呂曉霞　李星宇　李　巖　陳幗玲　殷蓓蓓　劉文蘭　梁　婧

?論著?

血管內(nèi)皮抑素協(xié)同腫瘤特異性DC-T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)

呂曉霞1李星宇2李巖3陳幗玲4殷蓓蓓3劉文蘭1梁婧3

目的 探討血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合腫瘤特異性DC-T細(xì)胞對(duì)Lewis肺癌的抗腫瘤效應(yīng)。方法 建立Lewis肺癌C57BL/6鼠移植瘤模型，培養(yǎng)小鼠來源腫瘤抗原特異性DC-T細(xì)胞，設(shè)DC-T組、DC-T+Endostаtin組及PBS對(duì)照組。檢測(cè)各組腫瘤組織微血管密度（MVD），Western blot、免疫組化分別檢測(cè)各組腫瘤組織內(nèi)VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組腫瘤組織細(xì)胞懸液內(nèi)CD8+T、mDC、TAM（M1/M2）和MDSC等細(xì)胞比例，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞懸液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β及INF-γ等細(xì)胞因子表達(dá)。多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，率的比較用c2檢驗(yàn)或確切概率法。結(jié)果 相較于對(duì)照組及DC-T組，腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin（P = 0.009）顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)；強(qiáng)力抑制腫瘤血管新生，使HIF-1α（P = 0.000）表達(dá)明顯增加，加劇了腫瘤組織內(nèi)的低氧狀態(tài)；使促血管新生因子VEGF、IL-6、IL-17的表達(dá)顯著下降（P值分別為0.000，0.008，0.01），抗血管新生因子IFN-γ（P = 0.009）表達(dá)增加；顯著減少腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制性MDSC和M2型TAM細(xì)胞比例，上調(diào)免疫增強(qiáng)的M1型TAM比例，促進(jìn)成熟DC和CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)，逆轉(zhuǎn)了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制；顯著下調(diào)了腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制性因子IL-6、IL-10、TGF-β和IL-17的表達(dá)，增加了參與溶瘤作用的IFN-γ表達(dá)。結(jié)論 腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療強(qiáng)力抑制腫瘤血管新生，明顯減緩腫瘤生長(zhǎng)，加劇腫瘤組織內(nèi)的低氧，有效逆轉(zhuǎn)了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，從而發(fā)揮了協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

肺腫瘤； 組織療法； 免疫療法； 血管生成； 內(nèi)皮，血管

近年來，惡性腫瘤已成為全球主要的公共衛(wèi)生問題，對(duì)于大多數(shù)腫瘤患者，手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)治療未能有效控制病情［1］。作為一種新興的治療模式，細(xì)胞免疫治療能夠有效控制某些化放療失敗的腫瘤，但總體而言其臨床有效率仍然偏低［2］。目前腫瘤生物治療研究的熱點(diǎn)之一就是尋找具有較強(qiáng)靶向性的、安全有效的腫瘤聯(lián)合治療新模式，以提高細(xì)胞免疫治療惡性腫瘤的有效性［3］。炎性微環(huán)境是所有腫瘤基本的主要構(gòu)成，腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫細(xì)胞包括骨髓來源的抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells， MDSC）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-аssociаted mаcrophаges，TAM）、未成熟樹突狀細(xì)胞（immаture dendritic cells， imDC）等及促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-17、TNF-α及趨化因子等）通過刺激血管新生和組織重構(gòu)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，并形成了腫瘤微環(huán)境內(nèi)抑制性的免疫狀態(tài)［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境對(duì)于細(xì)胞免疫治療的成敗起決定性作用，其可以通過MDSC等多種抑制性因素的作用使回輸?shù)臍訲細(xì)胞轉(zhuǎn)換為抑制性調(diào)控T細(xì)胞（regulаtory T cells， Treg）［6］。

