劉東旭，時 坤，李健明，曾范利，劉 菲，杜 銳

（吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林長春 130118）

5株水貂阿留申病毒的分離與鑒定

劉東旭，時 坤，李健明，曾范利，劉 菲，杜 銳

（吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林長春 130118）

為給水貂阿留申病疫苗的研制奠定基礎，對疑似感染阿留申病死亡的水貂內臟處理后，接種貓腎傳代細胞（CRFK）分離病毒，并對分離的毒株進行PCR鑒定及動物回歸試驗。與此同時，首次應用免疫過氧化物酶單層細胞實驗（IPMA）對所分離的水貂阿留申病毒進行TCID50的測定。結果成功分離并鑒定出5株水貂阿留申病毒株，分別命名為ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-ZJ3、ADV-QD2、ADV-QD3，各分離株的TCID50分別為105.7TCID50/ml、105.0TCID50/ml、104.6TCID50/mL、105.2TCID50/mL、104.1TCID50/mL。動物回歸實驗顯示，所分離的病毒對水貂具有致病性，為水貂阿留申病毒強毒株。

水貂阿留申病毒；分離；鑒定；免疫過氧化物酶單層細胞試驗

水貂阿留申病又稱漿細胞增多癥，是由阿留申病毒引起的水貂自身免疫系統(tǒng)紊亂性疾病。自1946年首次檢測到該病以來，世界各地水貂養(yǎng)殖場陸續(xù)發(fā)現該病，并給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經濟損失［1］。由于該病毒的致病機理比較特殊（形成抗原抗體復合物），迄今為止尚未研制出安全有效的預防制劑。因此水貂阿留申病疫苗的研制，一直是動物醫(yī)學界很棘手的問題。

本實驗對疑似感染阿留申病毒致死的水貂內臟進行研磨，通過貓腎傳代細胞系（CRFK） 對病毒分離培養(yǎng)，并通過PCR和動物回歸實驗對所分離出的病毒進行鑒定，以便為深入研究水貂阿留申病毒奠定基礎。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物、菌種、質粒和細胞。PCR克隆載體pMD18-T與感受態(tài)細胞JM109，購自TaKaRa公司。貓腎傳代細胞（CRFK），購自中國科學院上海細胞庫。水貂阿留申病陰性水貂，購自黑龍江帽兒山水貂養(yǎng)殖場。

1.1.2主要試劑。UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒，購于上海生物工程技術服務有限公司；蛋白酶K、DNA分子量標準DL2000、Ex Taq酶、dNTP，購于大連寶生物工程公司；DNA凝膠回收試劑盒、溴化乙啶（EB）、瓊脂糖、瓊脂粉，購于維特潔公司；MEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清，購于Hyclone公司。

1.2方法

1.2.1病料的采集及處理。2012年11月，從黑龍江、吉林、遼寧和山東等地的數十家水貂養(yǎng)殖場，采集疑似感染阿留申病死亡的水貂內臟372份。對采集的內臟，加入MEM液體培養(yǎng)基后研磨和離心，收集上清。經0. 22 μm的濾膜過濾后，-40℃保存，用于病毒細胞培養(yǎng)。

1.2.2病毒分離及TCID50的測定。按常規(guī)細胞傳代方法，對所有采集的病料進行病毒分離［2］。取1 mL處理后的病料上清，接種長滿單層的CRFK細胞，吸附2～6 h后，再加入9 mL的維持液，在31.7 ℃、5% CO2的條件下，培養(yǎng)5～6天，反復凍融3次，收獲培養(yǎng)物重新接種細胞，進行病毒盲傳。三代后，-70℃低溫保存。應用免疫過氧化物酶實驗對所分離的病毒進行鑒定和TCID50的測定。CRFK細胞長滿單層后，消化并接種于96孔板中，與此同時，將分離的病毒從10-1開始做10倍連續(xù)稀釋，接種于96孔板中。待細胞長滿單層后，棄去培養(yǎng)液，用PBS（PH7.2，100 μL/孔）洗滌一次后，用無水乙醇（含3%雙氧水）4℃固定45 min。再用PBS洗滌三次后，每孔加入50 μL水貂阿留申病陽性血清（1:100倍稀釋），37℃孵育1 h。棄去板中液體，三次洗滌后，每孔加入50 μL HPR標記的兔抗IgG（Sangon，1：4 000倍稀釋），37 ℃孵育1 h。洗滌后，每孔加入新鮮配置的DAB液200 μL，在避光處顯色5 min。棄去上清，用蒸餾水洗滌后，每孔加入Harris-蘇木素液200 μL復染2 min。純水洗滌5 min后，顯微鏡下觀察結果。

1.2.3病毒電鏡觀察。將CRFK細胞第9代細胞培養(yǎng)物反復凍融3次后，3 000 r/min 離心20 min，取上清液，經2%磷鎢酸負染后，進行電鏡觀察。

