朱天吉，張　卿

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050）

·基礎與轉(zhuǎn)化醫(yī)學·

蛋白質(zhì)表達譜在選擇性COX-2抑制劑中抗癌作用的機制研究

朱天吉，張卿

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050）

目的：為了確定蛋白質(zhì)表達譜在選擇性COX-2抑制劑尼美舒利（NIM）抗肺癌的作用，本研通過運用二維凝膠電泳，質(zhì)譜分析和生物信息學技術研究尼美舒利對肺癌蛋白質(zhì)表達的影響，分離并鑒定其相關蛋白質(zhì).方法：建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型并進行尼美舒利藥物干預，應用雙向電泳技術對尼美舒利組和對照組的裸鼠移植瘤的總蛋白進行分離，利用PDQUEST7.2軟件分析差異蛋白質(zhì)點，并進行質(zhì)譜鑒定.結果：通過雙向電泳-圖像分析-質(zhì)譜技術確定了14個差異蛋白質(zhì)點，其中11個蛋白質(zhì)在尼美舒利組顯著下調(diào)，3種蛋白質(zhì)顯著上調(diào).結論：質(zhì)譜鑒定得到的這些差異表達的蛋白質(zhì)對確定尼美舒利抗肺癌作用的機制有一定指導意義，為進一步研究其抗腫瘤作用奠定良好的基礎.

肺腺癌；裸鼠移植瘤；蛋白質(zhì)組學；質(zhì)譜分析

0 引言

相關資料顯示，肺癌無論是年發(fā)病率還是年死亡率，均居全球癌癥首位.過去生物學和醫(yī)學對于癌癥的研究主要集中在基因水平和轉(zhuǎn)錄水平，而腫瘤是由環(huán)境因素和遺傳因素相互作用的多種基因和蛋白質(zhì)參與的疾病，是由某些蛋白質(zhì)的表達或者變化引起的一系列細胞無限增殖過程，所以蛋白質(zhì)對于腫瘤的研究至關重要［1-2］.蛋白質(zhì)組是指一個組織、細胞或基因組在一個時期內(nèi)所表達的所有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學就是對這些蛋白質(zhì)進行研究的學科，它最早是由澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams在1994年提出的［3］.蛋白質(zhì)組學的提出為我們研究腫瘤發(fā)生和治療的分子機制提供了新的思路.

本研究以尼美舒利（nimesulide，NIM）干預肺腺癌A549細胞接種的裸鼠移植瘤為研究對象，采取比較蛋白質(zhì)組學的研究技術，以雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，用圖像分析技術尋找差異表達的蛋白質(zhì)，并進行質(zhì)譜鑒定，篩定出尼美舒利干預后肺腺癌裸鼠移植瘤中的差異蛋白質(zhì)，為研究肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機制及治療提供線索和依據(jù).

1 材料和方法

1.1細胞株及實驗動物 人腺癌細胞株A549購自南京博爾生物有限公司.實驗動物BALB-C裸鼠，共20只，雌性，4～6周，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，層流凈化室內(nèi)飼養(yǎng)，接種前體質(zhì)量18～20 g.

1.2實驗試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基：購自德國Applichem公司；胎牛血清：GIBCO公司；胰蛋白酶：GIBCO公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO）分析純：Sigma公司；青霉素、鏈霉素：華北制藥有限公司；PBS緩沖液：南京博爾迪生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC）：河北省大城縣新豐纖維素廠；尼美舒利（Nimesulide，NIM）：Sigma公司；蛋白定量試劑盒：碧云天生物技術研究所；2-D Clean-up Kit試劑盒：GE Healthcare Bio-Sciences公司；IPG Buffer：GE Healthcare Bio-Sciences公司；IPG膠條（pH3～10，線性，13 cm）：GE Healthcare Bio-Sciences公司.

1.3細胞培養(yǎng)及裸鼠成瘤 用含10％胎牛血清、100 u/mL青霉素及鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基將肺腺癌A549細胞培養(yǎng)于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱.取對數(shù)生長期的肺腺癌A549細胞，以108個/mL密度懸于PBS中.每只裸鼠皮膚消毒后將1 mL PBS細胞懸浮液接種于左側(cè)背部皮下.將裸鼠隨機分為對照組（n=10）和實驗組（尼美舒利組，n=10），實驗組每天每只給予0.2 mL尼美舒利60 mg/0.2 mL·kg-1溶于5％CMC灌胃，對照組給予0.2 mL0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃，用藥21 d.21 d后斷頸處死各組裸鼠，完整分離切下移植瘤.