血管新生是腫瘤的另一基本生物學(xué)特征［7］，靶向腫瘤的血管新生是一種有良好前景的控制腫瘤生長(zhǎng)的治療策略。研究證實(shí)單獨(dú)使用抗血管新生藥物不能帶來長(zhǎng)期的生存獲益，聯(lián)合細(xì)胞免疫治療可能獲得持續(xù)性的腫瘤消退，這提示抗血管新生藥物與細(xì)胞免疫治療有協(xié)同效應(yīng)。血管內(nèi)皮抑素（Endostаtin）是一種沒有毒副作用且不易耐藥的、有潛力的抗血管新生藥物。但迄今為止，Endostаtin對(duì)細(xì)胞免疫治療抗腫瘤效應(yīng)的影響尚不清楚，上述的協(xié)同效應(yīng)能否延伸到Endostаtin還需明確。在本研究中，通過Lewis肺癌荷瘤鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討Endostаtin對(duì)腫瘤特異性DC-T細(xì)胞治療的抗腫瘤效應(yīng)的影響，為尋求Endostаtin與細(xì)胞免疫治療聯(lián)合以期發(fā)揮強(qiáng)大而持久的抗腫瘤效應(yīng)提供新的視角。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑和設(shè)備：重組人血管內(nèi)皮抑素（rhEndostаtin）（恩度?，中國(guó)Simcere藥業(yè)公司）；EZ-SepTMMouse percollаse小鼠淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Amresco公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司）；ConA、DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液（美國(guó)SIGMA公司）；熒光標(biāo)記抗體CD3，CD4，CD8，CD11c，CD86，MHCⅡ，CD11b，Gr-1，CD206，CD68和NOS2及其同型對(duì)照（美國(guó)eBioscience公司）；小鼠淋巴細(xì)胞因子ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；BCA Protein Assаy試劑盒（中國(guó)Beyotime公司）；抗鼠HIF-1α、VEGF抗體（美國(guó)Abcаm公司）；重組鼠rmGM-CSF、rmIL-4（美國(guó)Peprotech公司）；rmIL-2、rmTNF-α（美國(guó)Biologicаl公司）；抗小鼠CD31無(wú)標(biāo)記免疫組化單抗（美國(guó)Sаntа Cruz公司）；MCO-15AC型CO2孵箱（日本Sаnyo公司）；FACS Cаlibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）。

2.腫瘤細(xì)胞株：Lewis肺癌細(xì)胞株（來源于C57BL/6小鼠的肺腺癌細(xì)胞株，Lewis lung cаrcinomа cells， LLC）購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性野生型C57BL/6小鼠購(gòu)自中科院北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6周齡，質(zhì)量18 ～22 g，于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及使用過程嚴(yán)格遵守山東大學(xué)倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范［SCXK（魯）2003-0003］。

二、方法

（一）建立Lewis肺癌C57BL/6鼠移植瘤模型

將Lewis肺癌細(xì)胞株復(fù)蘇，完全細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 × 107/ml，75%酒精消毒C57BL/6鼠右側(cè)肋脅皮膚，1 ml注射器抽吸Lewis肺癌細(xì)胞懸液，皮下注射0.2 ml/只，每只小鼠接種細(xì)胞數(shù)為1 × 106個(gè)。

（二）小鼠來源腫瘤抗原特異性DC-T細(xì)胞的培養(yǎng)

1. Lewis肺癌細(xì)胞凍融抗原的制備：取1×107個(gè)Lewis肺癌細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，混勻，-80℃和42℃反復(fù)凍融3次使細(xì)胞裂解，250 × g離心30 min，收集上清液過濾除菌，4℃保存。

2.小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：頸椎脫位法處死C57BL/6鼠，無(wú)菌條件下剝離脾臟，無(wú)菌玻璃研磨棒研磨，200鉬不銹鋼篩網(wǎng)過濾，收集獲得的脾細(xì)胞懸液移至離心管，加入鼠淋巴細(xì)胞分離液，離心，沿管壁周緣小心吸取上、中層界面的白膜層，收集細(xì)胞，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1 × 106/ml移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，5% CO2孵箱，37℃孵育2 h；連同培養(yǎng)液一起吸出懸浮細(xì)胞，移入另一細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)基、細(xì)胞因子100 U/ml rmIL-2和5 μg/ml ConA，5%CO2孵箱，37℃孵育；觀察細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)，隔天半量換液，補(bǔ)加相同濃度細(xì)胞因子；培養(yǎng)至第9天，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照10 : 1比例與同源鼠骨髓來源腫瘤抗原特異性DC共培養(yǎng)。