1.2.4病毒PCR鑒定及序列分析。應用UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒，按照說明書提取病毒DNA。根據Qie等［3］1996年設計的一對ADV特異性引物對所分離的毒株進行PCR鑒定，擴增693 bp的目的片段，引物序列如下：上游P1：5'-CTTGTCACGCTACTAGAATGGT 3'，下游P2：5'-AGCTTAAGGTTAGTTTACATGGTTTACT 3'。反應體系為：95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性0.5 min，50 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸l min，40個循環(huán)。循環(huán)結束后72 ℃繼續(xù)延伸7 min，最后置4 ℃保存。PCR產物純化后與pMD18-T載體連接并轉化至JM109感受態(tài)細胞中，通過藍白斑篩選，選取陽性克隆進行鑒定及測序。

1.2.5動物回歸實驗。將18只120日齡非免疫健康水貂（經多次對流免疫電泳檢測為陰性）隨機分成6組，每組3只，第1～5組水貂每只腹腔接種細胞培養(yǎng)分離的病毒液3 mL（104.0TCID50/mL），第6組每只腹腔接種3 mL生理鹽水，做為空白對照。接種后隔離飼養(yǎng)，每天觀察臨床癥狀，檢查其體溫、呼吸、精神、食欲與糞尿等情況，連續(xù)觀察60天。

2　結果

2.1病毒的TCID50的測定

將病貂內臟研磨接種CRFK細胞后，應用免疫過氧化物酶單層細胞實驗進行鑒定。顯微鏡下觀察可見，接種病毒的細胞特定部位被染成棕色或棕黃色，細胞邊界清楚、結構清晰（圖1a）。而陰性對照染色淡且無規(guī)律（不是在細胞的特定位置或存在于細胞間隙，見圖1b）。本實驗選取可傳至第9代的5株分離病毒，測得細胞培養(yǎng)物的病毒含量分別為：105.7TCID50/mL、105.0TCID50/mL、104.6TCID50/ mL、105.2TCID50/mL、104.1TCID50/mL，并分別命名為ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-ZJ3、ADVQD2、ADV-QD3。

圖1a 接種病毒后的細胞染色結果

圖1b 正常細胞染色結果

2.2病毒電鏡觀察結果

對分離的病毒進行電鏡觀察，可見病毒呈倒六邊形、無囊膜，大小在20～26 nm的病毒樣粒子（圖2）。

圖2　 ADV-DA125分離病毒電鏡觀察結果

2.3病毒的PCR鑒定及序列分析

以提取的病毒DNA為模板，根據GenBank上ADV-U株基因序列設計的引物進行PCR擴增，得到693 bp片段（圖3），與預期結果相符，進一步證實了所分離的病毒為ADV。

圖3　 PCR檢測結果

將PCR擴增片段進行測序，分析分離毒株與標準對照毒株ADV-G相應片段的核酸同源性分別為98.8 %、94.7 %、92.8 %、94.1 %和93.5 %，與強毒參考株ADV-Utah的同源性分別為94.4 %、98.3 %、96.7 %、95.1 %和94.8 %（圖4）。由于該擴增片段包含約40個核苷酸的超變區(qū)，此同源性足以說明擴增產物具有良好的特異性，確定為ADV 的DNA特異性片段。

圖4　 5株分離株PCR擴增產物與標準毒株相對應基因片段的同源性分析

2.4水貂攻毒發(fā)病實驗

將5株分離病毒，分別腹腔接種第1～5組水貂，3 mL/只，第6組腹腔接種等量的生理鹽水，連續(xù)隔離觀察60天。接種病毒組水貂均表現出消瘦、皮毛無光澤、拒食、狂飲，有些表現抽搐、痙攣、步態(tài)蹣跚、共濟失調等神經癥狀（圖5-1）。其中ADV-DL124、ADV-DL125兩接種組發(fā)病較為明顯，表現為：前期暴躁，后精神沉郁，隨即出現抽搐、痙攣等癥狀。5個病毒接種組發(fā)病率均為100%。對照組均飲食正常，健康狀況良好（圖5-2）。對接種病毒的水貂解剖后觀察組織器官病變，可見腎、肝、脾、淋巴結腫大出血，胃腸道出血（圖5-3），對流免疫電泳檢測及PCR鑒定結果均為陽性。對照組無明顯病變說明所分離的病毒對水貂具有致病性，為水貂阿留申病毒強毒株。

圖5　-1 水貂阿留申病發(fā)病水貂

圖5　-2 健康水貂

圖 5-3 水貂阿留申病發(fā)病水貂內臟

3　討論

水貂阿留申病毒從強致病力毒株ADV-U到ADV-K、ADV-Pullman、ADV TR、ADV SL3等不同地區(qū)的分離毒株，在宿主的選擇和致病力等方面，均存在一定的差異（Gottschalck E等和Aasted B等）［4-5］。ADV-G是ADV-U適應體外細胞培養(yǎng)后失去致病力的實驗室株，可以在細胞內任意復制（Van Dawen S等）［6］，但對成年水貂無致病性。ADV-SL3是唯一的既易于在體外培養(yǎng)又具有致病力的毒株（Bloom ME等）［7］，其它強毒株的體外細胞培養(yǎng)復制能力都較弱。目前細胞培養(yǎng)方法仍是水貂阿留申病毒分離、鑒定的最常用方法，但往往由于阿留申病毒在傳代細胞上不產生或產生不明顯的CPE，致使給病毒TCID50的測定帶來一定的困難。