應用雙向電泳技術對尼美舒利組和對照組的裸鼠移植瘤的總蛋白進行分離，利用PDQUEST7.2軟件分析差異蛋白質(zhì)點，并進行質(zhì)譜鑒定.將移植瘤組織置于-20℃預冷后的研缽中，在液氮條件下將組織研磨成精細粉末，置于1.5 mL的EP管中，加入裂解液（100 mg/500μL），同時加入1 mM PMSF（100 Mm PMSF，10μL）、2 mM EDTA（200 mM EDTA，10 uL），室溫下靜置至少1 h，冰浴超聲前加入100 mM DTT 10μL，超聲5 min（超1 s，隔2 s），-20℃條件下靜置過夜.次日在4℃條件下，以20 000 g的離心力離心30 min，取上清液即為總蛋白質(zhì)，然后用2-D Clean-up Kit試劑盒（按照試劑說明）純化蛋白質(zhì)，再用改良的Bradford法測蛋白質(zhì)濃度后制成溶解樣品即水化液（蛋白上樣量650μg，液體量250μL）.將溶解樣品移入標準性膠條陽極端，在IPG膠條上覆蓋1 mL Immobiline Drystrip覆蓋油，蓋上蓋子，將其尖端背面電極與IPGphor儀器的陽極平臺接觸，飽脹和等電聚焦均在20℃下自動進行，水化11 h左右，加電壓聚集，等電聚焦電泳結束后，用鑷子夾住膠條的正極，用去離子水洗掉覆蓋油，用濾紙吸凈離子水，放入DTT平衡液的試管內(nèi)，支持膜貼管壁，置搖床平衡10min，然后加入碘乙酰胺平衡液中，置搖床平衡15 min，去除多余的DTT，取出膠條后用SDS電極緩沖液沖洗膠條，再在Ettan DALTⅡ灌膠槽中制備2塊PAGE膠，把膠條放在玻璃板之間的凝膠上，吸干電極緩沖液，用0.5％的瓊脂糖封頂.垂直電泳在Ettan DALTⅡ電泳槽中進行，當運行溴酚藍達到距膠條的底線1 cm時停止電泳.把二廂結束的膠進行固定、染色、固定、脫色，至蛋白質(zhì)點清晰.利用Proxpress2D蛋白凝膠成像系統(tǒng)進行圖像掃描，然后用PDQUEST7.2軟件對掃描的圖像進行分析，質(zhì)譜鑒定在華大基因研究所完成.

2 結果

2.1成功構建人肺腺癌裸鼠移植瘤模型 接種肺腺癌A549細胞后，3 d左右開始成瘤，瘤體逐漸增大，成瘤率達100％.移植瘤呈圓形、卵圓形或結節(jié)型，初期瘤體表面光滑，但隨著瘤體逐漸增大，部分瘤體表面破潰、結痂.移植瘤裸鼠生長狀態(tài)良好，飲食及活動正常，無其他明顯不良反應.

2.2雙向電泳圖譜 尼美舒利組和對照組各選定一塊蛋白質(zhì)點顯示比較均勻、雜質(zhì)斑點少、最能體現(xiàn)該組蛋白質(zhì)分布狀態(tài)的一塊凝膠.差異蛋白質(zhì)點的選擇借助圖像分析軟件進行匹配，以所選的膠為基準，參考其他膠，選擇組間表達差異明顯、組內(nèi)表達含量穩(wěn)定、位置恒定的點作為目標點，發(fā)現(xiàn)其中有14個差異蛋白質(zhì)點，11個蛋白質(zhì)在尼美舒利組顯著下調(diào)，其中5種蛋白質(zhì)與腫瘤有關，它們是Rho GTPase、alpha-globin、beta-globin、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1、Serpin 9d，有1種蛋白質(zhì)為unnamed protein product；3種蛋白質(zhì)在尼美舒利組顯著上調(diào)，它們是tropomyosin 1（TM1）、tropomyosin 2（TM2）和Myosin light chain 1（MLC1）（圖1、圖2）.

A：尼美舒利組；B：正常對照組圖1　肺腺癌裸鼠移植瘤總蛋白雙向電泳圖譜

圖2　經(jīng)PDQuest軟件分析獲得的肺腺癌裸鼠移植瘤組織雙向電泳差異蛋白

2.3差異蛋白質(zhì)點的MALDI-TOP-TOP-MS肽質(zhì)量指紋圖譜分析 切取平行膠上14個相應的差異蛋白質(zhì)點，經(jīng)膠內(nèi)原位酶解后用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOP-TOP-MS）分別對其肽指紋進行測定，并以酶自動降解（m/z=1993. 9772）進行校正，搜索數(shù)據(jù)庫（http：//www.matrixcience. com/）鑒定得到這些差異蛋白的相關信息（表1）.