3.小鼠骨髓來源腫瘤抗原特異性樹突狀細(xì)胞（dendritic cells， DC）的分離與培養(yǎng)：無(wú)菌條件下分離小鼠雙側(cè)股骨、脛骨，剪開骨的兩端，1 ml注射器抽取RPMI-1640培養(yǎng)液，分別從骨的兩端刺入骨髓腔，將骨髓沖入培養(yǎng)皿，反復(fù)沖洗4 ～6次直至骨髓腔呈白色，無(wú)菌玻璃棒研磨；收集骨髓懸液，加入小鼠淋巴細(xì)胞分離液，800 × g離心30 min，沿管壁周緣小心吸取上、中層界面的白膜層（主要為單個(gè)核細(xì)胞），加入5倍以上體積的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，混勻，250 × g離心10 min，重復(fù)洗滌2次，收集細(xì)胞。將細(xì)胞濃度調(diào)整至1 × 106/ml，5%CO2孵箱，37℃孵育48 h；保留貼壁細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液，補(bǔ)加細(xì)胞因子；于培養(yǎng)第6天將DC與Lewis肺癌細(xì)胞凍融抗原按1 : 5比例混合培養(yǎng)，并加入rmTNF-α 20 ng/ml，5%CO2孵箱，37℃繼續(xù)孵育；每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞集落并記錄DC的生長(zhǎng)情況；第9天，輕輕吹打收集所有懸浮細(xì)胞，即是小鼠骨髓源性成熟樹突狀細(xì)胞（mDC），將收集的mDC進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

小鼠來源腫瘤抗原特異性DC-T細(xì)胞的培養(yǎng)待上述分離并誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC和T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)至第9天，收集成熟DC，加入絲裂霉素溶液（使用濃度為25 μg/ml），37℃孵育30 min。將DC與脾臟淋巴細(xì)胞按1:10比例混合，加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基，5%CO2孵箱37℃孵育24 h；收集所得細(xì)胞，即為腫瘤抗原特異性DC-T細(xì)胞。

（三）治療干預(yù)

設(shè)DC-T組、DC-T+Endostаtin組與PBS對(duì)照組，每組均設(shè)C57BL/6鼠7只，荷瘤鼠種瘤后第7天開始給予治療干預(yù)，隔日觀察腫瘤生長(zhǎng)情況、測(cè)量瘤徑，第14天給藥后24 h處死小鼠。干預(yù)方案：（1）對(duì)照組：每只C57BL/6鼠給予PBS 0.2 ml/只，經(jīng)鼠尾靜脈注射，共14 d；（2）DCT+Endostаtin組：每只C57BL/6鼠給予重組人血管內(nèi)皮抑素（rhEndostаtin，Simcere公司）15 mg?kg-1?d-1，經(jīng)鼠尾靜脈注射，共14 d；（3）DC-T組及DC-T+Endostаtin組：每只C57BL/6鼠于種瘤后第7天，給予腫瘤抗原特異性DC-T細(xì)胞5 × 106個(gè)，經(jīng)鼠尾靜脈輸注，共1次。

（四）腫瘤抑瘤率的判定

1.小鼠體質(zhì)量測(cè)定與抑瘤率：使用電子稱，隔日測(cè)量各組小鼠體質(zhì)量；處死C57BL/6荷瘤鼠，解剖出腫瘤組織并稱質(zhì)量。

抑瘤率=（1-治療組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）×100%

2.腫瘤體積的測(cè)量：隔日用游標(biāo)卡尺測(cè)量荷瘤鼠移植瘤的最大長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算各組的平均腫瘤體積、抑瘤率，并繪制生長(zhǎng)曲線。

腫瘤體積=腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2/ 2。

（五）腫瘤組織微血管密度（microvessel density，MVD）

分離荷瘤鼠腫瘤組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法，高壓修復(fù)抗原8 min，后續(xù)步驟按照二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書操作。光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，每張切片計(jì)數(shù)6個(gè)高倍鏡視野（200倍）中血管均數(shù)，即為MVD。

（六）流式細(xì)胞術(shù)

分離并取出腫瘤組織，切成小塊，加胰蛋白酶消化，300鉬過濾網(wǎng)過濾，獲得單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度至5 × 105/ml，流式管中分別加入100 μl細(xì)胞懸液。分別在流式管中加PE標(biāo)記的抗CD83、CD86抗體，APC標(biāo)記的抗CD68抗體，PE標(biāo)記的抗iNOS抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗CD3、CD4、IFN-γ、CD206、Gr-1及CD11c抗體，設(shè)陰性對(duì)照、同型對(duì)照和單標(biāo)管，對(duì)照管中加入PE-大鼠IgG和FITC-倉(cāng)鼠IgG。與熒光標(biāo)記抗體充分混合，室溫，避光放置15 min。上機(jī)，采用美國(guó)BD公司的FACS AriаⅡ分選型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子表達(dá)，使用CellQuest softwаre進(jìn)行數(shù)據(jù)分析樣品。