IPMA 是通過將標記酶的抗體（抗原）與抗原（抗體）相結合，形成酶標抗體-抗原復合物。復合物上的酶，在遇到相應的底物時催化底物分解，使供氫體被氧化而生成有色物質（韋選民等）［8］。該方法具有特異強、敏感高、操作簡便等特點，并在豬圓環(huán)病毒的檢測中已得到應用（劉長明等和郭全海等）［9-10］?；谪i圓環(huán)病毒與水貂阿留申病毒相似，同樣不產生CPE，因此本實驗嘗試應用IPMA對所分離的水貂阿留申病毒進行檢測及TCID50的測定，為該病毒的生物學特性研究提供了可行的技術方法。

研究表明，水貂阿留申病細胞滅活疫苗具有一定的免疫保護效果，但由于ADV感染水貂后，水貂體內不產生或只產生少量的中和抗體，而產生的多數抗體不僅不能中和病毒的毒力，反而通過介導抗體依賴性增強作用，有助于ADV對靶細胞的侵染。再有，病毒抗原與抗體形成的復合物（Immune Complex，IC）可導致IC沉積并引發(fā)腎小球腎炎和動脈炎。正是由于水貂阿留申病這種復雜的致病機理和免疫機理，迄今為止尚未開發(fā)出有效防治水貂阿留申病的疫苗。本實驗對疑似水貂阿留申病死亡病貂內臟處理后接種CRFK細胞分離病毒，并對分離的毒株進行PCR鑒定及動物回歸試驗，成功分離并鑒定出5株ADV毒株，為水貂阿留申病疫苗的研制奠定了基礎。

［1］ Farid A H，Rupasinghe P，Mitchell J L，et al. A survey of Aleutian mink disease virus infection of feral American mink in Nova Scotia［J］. Vet J，2010，51：75-77.

［2］ 梁冬瑩. ADV分離株全基因序列測定及VP2抗原表位區(qū)的表達與應用［D］. 哈爾濱：東北林業(yè)大學，2007年.

［3］ Oie K，Durrant G，Wolfinbarger J B，et al. The relationship between capsid protein （VP2） and pathogenicity of Aleutian mink disease parvovirus（ADV）：a possible role for in the transmission of ADV infections［J］.Virol，1996，70（2）：852-861.

［4］ Gottschalck E，Alexandersen S，Cohn A，et a1.Nucleofidesequence analysis of Aleutian mink disease parvovirus shows that multiple virus types are present in infected mink［J］. J Viro1，1991，65（8）：4378-4386.

［5］ Aasted B，Avery B，Cohn A. Serological analyses of different mink Aleutian disease virus strain［J］. Arch Viro1，1984，80（1）：11-22.

［6］ Van Dawen S，Kaaden O R，Both S. Propagation of Aleutian disease parvovirus in cell line CCC clone 81［J］. Arch Viro1，1983，77（1）：39-50.

［7］ Bloom M E，Alexandersen S，Perryman S，et al. Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus（ADV）：Sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV［J］. J Virol，1988，62（8）：2903-2915.

［8］韋選民，任蕊萍.動物疾病實驗室檢驗手冊［M］. 1版. 北京：中國農業(yè)出版社，2006：104.

［9］劉長明，張超范，危艷武，等. 豬圓環(huán)病毒2 型免疫過氧化物酶單層細胞試驗抗體檢測試劑盒的研制及應用［J］. 中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（8）：621-633.

［10］郭全海，劉秀玲. 免疫過氧化物酶單層細胞試驗檢測豬圓環(huán)病毒2 型方法的建立［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，6（11）：122-123.

（責任編輯：朱迪國）

Isolation and Identif cation of Five Strains of Aleutian DiseaseViruses in Mink

Liu Dongxu，Shi Kun，Li Jianming，Zeng Fanli，Liu Fei，Du Rui
（College of Chinese Medicine Material，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118）

In order to lay foundation for the development of Aleutian disease vaccine，the CRFK cells were used to isolate the ADV with viscera samples collected from the dead minks which was suspected ADV infection sampled. The isolated strains were identified by PCR and regression experiments on animal. At the same time，Immunoperoxidase monolayer assay（IPMA）was used to detect the median tissue culture infective doses（TCID50）of isolated strains in the first time. Five strains of ADV（ADV-DL124，ADV-DL125，ADV-ZJ3，ADV-QD2，ADV-QD3）were isolated whose TCID50 were 105.7 TCID50/mL，105.0 TCID50/mL，104.6 TCID50/mL，105.2 TCID50/mL，and 104.1 TCID50/mL，respectively. These results of regression experiments on animal indicated that the isolated virus were the virulent strains of AD virus.

ADV；isolation；identification；IPMA

S851.3

A

1005-944X（2015）12-0073-05

杜 銳