尤玲玲，劉金福，王媛，王娜，張平平，葛懷娜

（1.天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

苦瓜皂苷的純化及降血糖活性的研究

尤玲玲1，2，劉金福1，2，王媛1，王娜1，2，張平平1，2，葛懷娜1

（1.天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

主要研究純化后苦瓜皂苷的成分組成及對HepG2胰島素抵抗的緩解效果，為苦瓜皂苷降血糖活性的深入研究提供參考。本試驗利用AB-8大孔吸附樹脂純化苦瓜皂苷粗提物，以人參皂苷Rg1和Rb1為參照物，通過薄層層析（TLC）技術(shù)初步分析純化后樣品的組成，然后利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）驗證分析的結(jié)果，最后采用高濃度胰島素誘導HepG2細胞建立胰島素抵抗模型，考察不同劑量的苦瓜皂苷對葡萄糖消耗量的影響。結(jié)果表明，經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后苦瓜皂苷含量由35.8%提高到了69.1%，薄層層析顯色分析提取物中至少含有5種皂苷類物質(zhì)，HPLC-ELSD得出純化后苦瓜皂苷樣品中除含有人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1外，還有含有其他6種組分。與模型組細胞相比，純化后的苦瓜皂苷在一定程度上可以改善產(chǎn)生HepG2/IR細胞的葡萄糖消耗量，其中300 μg/mL的苦瓜皂苷效果最好。

苦瓜皂苷；純化；薄層層析；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器；胰島素抵抗

苦瓜（Momordica charantia L.）又名涼瓜，為葫蘆科苦瓜屬植物，果實藥食兼用，具有悠久和廣泛的藥用歷史和記載。中醫(yī)認為它性味苦寒，具有清涼解熱的作用。隨著人們對苦瓜皂苷的進一步研究，苦瓜皂苷藥理活性越來越受到人們的關注，文獻報道苦瓜皂苷具有降血糖［1-2］、抗氧化［3］、提高免疫功能［4］、抗腫瘤［5］等活性。近年來，國內(nèi)外學者采用不同方法對苦瓜食用部分進行了分離提取及鑒定，從苦瓜中分離出苷類、蛋白質(zhì)、多糖、生物堿、有機酸等多種化學成分，其中苦瓜皂苷是其活性物質(zhì)中的有效成分之一。

目前皂苷類物質(zhì)純化的方法較多，有泡沫分離法［6］、有機溶劑沉淀法［7］、膜分離法［8］等，但由于皂苷親水性大，與雜質(zhì)分離較困難，加之有些皂苷結(jié)構(gòu)差別不大，因此，要想獲得純度較高的皂苷就需要借助大孔吸附樹脂，其具有吸附容量大、再生簡單、效果可靠等特點，此外對除去水溶性多糖、色素等雜質(zhì)顯出了獨特的效果。

而對于苦瓜皂苷類物質(zhì)的檢測，都是基于HPLC在200 nm～210 nm波長下檢測，但在這些波長下，皂苷以外的成分可能會與皂苷重疊造成檢測結(jié)果的不同。2，3-二氫-2，5二羥基-6-甲基-4吡喃酮共軛的大豆皂苷在295 nm有最大吸收波長，甘草酸苷類和葫蘆素能在紫外識別檢測器中被成功檢測，其他缺少發(fā)色團的皂苷會影響其在紫外光下的檢測。為了克服這個問題本實驗采用靈敏度更高的蒸發(fā)光散射檢測器來嘗試分析純化后的苦瓜皂苷［9］。探討其對HepG2肝癌細胞產(chǎn)生的胰島素抵抗的影響，為苦瓜皂苷的深入開發(fā)和綜合利用提供參考。

1材料與方法

1.1原料

新鮮苦瓜：天津市王頂?shù)剔r(nóng)貿(mào)市場；AB-8大孔樹脂：購于滄州寶恩吸附材料有限公司；硅膠板GF254：購于青島鼎康硅膠有限公司。

1.2儀器與試劑

RE-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海振捷實驗儀器設備有限公司；TD5A-WS型臺式低速離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；UNIC7200紫外-可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；LGJ-18s冷凍干燥機：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Aglient-1200高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；Alltech-2000ES蒸發(fā)光散射檢測器：奧泰公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國伯樂公司；IX51倒置相差熒光顯微鏡：日本Olympus公司；超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；3111型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo Forma公司；Bio-Tek ELX800型全自動酶標儀：美國寶特公司。

1.3方法

1.3.1苦瓜皂苷的純化及含量測定

以鮮苦瓜陰干成苦瓜干，按照前期實驗總結(jié)的方法［10］制備苦瓜皂苷粗提液。將5 mg/mL粗提液上預先處理好的AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附4 h，用蒸餾水洗脫除糖，洗脫過程中隨時取洗脫液，分別加入molish試劑和濃硫酸，待界面無紫環(huán)出現(xiàn)說明樣液中多糖已去除干凈。接著用3.5 BV 80%的乙醇以2 BV/h流速洗脫柱子，收集洗脫液后，蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得苦瓜皂苷純品。