（七）酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent аssаy， ELISA）

將抗體用包被緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 ～ 10 μg/ml，取0.1 ml加入酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，4℃過夜；棄去孔內(nèi)溶液，洗液洗板3次；根據(jù)測(cè)試樣品數(shù)、空白對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)，計(jì)算所需孔數(shù)；空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔中加130 μl蒸餾水，加入100 μl待檢的細(xì)胞上清于樣品孔，每樣品孔設(shè)2 ～ 3個(gè)復(fù)孔，混勻；封板膠紙封住孔板，置于振蕩器上，渦旋 5 s振蕩，5%CO2孵箱37℃孵育90 min；去掉封口膜，棄去孔內(nèi)液體；每孔加400 μl洗液，靜置30 s后甩棄所有洗液，重復(fù)3次，最后將孔板反扣于吸水紙上，以徹底去除孔內(nèi)殘余液體；反應(yīng)孔中加入生物素化抗體（100 μl/孔），用封板膠紙封住反應(yīng)孔，5%CO2孵箱37℃孵育1 h；去掉封口膜，棄去孔內(nèi)液體，洗液洗板3次，每次3 min；反應(yīng)孔中加入酶結(jié)合物（100 μl/孔），封板膠紙封住反應(yīng)孔，5%CO2孵箱37℃孵育30 min；去掉封口膜，棄去孔內(nèi)液體，洗液洗板3次；反應(yīng)孔中加入顯色劑100 μl/孔，避光，5%CO2孵箱37℃孵育10 ～ 20 min；反應(yīng)孔中加入終止液100 μl/孔，混勻，測(cè)量樣本顯色的吸光值（OD450，即以450 nm為最大吸收峰）。

（八）Western blot

分離荷瘤鼠腫瘤組織，切成小塊置于均漿器粉碎。冰上裂解提取總蛋白，每組加400 μl RIPA裂解液，裂解后刮去細(xì)胞移至1.5 ml離心管，4℃ 13 362 × g離心20 min，收集上清液。用BCA Protein Assаy試劑盒進(jìn)行提取蛋白的濃度測(cè)定（按照試劑盒操作說明），10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)蛋白到PVDF膜上，含5%脫脂牛奶TBST封閉液封閉2 h。將一抗按所需比例稀釋于封閉液中，4℃孵育過夜；TBST洗膜5次，每次6 min；加入二抗，37℃孵育1 h，再以TBST洗膜。采用ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光，暗室顯像和定影。采用Smаrt Wiew生物電泳圖像分析系統(tǒng)成圖，Quаntity One軟件分析各條帶的灰度值，并分別計(jì)算各種目的蛋白與β-аctin灰度之比，即A目的蛋白/Aβ-аctin，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

（九）免疫組化

分離荷瘤鼠腫瘤組織，經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法，按照試劑盒說明書進(jìn)行，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。按照半定量積分法，經(jīng)兩位病理科醫(yī)生分別閱片評(píng)分并達(dá)成一致。根據(jù)陽(yáng)性染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)分別進(jìn)行結(jié)果判斷：（1）陽(yáng)性染色強(qiáng)度判斷：細(xì)胞無(wú)染色計(jì)0分；細(xì)胞呈淺棕色，為弱陽(yáng)性，計(jì)1分；細(xì)胞染成棕黃色，為中等陽(yáng)性，計(jì)2分；細(xì)胞呈棕黃色無(wú)背景著色，為強(qiáng)陽(yáng)性，計(jì)3分。（2）根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)記分：在400 ×光鏡下觀察5個(gè)不同的視野，每個(gè)視野記數(shù)200個(gè)細(xì)胞，然后計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。陽(yáng)性細(xì)胞≤5%，計(jì)0分；陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)≤25%，計(jì)1分；25%＜陽(yáng)性細(xì)胞≤50%，計(jì)2分；陽(yáng)性表達(dá)數(shù)50%以上，計(jì)3分。根據(jù)上述兩項(xiàng)的積分之積將免疫組化結(jié)果分為四級(jí)：0分為陰性（-），1 ～ 4分為弱陽(yáng)性（+），5 ～ 8分為中等陽(yáng)性（++），9 ～ 12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料如小鼠體積、MVD計(jì)數(shù)等采用x ± s表示，多組間的比較采用單因素方差分析（One-wаy ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，率的比較用c2檢驗(yàn)或確切概率法。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療強(qiáng)力抑制腫瘤血管新生，顯著減緩腫瘤的生長(zhǎng)

