劉煥奇，黃海涵，肖繼友，胡學遠，王龍光

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島　266109；2. 山東省青島第二中學，山東青島　266032；3. 煙臺市芝罘區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺　264000）

不同系統(tǒng)進化群雞源大腸桿菌耐藥性調查分析

劉煥奇1，黃海涵2，肖繼友3，胡學遠1，王龍光1

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島266109；2. 山東省青島第二中學，山東青島266032；3. 煙臺市芝罘區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺264000）

［目的］通過系統(tǒng)進化群和耐藥性分析，了解雞源大腸桿菌致病菌株的分布情況及耐藥特征，為有效控制雞大腸桿菌病提供依據(jù)。［方法］采用微量肉湯稀釋法測定菌株耐藥表型（M?C），采用PCR法檢測耐藥基因和系統(tǒng)進化群分群試驗，采用SPSS17.0軟件進行差異顯著性分析。［結果］低致病群B1（38.1%）和非致病群A（34.0%）菌株分布相對較多，其次是高致病群D（21.2%）和B2（6.2%）；分離菌株對氨芐西林（87.2%）、四環(huán)素（87.0%）、復方新諾明（87.0%）和磺胺異噁唑（80.0%）耐藥嚴重，多重耐藥率高達98.86%，但對多粘菌素E敏感；耐藥基因sull（71.0%）、sul2（44.8%）、sul3（18.7%）、tetA（42.2%）、tetB（15.8%）、tetM（7.3%）均有檢出，tetC、tetO、tetK、tetL、tetW均未檢出，9.13%菌株同時攜帶3種sul基因，僅有一株菌同時攜帶3種tet基因。表型耐藥菌株攜帶耐藥基因的能力明顯高于非耐藥菌株（P＜0.05）。高致病群B2、D群耐藥程度較B1和A群嚴重，對氧氟沙星、慶大霉素、大觀霉素、頭孢噻呋、磺胺異噁唑、復方新諾明、奧格門丁等7種藥物差異顯著（P＜0.05）。［結論］我國雞源大腸桿菌高致病菌株檢出率高，且耐藥程度相對嚴重，在適宜條件下更易導致雞群發(fā)病且難以控制。

雞大腸桿菌；系統(tǒng)進化群；致病性；耐藥性

禽致病性大腸桿菌（Escherichia .coli，E.coli）能引發(fā)禽大腸桿菌病，可引起胚胎死亡、臍炎、敗血癥、肉芽腫、卵黃性腹膜炎、全眼球炎、氣囊病、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎等一系列病癥，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，而且也與人類腸外致病性大腸桿菌密切相關。它是毒力基因和耐藥基因的貯存宿主，可引發(fā)人類食源性疾病，且耐藥性和致病性的結合可造成該類疾病更加難以預防與治療。系統(tǒng)進化群分析是利用PCR技術對大腸桿菌分離菌株進行分群檢測，主要依靠出現(xiàn)chuA、yjaA基因和TspE4.C2非編碼區(qū)區(qū)分，可快速獲得具有不同致病能力的菌株群，對研究其生態(tài)分布和遺傳進化具有重要參考價值［1］。本研究采用PCR法對雞源大腸桿菌進行系統(tǒng)進化群分析，了解不同系統(tǒng)進化群雞源大腸桿菌致病菌株的分布情況，結合耐藥性檢測結果，分析致病菌群與低/非致病菌群之間的耐藥差異，對臨床合理用藥和細菌性疾病的防治具有重要的實際意義。

1 材料

1.1實驗菌株

438株雞源大腸桿菌（從表觀健康雞泄殖腔拭子分離獲得）以及O2標準菌株，均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心動物產(chǎn)品安全監(jiān)測室提供。大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2主要試劑和儀器

胰蛋白胨大豆肉湯、LB肉湯、Mueller-Hinton肉湯、瓊脂粉，購自北京陸橋生物技術有限公司；GoTaqGreen Master Mix、DNA Marker DL2000和瓊脂糖，購自TaKaRa公司；96孔藥敏板、含氨芐西林/AM、奧格門丁/AC、頭孢噻呋/CEF、慶大霉素/GM、大觀霉素/SPT、四環(huán)素/TE、多西環(huán)素/DOX、氟苯尼考/FFC、磺胺異噁唑/SF、復方新諾明/SXT、氧氟沙星/OFL、恩諾沙星/ENR、多粘菌素E/CLE等13種藥物，購自天津市金章科技發(fā)展有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海愛朗SL?-700型）、快速渦勻器（深圳天南海北SK-1）、PCR儀（B?ORAD）、電泳儀（北京六一儀器廠）和Gel Doc XR凝膠成像分系統(tǒng)（B?O-RAD）。