采用香草醛-高氯酸顯色法，以人參皂苷Rg1為對照品繪制標準曲線，測定純化前后苦瓜總皂苷的含量［11］。

1.3.2薄層層析法分析皂苷組成

用毛細管取甲醇溶解的苦瓜皂苷樣品液、人參皂苷Rg1和Rb1標準品，在距薄層板底邊約1.5 cm處，點樣于活化好的硅膠板上，將薄層板置于裝有氯仿-甲醇-水-冰乙酸［12］展開劑（65∶35∶10∶2）的層析缸中，上行法進行展開，當展層劑前沿距薄層上方1 cm處，取出玻璃板，60℃烘箱中烘干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，在60℃烘至斑點清晰，置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.3.3高效液相色譜法驗證苦瓜皂苷組分

參考有關文獻資料［13］并對方法進行改進，對純化后苦瓜皂苷樣品的含量測定進行試驗研究，確定色譜條件如下：

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：35℃；皂苷樣品濃度：1mg/mL；標準品濃度：人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1均配制成0.1 mg/mL；進樣體積：5 μL；ELSD檢測器漂移管溫度：110℃；噴霧氣體流速：3.0 L/min。以流動相A（水）、流動相B（乙腈）進行梯度洗脫。HPLC梯度洗脫程序見表1。

表1　線性梯度洗脫表Table 1The linear elution process

1.3.4苦瓜皂苷對HepG2/IR葡萄糖消耗量的影響

肝癌細胞HepG2培養(yǎng)細胞于37℃，5%CO2飽和濕度環(huán)境下的二氧化碳培養(yǎng)箱中（15%胎牛血清，1‰青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液），胰酶消化后將細胞制成105個/mL單細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，準備進行試驗。

分別設立HepG2細胞陰性對照組，HepG2/IR模型組、陽性對照組、苦瓜皂苷干預組，每組6個復孔。在陰性對照組中只加入50 μL DMEM培養(yǎng)液，HepG2/IR模型組、陽性對照組以及苦瓜皂苷干預組每孔加入50 μL 30 μg/mL胰島素溶液，孵育36 h后，即建立HepG2/IR模型［14］。然后，陰性對照組和HepG2/IR模型組中加入50 μL DMEM培養(yǎng)液，陽性對照組中加入50 μL鹽酸吡格列酮溶液（終濃度為4 μg/mL），苦瓜皂苷干預組分別加入50 μL終濃度為100、300、500、700 μg/mL的苦瓜皂苷樣液，孵育12 h后3 600 r/min離心10 min，吸取出每孔的培養(yǎng)液，按葡萄糖試劑盒測定方法測定培養(yǎng)液中葡萄糖的含量。

1.3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖形分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素差異性分析以及多重比較組間差異。

2結(jié)果與討論

2.1苦瓜皂苷的純化

根據(jù)人參皂苷標準曲線y=0.002 6x-0.005 0（R2= 0.992 5），計算出苦瓜皂苷粗提物中皂苷含量為35.8%，經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化后皂苷含量可提高到69.1%。

2.2薄層色譜法鑒別純化后苦瓜皂苷組分

為進一步確定純化后苦瓜皂苷樣品中的組分數(shù)量及種類，用甲醇將純化后的苦瓜皂苷樣品、人參皂苷Rg1標準品和人參皂苷Rb1標準品配分別平行兩次點樣，進行TLC檢測，并在日光及365 nm紫外燈下進行檢視，結(jié)果見圖1。

圖1　純化后苦瓜皂苷樣品的TLC圖Fig.1TLC of purified saponin

經(jīng)測量計算，人參皂苷Rg1的Rf值為0.86，人參皂苷Rb1的Rf值為0.60，純化后的苦瓜皂苷樣品（見圖1，第5道和第6道）從上到下的Rf值依次為0.86，0.80，0.74，0.67，0.58。與標準品比較，初步推斷純化后的苦瓜皂苷樣品中含有人參皂苷Rg1及與人參皂苷Rb1極性非常相近的一種組分，除此之外還有可能存在其它3種皂苷類物質(zhì)。

2.3HPLC-ELSD法分析純化后苦瓜皂苷樣品

由于HPLC-ELSD法的色譜條件中的流動相為水和乙腈，而配制苦瓜樣品和標準品的溶劑為甲醇，因此檢測供試苦瓜皂苷樣品時選用甲醇作為陰性對照液，以便后期將溶劑峰排除。