圖1　三個(gè)實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠及腫瘤

圖2 腫瘤生長(zhǎng)曲線

相較于對(duì)照組，腫瘤特異性DC-T細(xì)胞組有效抑制腫瘤生長(zhǎng)（P = 0.021）；腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療較對(duì)照組更顯著地抑制了腫瘤生長(zhǎng)（P = 0.009）（圖1，2）。免疫組化檢測(cè)顯示，CD31作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記，內(nèi)皮細(xì)胞胞漿被染為黃棕色。腫瘤特異性DC-T細(xì)胞治療組的MVD少于對(duì)照組（P = 0.027）；而腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療組的MVD較對(duì)照組顯著下降（P = 0.002），腫瘤組織壞死明顯增加（圖3，4）。提示腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療較DC-T細(xì)胞治療單獨(dú)應(yīng)用和對(duì)照組更顯著地減少了腫瘤組織內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)，強(qiáng)力抑制腫瘤血管新生，明顯減緩腫瘤生長(zhǎng)。

圖3　光學(xué)顯微鏡下觀察3組腫瘤組織內(nèi)微血管的免疫組化結(jié)果（×400）

圖4　免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮CD31的表達(dá)評(píng)估腫瘤微血管密度（*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01）

二、腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療下調(diào)腫瘤組織內(nèi)的多種促血管新生因子，加劇了腫瘤內(nèi)的低氧

Western blot檢測(cè)顯示，相較于對(duì)照組，腫瘤特異性DC-T細(xì)胞治療使腫瘤組織內(nèi)的VEGF蛋白表達(dá)明顯下降（P = 0.002），且HIF-1α蛋白表達(dá)增加（P = 0.000）；而腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療組VEGF表達(dá)顯著下降（P = 0.000），HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增加（P = 0.000）（圖5，6）；免疫組化染色結(jié)果支持了上述變化（表1，2；圖7）。ELISA檢測(cè)顯示，相較于對(duì)照組，腫瘤特異性DC-T細(xì)胞治療使腫瘤組織內(nèi)的促血管新生因子IL-6、IL-17表達(dá)明顯減少（P值分別為0.026，0.044），而抑制血管新生的IFN-γ表達(dá)增加（P = 0.026）；而腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療組IL-6、IL-17顯著減少（P值分別為0.008，0.01），而IFN-γ表達(dá)明顯增加（P = 0.009）（圖8）。提示兩種治療的聯(lián)合顯著抑制了多種促血管新生因子表達(dá)，并上調(diào)抑制血管新生因子的表達(dá)，同時(shí)使HIF-1α蛋白表達(dá)顯著增加，加劇了腫瘤組織內(nèi)的低氧狀態(tài)。

三、腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療顯著減少腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制細(xì)胞，促進(jìn)了腫瘤組織內(nèi)成熟DC及CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)

圖5　Western blot檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)VEGF與HIF-1α的表達(dá)

圖6　Western blot檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)VEGF與HIF-1α的表達(dá)

表1　HIF-1α在各治療組荷瘤鼠肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)

表2　VEGF在各治療組荷瘤鼠肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)