2 方法

2.1系統(tǒng)進化群分群試驗

chuA和yjaA基因以及DNA片段TspE4.C2等3對引物序列由上海生物工程有限公司合成，具體見表1。根據(jù)分群標準進行系統(tǒng)進化群分群［2］。

表1　chuA基因、yjaA基因和DNA片段 TspE4.C2的引物序列

PCR擴增體系25 μL，包括上下游引物各0.5 μL、模板2 μL。

PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃45 s，72℃ 50 s，共35個循環(huán)，72℃ 5 min。

2.2耐藥表型檢測

按CLS?推薦的微量肉湯稀釋法進行測定和判讀，具體實驗步驟根據(jù)藥敏板說明書進行。

2.3耐藥基因型檢測

根據(jù)相關文獻及GenBank中發(fā)表的基因序列，使用Primer5.0軟件分別設計出磺胺和四環(huán)素類抗藥基因共11對特異性引物，引物序列（表2）由上海生物工程有限公司合成。

表2　磺胺和四環(huán)素類藥物耐藥基因引物序列

PCR擴增體系25μL，包括上下游引物各0.5μL、模板2μL。

PCR反應條件：sull、sul2、sul3，94℃5min，94℃45s，60℃45s，72℃50s，35個循環(huán)，72℃5min。tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetL、tetK、tetW，94℃5min，94℃45s，60℃45s，72℃45s，30個循環(huán)，72℃5min。

2.4統(tǒng)計學分析

用SPSS17.0軟件對兩組樣本率X2檢驗或兩尾Fisher精確檢驗進行數(shù)據(jù)分析。當P＜0.05時差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1系統(tǒng)進化群分群結果

438株雞源大腸桿菌中，B1群和A群菌相對較多，分別占38.1%（167/438）和34.0%（149/438），D群占21.2%（93/438），而B2群菌株最少為6.2%（27/438）。不同基因片段PCR產(chǎn)物的電泳結果見圖1。

3.2耐藥表型檢測結果

438株雞源大腸桿菌對13種藥物的藥敏試驗結果見表3。耐藥嚴重的是氨芐西林、四環(huán)素和磺胺類（耐藥率≥80%），多粘菌素E最為敏感；多重耐藥問題突出，433株為多重耐藥菌株，多重耐藥率高達98.9%，耐7種藥以上的菌株占77.2%。結果見表3。

3.3耐藥基因檢測結果

菌株PCR產(chǎn)物電泳結果顯示sul2基因檢出率最高，檢出率為71.0%，其次是sull（44.8%）和sul3（18.7%）。同時攜帶3種磺胺類耐藥基因的檢出率為9.1%（40株）；tetA檢出率為42.2%，tetB為15.8%，tetM為7.3%，其中有1株菌同時攜帶3種tet基因，tetC、tetO、tetL、tetK、tetW未檢出。耐藥基因檢出情況見表4；PCR產(chǎn)物電泳結果分別見圖2和圖3。

圖1　不同基因片段PCR產(chǎn)物電泳圖

表3　438株雞源大腸桿菌藥敏試驗結果

表4 雞E.coli耐藥基因檢測情況

藥物種類　　引物　　引物序列（5 ' -3 '）　　產(chǎn)物大?。╞ p）四環(huán)素類t e t K　F：T A T T T T G G C T T T G T A T T C T T T C A T　1 1 5 9 R：G C T A T A C C T G T T C C C T C T G A T A A t e t L　F：A T A A A T T G T T T C G G G T C G G T A A T　1 0 7 7 R：A A C C A G C C A A C T A A T G A C A A T G A T t e t W　F：G A G A G C C T G C T A T A T G C C A G C　1 6 8 R：G G G C G T A T C C A C A A T G T T A A C