表1　差異蛋白的質(zhì)譜分析結果

3 討論

尼美舒利是有機酸類非甾體類消炎藥，除臨床上用于抗炎及風濕性疾病等的治療外，已有眾多的流行病學資料、體內(nèi)外實驗和臨床研究表明尼美舒利具有防治腫瘤的作用［4-6］.目前非甾體類消炎藥抗腫瘤作用分子機制的研究多處于基因水平，在蛋白質(zhì)方面的研究較少，且多數(shù)是單個基因或蛋白質(zhì)的研究，雖然調(diào)控生命活動的源頭是基因，但蛋白質(zhì)才是生命活動的具體執(zhí)行者和體現(xiàn)者.蛋白質(zhì)學的研究大致分為兩類，一類是結構蛋白質(zhì)組學研究，主要目的是查清人類基因所表達的全部蛋白質(zhì)，建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，另一類是差異蛋白質(zhì)組學研究，即通過尋找兩個或多個樣本之間蛋白質(zhì)差異表達的因素，研究生物體的生理、病理過程及對外界的干擾因素發(fā)生反應的機制，也稱為功能蛋白質(zhì)組學研究.

為了研究選擇性COX-2抑制劑尼美舒利抗肺癌作用的分子機理，本研究應用了功能蛋白質(zhì)組學的方法，比較了尼美舒利與對照組肺癌裸鼠移植瘤的總蛋白雙向電泳凝膠圖譜，分析鑒定結果后獲得了14個差異蛋白質(zhì)點，11個蛋白質(zhì)在尼美舒利組顯著下調(diào)，其中5個與尼美舒利抗腫瘤作用相關，它們是：Rho GTPase、alpha-globin、beta-globin、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 Serpin 9d；3種顯著上調(diào)，它們是tropomyosin 1（TM1）、tropomyosin 2（TM2）和Myosin light chain 1（MLC1），主要與腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移有關.

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）屬于微絲結合蛋白，具有穩(wěn)定的微絲結構，參與微絲細胞粘附和凋亡信號轉(zhuǎn)導的過程，TM合成降低可改變微絲結構，增加細胞運動、錨定非依賴性生長、以及抵制接觸性抑制生長與轉(zhuǎn)移有關的能力，導致細胞浸潤和轉(zhuǎn)移.在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中，癌細胞首先從腫瘤中脫離下來，這一過程與細胞的運動分不開.可見，TM可能參與腫瘤形成和腫瘤轉(zhuǎn)移過程.有報道認為TPM1和TPM2與膀胱癌有關［7］，也有研究發(fā)現(xiàn)，在非肌肉細胞中，TPM1發(fā)揮著細胞轉(zhuǎn)化抑制的作用［8］，一旦TPM1受損或缺失，將導致細胞惡性轉(zhuǎn)化，其異常表達是細胞離散的分子基礎.Yi等［9］研究表明，COX-2抑制劑NS-398作用于子宮內(nèi)膜癌細胞RL95-2，通過蛋白質(zhì)組學分析顯示有多種蛋白質(zhì)表達，鑒定出上調(diào)的蛋白質(zhì)中有tropomyosin，證明COX-2抑制劑NS-398通過tropomyosin的高表達抑制RL95-2細胞增殖、侵襲的能力.

肌球蛋白輕鏈1（fast skeletalmuscle isoform myosin light chain l，MLC1f），MLC是eukaryotic cells細胞骨架的結構組成部分，它對調(diào)節(jié)細胞形態(tài)、移動和生長發(fā)揮著重要的作用，Zhang等［10］的研究表明MLC1f抑制了細胞周期由G1期到S期，表明了MLC1有負面調(diào)整細胞增殖的作用，本研究中MLC1f在尼美舒利組表達明顯上調(diào)，是否存在尼美舒利通過非COX-2依賴途徑上調(diào)MLC1f來抑制腫瘤細胞的增值還需要證實.

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Rho GTP酶在多種惡性腫瘤中高表達，并和腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關［11-12］.Rho GTP酶是細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導通路的關鍵分子，作為分子開關在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮橋梁作用.實驗研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中可見Rho GTP酶表達異常，改變細胞內(nèi)Rho GTP酶的表達水平可以直接影響腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過程［12］.Chang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，COX-2明顯增加HCA-7細胞的Rho GTP酶的活性水平，COX-2激活了RhoA/Rho kinases（ROCK）通路，減低上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）和α-連環(huán)蛋白（α-catenin）水平，破壞了細胞連接形式及增加細胞運動.Takaoka等［14］研究表明，COX-2在細胞及組織內(nèi)高表達，通過上調(diào)Rho GTPases，提高了致腫瘤性，促進腫瘤的生長季侵襲.