精密吸取人參皂苷標準品溶液、苦瓜皂苷樣品溶液、甲醇溶液，按1.2.3中的色譜條件進樣?？喙显碥丈V圖見圖2。

圖2　高效液相色譜圖Fig.2HPLC-ELSD chromatograms of different sample

由圖2（B和C）可以看出人參皂苷Rg1在11.846 min有非溶劑峰的強峰出現(xiàn)，人參皂苷Rb1在16.362 min有非溶劑峰的強峰出現(xiàn)，從苦瓜皂苷樣品的色譜圖中可以看出在11.754、15.689、16.232、16.392、16.827、17.469、17.609、20.062 min有顯著峰，與人參皂苷標準品的色譜圖進行比較后得出，純化后的苦瓜皂苷樣品在人參皂苷標準品的保留時間11.846和16.362 min處均有對應峰出現(xiàn)，可以得出純化后苦瓜皂苷樣品中含有人參皂苷Rg1和Rb1，除此之外，還有至少6種組分。

2.4不同濃度苦瓜皂苷對HepG2/IR細胞葡萄糖消耗量的影響

成功建立HepG2/IR細胞模型后，設立不同濃度的苦瓜皂苷作用HepG2/IR細胞，測定葡萄糖消耗量結(jié)果見圖3。

圖3　不同濃度的苦瓜皂苷對HepG2/IR細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.3Effect of different concentration Momordica charantia saponin to the glucose consumption of HepG2/IR

當苦瓜皂苷濃度低于300 μg/mL時，隨著皂苷濃度的增大，細胞葡萄糖消耗量也從5.061 mmol/L（P＜0.01）極顯著增加至5.475 mmol/L（P＜0.05）?？喙显碥崭鲃┝拷M中，300 μg/mL的苦瓜皂苷劑量組葡萄糖消耗量最大，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），此劑量與鹽酸吡格列酮陽性對照組相比較，差異最?。≒＜0.05）。

但當苦瓜皂苷濃度高于300 μg/mL時，葡萄糖消耗量整體呈現(xiàn)下降趨勢，盡管葡萄糖消耗量隨著濃度的增加有所減少，但葡萄糖消耗量與HepG2/IR模型組相比較仍有一定程度提高，說明苦瓜皂苷還是在不同程度上促進了HepG2/IR細胞消耗葡萄糖，緩解了胰島素抵抗現(xiàn)象。

3結(jié)論

經(jīng)過AB-8大孔樹脂，上樣濃度為5 mg/mL，上樣流速為2 BV/h，洗脫液為80%乙醇，洗脫柱體積為3.5 BV的上樣條件進行純化后，苦瓜皂苷含量由35.8%提高到69.1%。

經(jīng)過TLC和HPLC-ELSD法對純化后的苦瓜皂苷樣品組分進行檢測，從色譜圖中可以看出純化后的樣品含有人參皂苷Rg1和Rb1，除此之外還有至少6種組分。

采用高濃度的胰島素誘導HepG2細胞出現(xiàn)葡萄糖代謝異常后，以不同濃度純化后的苦瓜皂苷作用于HepG2/IR細胞，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)苦瓜皂苷可以緩解胰島素抵抗，其中300 μg/mL的苦瓜皂苷作用極顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

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Purification and Hypoglycemic Activity of Saponins Extracted from Momordica Charantia in Vitro

YOU Ling-ling1，2，LIU Jin-fu1，2，WANG Yuan1，WANG Na1，2，ZHANG Ping-ping1，2，GE Huai-na1
（1.Tianjin Agricultural University College of food science and biotechnology，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

The components and insulin resistance ability of purified Momordica charantia saponins were investigated to further study the hyperglycemic effect of it.AB-8 macroporous adsorption resin was used to purify crude saponins.The components of purified saponins were analyzed by thinlayer chromatography（TLC）and high performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector（HPLC-ELSD）.The insulin resistant HepG2 cell model was established by high concentration insulin.Different concentration Momordica charantia saponins were added to measure glucose consumption by glucose oxidase method（GOD）.These results showed that the content of saponins increased from 35.8%to 69.1%.There were less than 5 kinds of saponins based on TLC technique.By HPLC-ELSD，there were other 6 kinds of saponins，besides Ginsenoside Rg1 and Rb1.Compared with HepG2/IR group，treatment with 300 μg/mL Momordica charantia saponins could enhance glucose consumption of HepG2 cells/IR.

Momordica charantia saponins；purification；thin-layer chromatography（TLC）；high performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector（HPLC-ELSD）；insulin resistance（IR）

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.008

2015-07-03

天津市科技支撐計劃項目（No.13ZCZDNC01800）

尤玲玲（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：生物資源開發(fā)與功能性食品。

劉金福（1961—），男，教授，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學及生物活性。