3.4耐藥表型與耐藥基因型相關性分析

差異比較分析顯示，表型耐藥菌株攜帶耐藥基因的能力顯著高于非耐藥菌株（p＜0.05），說明耐藥性與耐藥基因攜帶有關，即耐藥表型與基因型呈一定相關性。但耐藥基因檢出率低于其相應抗菌藥耐藥率，可能是含有其它耐藥基因或耐藥機制，見表5。

圖2　sull，sul2 和sul3 PCR電泳產(chǎn)物結果

圖3　tetA，tetB 和tetM PCR電泳產(chǎn)物結果

表5　耐藥表型與耐藥基因型相關性分析

表6　不同系統(tǒng)進化群大腸桿菌菌株耐藥情況比較

3.5 不同系統(tǒng)進化群大腸桿菌菌株耐藥結果比較

高致病群B2和D群菌株的耐藥程度相對嚴重，其中OFL、GM、SPT、EFT、SF、SXT、A/C等7種藥物差異顯著（P＜0.05）；多重耐藥問題相對突出，高耐菌株比例高于B1和A群菌株，79.2%的菌株耐8～12種藥物，具體見表6。

3.6不同系統(tǒng)進化群大腸桿菌菌株耐藥基因比較

通過系統(tǒng)進化群與耐藥基因型差異顯著性分析，可見sull、sul2、tetA、tetB、tetM基因多見于高致病群B2和D群（P＜0.05），但sul3在不同系統(tǒng)進化群中的分布無明顯差（P=0.486）。說明部分耐藥基因與大腸桿菌致病性存在一定相關性，見表7。

表7　耐藥基因型與系統(tǒng)進化群相關性

4 討論

大腸桿菌系統(tǒng)進化群可以分為4個群：A、B1、B2和D，依靠chuA、yjaA基因和TspE4.C2非編碼區(qū)區(qū)分。A和B1群常存在于共生株，而B2和D群屬于攜帶毒力相關基因的條件腸外病原體［1］。系統(tǒng)進化群的分布不僅是由動物種類，而且是由其健康狀態(tài)和地理位置決定的。Pilar Corte’s等［3］研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)進化群在豬和雞分布顯著不同，豬中A群菌株更加流行，而D群和禽源分離株相關。Tetsuo Asai等［4］研究發(fā)現(xiàn)不同病死動物大腸桿菌系統(tǒng)進化群分布不同，A（49.4%）和D（44.9%）主要分布于雞源大腸桿菌，且B2群僅分離自患病雞。Obeng AS等［5］研究了南澳大利亞251株禽大腸桿菌，結果發(fā)現(xiàn)32.3%～39.4%的分離株屬于共生群（A和B1），11.2%～17.1%屬于毒力群（B2和D），17株多重耐藥菌株屬于B2和D群。巴西和日本的研究也顯示，B2群很少出現(xiàn)在健康牛、雞和豬大腸桿菌中［6］。Rodriguez等［7］研究美國患病家禽大腸桿菌發(fā)現(xiàn)，A群（38%）和D群（28%）分布較多，B2群檢出率為19%。本實驗顯示，共生群A和B1檢出率與其他國家相似，但高致病群存在差異，D群菌株檢出率比多數(shù)國家高出10%，并從健康雞中分離到B2群菌株，其它國家未見報道。說明我國雞大腸桿菌毒力較強，在適宜條件下更易導致家禽發(fā)病。

近年來禽源大腸桿菌的耐藥譜不斷擴大，耐藥程度日趨嚴重，多重耐藥問題突出。只帥等［8］對陜西省304份雞大腸桿菌進行了耐藥性分析，結果發(fā)現(xiàn)多數(shù)抗菌藥的耐藥率超過了50%。李昆明等［9］檢測了河南17株禽大腸桿菌對24種抗菌藥的耐藥情況，對21種藥物耐藥率大于70%，其中10種藥物的耐藥率高達90%～100%。楊澤曉等［10］對四川87株大腸桿菌進行26種抗菌藥的耐藥性檢測，受試菌株均有不同程度多重耐藥，對青霄素G（100%）、強力霉素（89.66%）、復方阿莫西林（85.20%）、四環(huán)素（82.76%）、頭孢氨芐（63.22%）、頭孢噻吩（52.87%）和復方新諾明（51.72%）的耐藥性較強。本實驗顯示，438株雞源大腸桿菌耐藥情況與以往報道相似，對氨芐西林（87.2%）、四環(huán)素（87.0%）、復方新諾明（87.0%）和磺胺異噁唑（80.0%）耐藥嚴重，且耐藥譜較廣，77.2%菌株對7種以上藥物耐藥。