核不均一核糖核蛋白A2/B1（hnRNP A2/B1）是一種重要的RNA連接蛋白，是細胞核內(nèi)hnRNP的基本核心成分.它在癌細胞和增殖的細胞中過度表達，可能是細胞癌變的原因之一［15］，hnRNP A2/B1在正常肺發(fā)育的關鍵階段過度表達，表達水平與肺癌及癌前病變類似，其在成熟肺組織中的表達被抑制，在肺癌中的表達形式類似于胚肺生長中所見，這種表達形式在蛋白質(zhì)和信號分子水平是一致的，顯示hnRNP A2/B1可能是一種癌生長蛋白［16］，Sueoka等［17］對新鮮非小細胞肺癌組織進行了hnRNP A2/B1表達的研究，發(fā)現(xiàn)病變晚期組hnRNP A2/B1表達陽性率高于病變早期組.也有報道表明hnRNP A2/B1表達和肺癌分期及淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關［18］.

有研究表明選擇性COX-2抑制劑通過誘導減少COX-2mRNA及其蛋白質(zhì)表達的方式促進細胞凋亡［4］，而COX-2mRNA的3'-UTR區(qū)域能表達一種多聚體蛋白，這個多聚體蛋白包含HuR、TLA-1、TLAR和hnRNP［5］.尼美舒利抑制COX-2mRNA及其蛋白的表達，從而抑制hnRNPA2/B1的過量表達，抑制肺癌細胞的分化、浸潤及轉(zhuǎn)移.監(jiān)測肺組織中hnRNPA2/B1表達有助于非小細胞肺癌的診斷，預測預后和指導多學科綜合治療.

本研究結果顯示：①尼美舒利干預后裸鼠移植瘤組織中Alpha-globin、beta-globin、Serine proteinase inhibitor表達明顯下調(diào)，MLC1f表達明顯上調(diào).尼美舒利通過上訴蛋白質(zhì)經(jīng)COX-2依賴或非依賴途徑發(fā)揮抗腫瘤作用的機制尚不清楚，有待進一步明確.②尼美舒利干預后裸鼠移植瘤中TPM1、TPM2表達明顯上調(diào)，進一步證實COX-2抑制劑尼美舒利通過上調(diào)TPM1、TPM2的表達抑制肺腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移.③尼美舒利干預后裸鼠移植瘤組織中Rho GTP酶表達明顯下調(diào)，表明其明顯降低肺腺癌細胞中Rho GTP酶的活性水平，通過抑制RhoA/Rho kinases（ROCK）通路，增加上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）和α-連環(huán)蛋白（α-caatenin）水平，穩(wěn)固細胞連接形式及減少細胞運動.④尼美舒利干預后裸鼠移植瘤組織中hnRNPA2/B1表達明顯下調(diào).COX-2mRNA的3'-UTR區(qū)域能表達一種多聚體蛋白，這個多聚體蛋白中包含RNP，選擇性COX-2抑制劑尼美舒利抑制COX-2mRNA的表達，從而抑制hnRNP A2/B1的產(chǎn)生，抑制肺癌細胞的分化、浸潤劑轉(zhuǎn)移.⑤在下調(diào)的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一個未命名蛋白質(zhì)，為我們將來的研究提供了方向.總之，通過這些蛋白質(zhì)的鑒定對于確定尼美舒利抗肺癌作用的機制具有一定指導意義，也為進一步研究尼美舒利奠定了基礎.

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Mechanism of protein expression profile in the anticancer effect of selective COX-2 inhibitors

ZHU Tian-Ji，ZHANGQing
Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China

AIM：To study themechanism of protein expression profiling in anticancer effect of selective COX-2 inhibitor nimesulide by researching nimesulide's effect on protein expression in lung cancer with the assistance of two-dimensional gel electrophoresis，mass spectrometry and bioinformatics techniques，and by separating and identifying relative proteins.M ETHODS：Nude mice models with lung adenocarcinoma A549 xenografted tumor were established and interrupted with nimesulide.Total protein of mice in the nimesulide group and control group were separated by two-dimentional gel electrophoresis.Differential protein spotswere analyzed by PDQUEST7.2，and mass spectrum was identified. RESULTS：By two-dimentional gel electrophoresis-image analysis-mass-spectrometric technique，14 differential protein spots were indentified.Among them，11 decreased in nimesulide group and 3 increased in the control group remarkably.CONCLUSION：The deferentially expressed proteins identified by mass spectrometer are of importance in guiding the research on anticancermechanism of nimesulide and thus can lay the foundation for further studies.

lung cancer；A549 xenografted tumor；proteomics；mass spectrometry

R734.2

A

2095-6894（2015）11-001-04

2015-10-14；接受日期：2015-10-30

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院重大項目（NYFY ZD 2012001）

朱天吉.碩士，副主任醫(yī)師.E-mail：zhutianji168@126.com

張 卿，E-mail：fczhangqing@126.com