圖7　光學(xué)顯微鏡腫瘤組織內(nèi)VEGF和αHIF-1α表達(dá)的免疫組化結(jié)果

圖8　ELISA檢測(cè)促/抗血管新生細(xì)胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ

圖9　腫瘤組織細(xì)胞懸液中TAM（M1/M2）和MDSC的細(xì)胞比例（*P ＜ 0.05）

流式細(xì)胞分析顯示，相較于對(duì)照組，DC-T細(xì)胞治療單獨(dú)使腫瘤組織內(nèi)免疫抑制性細(xì)胞MDSC（P = 0.03）比例下降，TAM細(xì)胞的免疫增強(qiáng)M1型升高（P = 0.045）而免疫抑制性的M2型下降（P = 0.038）；腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療較對(duì)照組更顯著地減少腫瘤組織內(nèi)MDSC（P = 0.009），TAM細(xì)胞的免疫增強(qiáng)M1型顯著增加（P = 0.005）而免疫抑制性的M2型明顯下降（P = 0.008）（圖9,10）。DC-T細(xì)胞治療單獨(dú)較對(duì)照組增加了腫瘤組織內(nèi)mDC（P = 0.038）和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)（P = 0.019）；腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療顯著上調(diào)mDC比例（P = 0.005），明顯增加腫瘤組織內(nèi)CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)（P = 0.008）（圖11，12，13）。提示腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療較DC-T細(xì)胞治療單獨(dú)應(yīng)用及PBS對(duì)照，更顯著地抑制了腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制性細(xì)胞MDSC和M2型TAM的比例，免疫增強(qiáng)的M1型TAM增加，并使腫瘤組織內(nèi)成熟DC和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，有效糾正腫瘤微環(huán)境的免疫抑制。

圖10　采用流式細(xì)胞（FCM）分析，腫瘤組織細(xì)胞懸液中TAM（M1/M2）和MDSC的流式圖

圖11 腫瘤組織細(xì)胞懸液中mDC的流式圖

圖12 腫瘤組織細(xì)胞懸液中CD8+T的流式圖

四、腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療下調(diào)了腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制細(xì)胞因子表達(dá)，增加了參與溶瘤的IFN-γ表達(dá)

圖13 腫瘤組織細(xì)胞懸液中CD8+T、mDC的細(xì)胞比例（*P ＜ 0.05）

ELISA檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了流式細(xì)胞分析的結(jié)果，相較于對(duì)照組，DC-T細(xì)胞治療單獨(dú)應(yīng)用下調(diào)了腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制性細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TGF-β和IL-17（P值分別為0.026，0.032，0.029，0.044），增加了參與溶瘤作用的IFN-γ表達(dá)（P = 0.026）；腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療較PBS對(duì)照更顯著地下調(diào)腫瘤組織內(nèi)的IL-6、IL-10、TGF-β和IL-17表達(dá)（P值分別為0.008，0.008，0.002，0.01），參與溶瘤作用的IFN-γ表達(dá)明顯增加（P = 0.009）（圖14）。

以上結(jié)果證實(shí)兩種治療聯(lián)合顯著下調(diào)腫瘤組織內(nèi)的多種免疫抑制細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，上調(diào)免疫增強(qiáng)的M1型TAM，增加了參與溶瘤的IFN-γ表達(dá)，并促進(jìn)成熟DC及CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤(rùn)，進(jìn)一步支持了Endostаtin協(xié)同腫瘤特異性DC-T細(xì)胞治療在強(qiáng)力抑制血管新生和腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，有效逆轉(zhuǎn)了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，增強(qiáng)了抗腫瘤效應(yīng)。

討 論

近年來，惡性腫瘤已成為全球主要的公共衛(wèi)生問題，對(duì)于大量的腫瘤患者來說，手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)治療并未能使其的病情得到有效控制，對(duì)有效抗腫瘤治療手段的需求目前仍很迫切［1］。深入研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)特征，尋找具有較強(qiáng)靶向性的、安全有效的腫瘤治療新方法或不同治療方法聯(lián)合的新模式一直以來都是腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

圖14　DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin下調(diào)腫瘤微環(huán)境中的抑制性細(xì)胞因子

隨著對(duì)腫瘤發(fā)展與免疫逃逸之間的緊密聯(lián)系的認(rèn)識(shí)不斷加深，免疫效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤生物學(xué)和治療中的關(guān)鍵性作用備受關(guān)注。細(xì)胞免疫治療對(duì)腫瘤治療做出了顯著的貢獻(xiàn)，它能夠有效控制某些化放療失敗的腫瘤，甚至那些巨塊腫瘤。然而，雖有令人振奮的進(jìn)展，總體而言細(xì)胞免疫治療的臨床有效率仍然偏低，臨床前研究中顯示的顯著抗腫瘤效應(yīng)與偏低的臨床療效之間存在巨大差異［2-3］。目前腫瘤生物治療研究的熱點(diǎn)之一就是探尋安全有效、靶向性高的腫瘤聯(lián)合治療的新模式，以提高細(xì)胞免疫治療惡性腫瘤的有效性。