耐藥表型與攜帶的耐藥基因呈一定相關性，但不同的國家和地區(qū)sul和tetA優(yōu)勢基因并不一樣，很多研究報道發(fā)現(xiàn)sul1是磺胺類藥物分布最廣的基因［11-12］，而腸道桿菌所攜帶的四環(huán)素類抗藥基因主要是tetA、tetB和tetC［13-14］。本實驗也顯示，分離菌株對磺胺類和四環(huán)素類藥物耐藥與其攜帶的sul1（71.00%）、sul2（44.75%）、sul3（18.72%）以及tetA（42.2%）、tetB（15.8%）、tetM（7.3%）有關。

已有報道系統(tǒng)進化群可能與耐藥性的散播有關聯(lián)［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)，除了四環(huán)素外，B2和D群菌株對其余12種抗菌藥的耐藥率均高于B1和A群菌株，其中OFL、GM、SPT、EFT、SF、SXT、A/C等 7種藥物差異顯著（P＜0.05）；79.17%的B2和D群菌株耐8～12種藥物，而B1和A群耐8～12種藥物的菌株則有56.92%。說明高致病群B2和D群菌株的耐藥程度相對嚴重，但與Johnson J.R.和Picard B等［9-10］報道臨床B2大腸桿菌分離株的抗菌藥耐藥性低于非B2分離株的結果不一致。

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（責任編輯：朱迪國）

Antibiotical Resistance Investigation and Analysis of Chicken Originated E.coli Strains of Different Phylogenetic Groups

Liu Huanqi1，Huang Haihan2，Xiao jiyou3，Hu Xueyuan1，Wang Longguang1
（1. Department of Animal Science，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109；2. Qingdao No.2 Middle School of Shandong Province，Qingdao，Shandong 266061；3. Zifu District Animal Health Supervision ?nstitute，Yantai，Shandong264000）

［Objective］The aim of the study is to know the distribution and drug-resistance of pathogenic poultry-originated E.coli strains through phylogenetic group and drug resistance analysis，and provide

for prevention and control of chicken colibacillosis.［Method］The antimicrobial susceptibility （M?C） was detected by mini broth dilution susceptibility test，the resistance gene and phylogenetic groups were detected by PCR and the significance of difference was analyzed by SPSS17.0 software. ［Result］The low pathogenic group B1（38.13%） and the nonpathogenic group A（34.02%）were more distributed than the highly pathogenic group D （21.23%） and B2（6.16%）. The resistance of 438 E.coli isolates to ampicillin （87.2%），tetracycline （87.0%），sulfamethoxazole/trimethoprim （87.0%） and sulfisoxazole（80.0%） was serious，multiple resistance rate was up to 98.86%，but the isolates were sensitive to colistin E. The resistance gene sull （71.0%），sul2 （44.8%），sul3 （18.7%），tetA （42.2%），tetB （15.8%） and tetM （7.3%） existed in E.coli isolates，but tetC，tetO，tetK，tetL and tetW were not found.9.13% isolates carried 3 sul genes，and only 1 isolate carried 3 tet genes. The ability of resistant isolates to carry resistance genes was significantly higher than the non-resistant ones（P＜0.05）. The resistance of the strains from highly pathogenic group B2and D was higher than the strains from group B1and A，and there was significant difference to the seven drugs such as ofloxacin，gentamicin，spectinomycin，ceftiofur，sulfisoxazole，sulfamethoxazole/trimethoprim，amoxicillin/clavulanic acid （P＜0.05）.［Conclusion］The ratio of highly pathogenic strains of chicken-originated E.coli in China was high，and the drug-resistance was relatively serious，likely result in poultry diseases under the suitable conditions and difficulty to control .

chicken originated E.coli；phylogenetic groups；pathogenicity；drug-resistance.

S852.61

B

1005-944X（2015）11-0016-06

“十二五”科技基礎性工作專項（項目編號：2012FY111000）