋁脅迫的能力更強(qiáng)[29]。

逆境脅迫下PPDK的表現(xiàn)為其非光合功能的闡明提供了線索，同時(shí)也為提高植物抗逆性提供了候選基因。但其機(jī)理以及提高植物抗逆性的效率，都有待深入研究。

3 PPDK對植物逆境脅迫的應(yīng)答

初步研究表明[4,5]，PPDK在植物逆境脅迫反應(yīng)中具有重要作用，盡管其作用機(jī)理尚不完全清楚。例如，來源于C4植物的chPPDK在植物抵抗低溫[30,31]、高鹽[32,33]等逆境脅迫的作用機(jī)理等尚有待進(jìn)一步研究。在溫度低于12 ℃時(shí)，玉米PPDK四聚體解聚，PPDK活性喪失，使得低溫下玉米光合速率降低。但是不同植物的PPDK其溫度敏感性不同，將黃菊屬Flaveriabrownii植物的PPDKcDNA轉(zhuǎn)入玉米后，PPDK表達(dá)量提高，轉(zhuǎn)基因玉米的PPDK失活，臨界溫度與野生型相比降低了3℃[30]。對C4型生物能源作物高大葦子草(Miscanthusgiganteus)14℃低溫處理后，PPDK轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量提高，PPDK酶活性增加，其耐冷型PPDK對維持高大葦子草在低溫下的高光合效率起到很重要的作用[31]。鹽脅迫(250 mmol/L NaCl)處理玉米雜交種Hybrid351和普通玉米品種Giza2的幼苗，發(fā)現(xiàn)雜交種的耐鹽性高于普通品種；同時(shí)發(fā)現(xiàn)鹽脅迫后，雜交種中的PPDK含量增加，而普通品種中PPDK含量卻降低；且在鹽脅迫處理2 d后，NaCl顯著抑制了普通玉米品種PPDK的活性，但是在耐鹽性相對高的雜交種中，這種抑制作用消失[33]，這些結(jié)果說明PPDK在玉米抗鹽脅迫中可能發(fā)揮重要作用。

來源于C3植物的PPDK與植物逆境脅迫的相關(guān)研究相對較少，但是目前一些研究發(fā)現(xiàn)C3植物的PPDK對一些逆境脅迫產(chǎn)生明顯應(yīng)答，過量表達(dá)提高了植物對逆境脅迫的耐受性，說明C3植物的PPDK在植物抵御逆境脅迫過程中可能發(fā)揮重要作用。在C3植物水稻根中，ABA、低氧脅迫(淹水處理)、水分缺乏脅迫(干旱、低溫、高鹽和甘露醇處理)都可以顯著誘導(dǎo)cyPPKD的高表達(dá)[9]。PPDK在逆境脅迫中的作用機(jī)理尚不清楚。Moons等[9]分析認(rèn)為由于種子中的cyPPKD與氨基酸轉(zhuǎn)化有關(guān)，推測水稻根中可能有脯氨酸等氨基酸的積累，提高了水稻對干旱脅迫的耐受能力；低氧脅迫下PPDK活性增加的同時(shí)，乙醇脫氫酶I、磷酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶的活性也增加，說明cyPPDK可能參與了水稻應(yīng)答低氧脅迫的物質(zhì)代謝過程。還有研究認(rèn)為缺氧條件誘導(dǎo)了水稻胚芽鞘中PPDK的大量合成，其功能可能是PPDK與丙酮酸激酶協(xié)同作用，催化ATP產(chǎn)生PPi，PPi參與蔗糖水解，并加速糖酵解過程，進(jìn)而提高水稻胚芽鞘對缺氧脅迫的適應(yīng)能力[34]。除了非生物脅迫，PPDK在植物抗生物脅迫中也可能發(fā)揮重要作用。C3植物煙草(NicotianatabacumL.)在分別感染PotatovirusY(PVY)和PotatovirusA(PVA)病毒后，其葉片PPDK活性增強(qiáng)[35,36]。研究者分析認(rèn)為在生物逆境脅迫條件下，植物物質(zhì)代謝過程受到逆境脅迫的影響，通過補(bǔ)償代謝改變了基本代謝通路，保證了植物的生命活動(dòng)，PPDK作為補(bǔ)償代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在這一過程中起到了重要作用[23]。綜合這些研究結(jié)果以及PPDK參與的代謝過程，PPDK在植物抗逆過程中可能發(fā)揮重要作用，其作用機(jī)理可能與滲透活性物質(zhì)如氨基酸、糖類等的合成有關(guān)，還可能與抗氧化分子如NADPH表達(dá)量提高有關(guān)，也可能與脂肪酸合成、光合作用、TCA循環(huán)等過程有關(guān)(圖5)，但這些推測還需要更多的證據(jù)支持。

圖5 逆境條件下C3植物中與PPDK相關(guān)的代謝過程[14]Fig.5 Scheme of PPDK dependent-metabolic pathways occurring in C3 plants exposed to stress factors[14].

4 展望

丙酮酸磷酸雙激酶在C4植物中作為高光效基因的作用已經(jīng)研究的相對清楚，很多研究者將C4植物中的高光效基因PPDK轉(zhuǎn)入C3植物，希望提高C3植物的光合效率和產(chǎn)量，但并未像預(yù)想的那樣能夠顯著提高C3植物的光合效率，其原因還不清楚，深入研究其機(jī)理有助于提高C3植物的光合作用，進(jìn)而提高C3類作物的產(chǎn)量，為高產(chǎn)育種提供候選基因。PPDK在逆境條件下的作用了解的還很少，在近年才成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。研究初步發(fā)現(xiàn)PPDK對逆境脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，但其應(yīng)答機(jī)理還不清楚，目前的研究多根據(jù)PPDK參與的代謝途徑推測PPDK可能的抗逆機(jī)理，這些推測還需要更多的證據(jù)支持。PPDK抗逆機(jī)理的解析，有助于提高PPDK在逆境脅迫下的利用效率，為作物抗逆育種提供候選基因。最終期望創(chuàng)制出既高產(chǎn)又抗逆的新種質(zhì)，使二者能夠有效統(tǒng)一起來。

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Progress on Plant Pyruvate Orthophosphate Dikinase

JIANG Qi-yan, Niu Feng-juan, HU Zheng, ZHANG Hui*

InstituteofCropScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

It’s well known that pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) plays a controlling role in the PEP-regeneration phase of the C4photosynthetic pathway. However, PPDK has no established function in C3plants and its role in stress response has remained unclear. The advances in plant PPDK were reviewed in this paper, including PPDK function in C4and C3plant, the activity regulation of PPDK in plants,PPDKgene engineering and the role of PPDK in responding stress. The results and achievements were expected to provide the theoretically basis for deciphering the salt tolerance mechanism and breeding cultivars with high stress tolerance.

pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK); C3plant; C4plant; stress; activity regulation

2015-03-13; 接受日期：2015-04-09

國家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08002-002)資助。

姜奇彥，助理研究員，主要從事抗逆種質(zhì)資源鑒定評價(jià)及抗逆機(jī)理研究。E-mail：jiangqiyan@caas.cn。*通信作者：張輝，研究員，主要從事抗逆種質(zhì)資源鑒定評價(jià)及抗逆機(jī)理研究。E-mail：zhanghui06@caas.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.04.04