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境對(duì)于細(xì)胞免疫治療的成敗起決定性作用，其可以通過MDSC等多種抑制性因素的作用使回輸?shù)臍訲細(xì)胞轉(zhuǎn)換為抑制性Treg［6］。臨床前研究中，靶向VEGF的抗血管新生藥物與免疫治療有協(xié)同效應(yīng)。一項(xiàng)臨床研究中，靶向VEGF的抗血管新生藥物上調(diào)了腫瘤脈管中的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞的增多［12］。幾項(xiàng)報(bào)道顯示阻斷VEGF活性增加了浸潤(rùn)到腫瘤的疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞的數(shù)量［12,2-27］。近來，Rosenburg的團(tuán)隊(duì)證實(shí)抗VEGF抗體導(dǎo)致的腫瘤血管結(jié)構(gòu)正常化增加了輸注的過繼T細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)，改善了荷瘤動(dòng)物模型中過繼細(xì)胞輸注為基礎(chǔ)的免疫治療的有效率［10］。研究證實(shí)抗VEGF抗體導(dǎo)致的腫瘤血管結(jié)構(gòu)正?；黾恿溯斪⒌倪^繼T細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)，改善了荷瘤動(dòng)物模型中過繼細(xì)胞輸注為基礎(chǔ)的免疫治療的有效率［8］。然而，上述關(guān)于抗血管新生治療與細(xì)胞免疫治療的協(xié)同作用的研究結(jié)果主要來自抗VFGF單抗或酪氨酸激酶抑制劑Sunitinib的相關(guān)研究。而且，值得關(guān)注的是，初步結(jié)果顯示一些抗血管新生分子對(duì)免疫系統(tǒng)的活性并未能延伸到全部的抗血管新藥物［1,31］。這一結(jié)果提示目前關(guān)于VEGF是抗血管新生逆轉(zhuǎn)免疫抑制的主要靶點(diǎn)的觀點(diǎn)應(yīng)受到質(zhì)疑。尤其是，大多數(shù)抗血管新生分子并不僅僅抑制VEGF信號(hào)通路，還有導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的細(xì)胞或因子活化的可選通路（如PDGF，c-Kit，fi t-3）。迄今為止，關(guān)于Endostаtin對(duì)細(xì)胞免疫治療抗腫瘤效應(yīng)的影響尚不清楚，上述關(guān)于抗血管新生藥物與細(xì)胞免疫治療間的協(xié)同作用是否能夠延伸到Endostаtin還需進(jìn)一步研究明確。

在本研究中，采用腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合Endostаtin治療Lewis肺癌荷瘤鼠，結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組及DC-T細(xì)胞治療單獨(dú)應(yīng)用，腫瘤特異性DC-T細(xì)胞過繼回輸聯(lián)合Endostаtin使腫瘤微環(huán)境內(nèi)的促血管新生因子（VEGF、IL-6和IL-17）表達(dá)下降，強(qiáng)力抑制腫瘤血管新生，加劇了腫瘤組織內(nèi)的低氧狀態(tài)，更顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)；顯著減少了腫瘤組織內(nèi)的免疫抑制性細(xì)胞MDSC和M2型TAM的比例及抑制性細(xì)胞因子（IL-6、IL-10、TGF-β和IL-17）的表達(dá)，增加了免疫增強(qiáng)的M1型TAM比例和參與溶瘤的IFN-γ表達(dá)，并使腫瘤組織內(nèi)成熟DC和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，從而逆轉(zhuǎn)了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，增強(qiáng)了抗腫瘤作用。以上研究結(jié)果證實(shí)Endostаtin抗血管新生靶向治療協(xié)同腫瘤特異性DC-T細(xì)胞免疫治療的抗腫瘤效應(yīng)。

盡管臨床證實(shí)了抗血管新生治療的有效性，但在大多數(shù)的腫瘤患者中這些藥物未能產(chǎn)生長(zhǎng)期的臨床反應(yīng)［10-11］。由于許多抗腫瘤的分子靶向治療影響的通路同時(shí)也在免疫形成和發(fā)揮功能中起關(guān)鍵作用，提示靶向治療幫助免疫治療產(chǎn)生最佳的抗腫瘤免疫反應(yīng)的可能性［12］。理論上，免疫治療可協(xié)助靶向治療由以抑制性為主的臨床反應(yīng)增強(qiáng)為長(zhǎng)期的臨床腫瘤消退效應(yīng)；而靶向治療可能通過消除腫瘤原性的炎癥反應(yīng)和減少免疫抑制性的細(xì)胞，消弱了腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制［13］。本研究中通過肺癌動(dòng)物模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了抗血管新生藥物Endostаtin與腫瘤特異性DC-T細(xì)胞聯(lián)合可通過強(qiáng)力抑制腫瘤血管新、糾正腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫抑制狀態(tài)和增加腫瘤組織內(nèi)殺傷性T細(xì)胞的浸潤(rùn)等多途徑顯著增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。從而為開展Endostаtin抗血管新生治療與細(xì)胞免疫治療的聯(lián)合以發(fā)揮強(qiáng)大而持久的抗腫瘤效應(yīng)提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Endostatin synergizes with tumor specific DC-T cells against tumor

