胡珊蓮

（上海市閘北區(qū)光明荷斯坦軟業(yè)有限公司，上海閘北200436）

口蹄疫O型液相阻斷ELISA免疫抗體檢測方法的應(yīng)用

胡珊蓮

（上海市閘北區(qū)光明荷斯坦軟業(yè)有限公司，上海閘北200436）

應(yīng)用液相阻斷ELISA試驗(yàn)方法檢測上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司牧場牛群經(jīng)口蹄疫O型滅活疫苗免疫的奶牛血清樣品2412份。經(jīng)檢測，2412份樣品中規(guī)模奶牛場牛群免疫抗體滴度≤1∶64樣品42份，抗體滴度≥1∶128樣品2370份，抗體保護(hù)率為98%。

液相阻斷ELISA；O型口蹄疫；抗體檢測；奶牛

口蹄疫屬我國農(nóng)業(yè)部公布的一類動(dòng)物疫病，是由口蹄疫病毒引起偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，以牛，豬最易感，羊、駱駝、象等均有發(fā)病報(bào)告。該病可分為O、A、C、南非Ⅰ型、南非Ⅱ型、南Ⅲ型和亞洲Ⅰ型等7個(gè)血清型，其中以O(shè)型和A型分布最廣，危害最大。

本試驗(yàn)應(yīng)用液相阻斷ELISA檢測方法跟蹤檢測上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司下屬牧場O型口蹄疫疫苗免疫抗體滴度水平，以利及時(shí)指導(dǎo)下屬牧場O型口蹄疫防疫工作，為牧場健康發(fā)展提供有效保障?，F(xiàn)將檢測應(yīng)用情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品 上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司下屬牧場牛群經(jīng)口蹄疫O型滅活疫苗（JYBL-2014-5-21）免疫的奶牛血清樣品2412份。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材 酶標(biāo)儀、37℃恒溫溫箱；5.0～50.0協(xié)L移液器、50.0～200.0協(xié)L移液器及50.0～300.0協(xié)L 12道移液器；配套移液槍尖，移液槽；吸水紙；96孔平底酶標(biāo)板；96孔U形底聚丙烯微量抗原抗體反應(yīng)板；檢測試劑盒系采用中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 牛群免疫 應(yīng)用口蹄疫O型滅活疫苗按照產(chǎn)品說明書規(guī)定免疫劑量及免疫方法對(duì)公司下屬牧場牛群接種免疫，于2免21 d后采血進(jìn)行免疫效果檢測。

1.3.2 試劑準(zhǔn)備 包被緩沖液（pH9.6）、磷酸鹽-吐溫緩沖液（PBST）、PBST稀釋液、底物溶液按試劑盒說明書進(jìn)行配制。

1.3.3 包被 pH9.6包被緩沖液稀釋口蹄疫O型病毒兔抗血清至工作濃度（1∶1000），混合均勻，酶標(biāo)板上每孔加入50協(xié)L，振蕩，封板室溫過夜，使抗體在pH9.6條件下吸附于酶標(biāo)板上。

1.3.4 抗原抗體反應(yīng)（對(duì)照血清及待檢血清） 以 96孔U型微量血凝板檢測，以20份樣品為例，需板2塊，血清以倍比稀釋法進(jìn)行（注：空白孔為無樣品加入）。

A.加PBST稀釋。A1—A10加入150協(xié)L PBST稀釋液，B1—B10，C1—C10，D1—D10，E1—E10各加入50協(xié)L PBST稀釋液。H1加入150協(xié)L PBST稀釋液，H2—H10各加入50協(xié)L PBST稀釋液，A12—B12各加50協(xié)L PBST稀釋液。

B.加血清稀釋。在A1中加入50協(xié)L待檢血清樣品，混勻后取50協(xié)L加入B1，再混勻后取50協(xié)L加入C1連續(xù)2倍稀釋（從A1 1∶4倍開始稀釋到E1 1∶64倍，A1—A10共10個(gè)樣品），直至加到E1混勻，再從E1中吸取50協(xié)L棄去。陽性血清取50協(xié)L加入H1，混勻后取50協(xié)L加入到H2，直至加入到H10混勻，再從H10中吸取50協(xié)L棄去（從H1 1∶4倍開始稀釋到H10 1∶2048倍）。陰性血清取50協(xié)L加入A12，混勻后取50協(xié)L加入B12，混勻后取50協(xié)L棄去。

C.加病毒抗原。口蹄疫O型病毒抗原用PBST稀釋液稀釋到工作濃度（1∶12，即1份病毒抗原加11份PBST），96孔U型微量血凝板中待檢樣品血清及陰陽性血清每孔加50協(xié)L，加入等量工作濃度的病毒抗原后，血清稀釋度加倍。E12—H12四個(gè)對(duì)照孔各加100協(xié)L稀釋至工作濃度的病毒抗原。振蕩，蓋膜封板，2～8℃過夜（詳見圖1）。