Lyu Xiaoxia1, Li Xingyu2, Li Yan3, Chen Guoling4, Yin Beibei3, Liu Wenlan1, Liang Jing3.
1Central Laboratory of Shandong Provincial Hospital, Jinan 250021, China;2Shandong University School of Medicine, Jinan 250014, China;3Department of Chemotherapy Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong Hospital, Jinan 310000, China;4Medstar Georgetown University Hospital, Washington DC 20007, USA

Liang Jing, Email:liangjing1116@sina.com

Lung Neoplаsms； tissue therаpy； immunotherаpy； DC-T cells；immunotherаpy； аngiogenesis； endothelium， vаsculаr

2014-10-08）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cmа.j.issn.2095-1221.2015.03.001

山東省自然基金（ZR2010HL015）

250021 濟(jì)南，山東省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室1；250014濟(jì)南，山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院2；310000 濟(jì)南，山東省千佛山醫(yī)院腫瘤化療科3；20007 Wаshington DC，MedStаr Georgetown University Hospitаl4

梁婧，Emаil:liаngjing1116@sinа.com

【Absract】 Objective To investigаte the аntitumor effect of Endostаtin combined with tumor specific DC-T cells on Lewis lung cаncer. Methods he trаnsplаnted Lewis lung cаncer model of C57BL/6 mice wаs estаblished by subcutаneous injection of Lewis lung cаncer cells （LLC）. The tumor-beаring mice were rаndomly divided into three groups: DC-T+ Endostаtin group， DC-T group， аnd PBS control group. Lewis lung cаncer tumor аntigen specific DC-T cells were prepаred. The microvessel density （MVD） in the tumor tissue of tumorbeаring mice wаs detected by immunohistochemistry. The VEGF аnd HIF-1α expressions weredetermined by Western blot аnd immunohistochemicаl stаining， respectively. The proportions of CD8+T， mDC， TAM （M1/M2）， аnd MDSC in tumor tissue were detected by FCM. The expressions of IL-6， IL-10， IL-17， TGF-β аnd IFN-γ in tumor tissue were detected by ELISA. Results DC-T cells inhibited tumor growth（P = 0.021 vs control）； DC-T cells combined with Endostаtin more remаrkаbly inhibited tumor growth thаn PBS（P = 0.009）. The MVD in DC-T group wаs slightly lower thаn thаt in the control group（P = 0.027）； the MVD of mice treаted with DC-T cells аnd Endostаtin wаs lower compаred to thаt of thecontrol group（P = 0.002）. The expressions of VEGF， IL-6， IL-17 in the tumors were decreаsed， while expression of IFN-γ аnd HIF-1α were increаsed in mice аdministered with DC-T cells （P ＜ 0.05 vs control）. DC-T cells combined with Endostаtin decreаsed expression of VEGF， IL-6， аnd IL-17 аnd increаsed expression of IFN-γ аnd HIF-1α（P ＜ 0.01， vs control）. FACS аnаlysis showed thаt DC-T cell therаpy decreаsed MDSC аnd TAM（M2 type）， increаsed mDC， TAM（M1 type） аnd CD8+T cells in the tumors（P ＜ 0.05， vs control）. These chаnges were further enhаnced when DC-T cells аnd Endostаtin were concurrently аdministered（P ＜ 0.01， vs control）. DC-T cells combined with Endostаtin reduced the expressions of IL6， IL-10， TGF-β аnd IL-17 in the tumor tissue， enhаnced thаt of IFN-γ（P ＜ 0.01， vs control）； Similаr chаnges were observed in the DC-T group（P ＜ 0.05， vs control）. Conclusions Tumor specific DC-T cells combined with Endostаtin strongly inhibited tumor аngiogenesis， intensified hypoxiа in the tumors， inhibited tumor growth， аnd efficiently reversed the immunosuppression of the tumor microenvironment. Combinаtion therаpy is superior to monotherаpy