圖1 96孔U型微量血凝板10份血清加入工作濃度病毒抗原后的濃度表

1.3.5 洗酶標(biāo)板及抗原抗體轉(zhuǎn)移 先將2塊抗原抗體反應(yīng)板從4℃中取出室溫放置，用PBST稀釋液連續(xù)洗酶標(biāo)板4次，吸水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板上的對(duì)應(yīng)孔，每孔加50協(xié)L，封板，37℃溫育60 min（詳見圖2）。

1.3.6 洗酶標(biāo)板及加豚鼠抗血清 用PBST稀釋液連續(xù)洗酶標(biāo)板4次，吸水紙上甩干，用豚鼠抗血清稀釋液將口蹄疫O型病毒豚鼠抗血清稀釋至工作濃度（1∶1000），每孔加50協(xié)L，封板，37℃溫育60 min。

圖2 96孔酶標(biāo)板檢測20份樣品布局圖

1.3.7 洗酶標(biāo)板及加辣根過氧化物酶 用PBST稀釋液連續(xù)洗酶標(biāo)板4次，吸水紙上甩干，用PBST稀釋液將兔抗豚鼠IgG—辣根過氧化物酶結(jié)合物稀釋至工作濃度（1∶500），每孔加50協(xié)L，封板，37℃溫育60 min。

1.3.8 洗酶標(biāo)板及加底物溶液 用PBST稀釋液連續(xù)洗酶標(biāo)板4次，吸水紙上甩干，加50協(xié)L底物溶液（底物溶液每1 mL加10協(xié)L 3%雙氧水），封板，37℃溫育15min。

1.3.9 加終止液 15 min后，每孔加50協(xié)L終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取D492 nm值。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定

1.4.1 實(shí)驗(yàn)認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn) 每板設(shè)4孔病毒抗原對(duì)照，病毒抗原對(duì)照不加任何血清，直接用PBST稀釋至使用濃度，與血清/病毒抗原復(fù)合物同步加入ELISA板孔，50.0協(xié)L/孔，病毒抗原對(duì)照D492 nm值應(yīng)在1.5士0.5范圍內(nèi)。陽性對(duì)照抗體效價(jià)應(yīng)在（1∶1024）士1滴度內(nèi)，陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)應(yīng)＜1∶8。

病毒抗原對(duì)照平均D492 nm值50.00%計(jì)算（臨界值），抗原對(duì)照4孔，棄去最高和最低D492 nm OD值，計(jì)算剩余2孔的平均D492 nm值，除2，即50.00%對(duì)照值。該值即為臨界值，表示阻斷50.00%反應(yīng)的對(duì)照D492 nm值。

1.4.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 以病毒抗原對(duì)照平均D492 nm值的50.00%為臨界值，被檢血清稀釋孔D492 nm值＞臨界值的孔為陰性孔，≤臨界值的孔為陽性孔，陽性孔的D492 nm值=臨界值時(shí)所對(duì)應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒抗原對(duì)照D492 nm值 2412份檢測血清樣品，共采用121個(gè)ELISA板，484個(gè)病毒抗原對(duì)照D492 nm值在1.1～2.0范圍內(nèi)。

2.2 陰、陽性對(duì)照血清抗體效價(jià) 121個(gè)牛群檢測血清樣品ELISA板臨界值均在對(duì)應(yīng)板陽性對(duì)照血清1∶1024士1滴度的D492 nm值內(nèi)，121個(gè)陰性對(duì)照血清樣品1∶8處滴度的D492 nm值均≥相應(yīng)板的臨界值相。

2.3 O型口蹄疫牛群免疫抗體效果 對(duì)上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司所屬牛群2免21 d后進(jìn)行口蹄疫O型滅活疫苗免疫抗體檢測，采血檢測2412份血樣，ELISA抗體效價(jià)≥1∶128，2370份，判為O型口蹄疫抗體陽性，98%以上保護(hù)，ELISA抗體效價(jià)1∶64～1∶128則抗體滴度，取中間值為1∶90，判為可疑，50%以上保護(hù)。ELISA抗體效價(jià)≤1∶64，42份，判為O型口蹄疫抗體陰性，不保護(hù)。

3 小結(jié)與討論

3.1 液相阻斷ELISA用于檢測家畜血清中的口蹄疫（FMD）抗體，具有靈敏性、特異性、穩(wěn)定性，能及時(shí)、準(zhǔn)確的跟蹤監(jiān)測牛群O型口蹄疫免疫抗體，能有效指導(dǎo)牛群O型口蹄疫防控工作，是牛群0型口蹄疫免疫抗體跟蹤監(jiān)測的首選試驗(yàn)檢測方法。

3.2 本次試驗(yàn)為公司下屬牧場所使用代號(hào)JYBL-2014-5-21的口蹄疫O型滅活疫苗抗體效價(jià)檢測提供了有效試驗(yàn)數(shù)據(jù)，能有效指導(dǎo)下屬牧場O型口蹄疫防疫工作，為防控口蹄疫O型疫病提供了有效保障。

結(jié)果表明，抗體效價(jià)保護(hù)率為98%。

S858.23

A

1005-7307（2015）01-0003-003

2014-11-21