李晶，王薇，張燕，陸旸，王碩，*

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308；2.食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗夾心ELISA方法的建立

李晶1，王薇2，張燕2，陸旸2，王碩2，*

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308；2.食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白是雞蛋中的主要過敏原，針對雞蛋中主要過敏原卵轉(zhuǎn)鐵蛋白建立了雙抗夾心ELISA方法，該方法檢出限為（15.37±1.20）ng/mL。除白蛋白外，該方法對粘蛋白、溶菌酶、α-乳白蛋白、牛奶總蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、花生總蛋白、大豆、杏仁和綠豆等致敏蛋白幾乎沒有交叉反應(yīng)。板內(nèi)重復(fù)性和板間重復(fù)性較好，因此所建立的方法可用于對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的檢測。

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白；雙抗夾心ELISA方法；過敏原

雞蛋是人們?nèi)粘Ｉ钪凶盍畠r(jià)的蛋白質(zhì)來源。由于含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其被廣泛用于包括米粉等在內(nèi)的嬰幼兒輔食中［1-2］。然而近年來，對其過敏的人數(shù)卻呈逐年上升趨勢。雞蛋的過敏原主要存在蛋清中分別是卵類粘蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶［3-6］。其中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白來源于雞血清中，占蛋清中蛋白總量的12%［7］。

目前對致敏蛋白的檢測方法主要包括PCR法和免疫分析方法［8-12］。然而，普通PCR方法只用于定性或是半定量分析。相比之下，基于免疫學(xué)方法的酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)定量檢測，且具有高效、靈敏和低成本等優(yōu)點(diǎn)。因此，本文利用此項(xiàng)技術(shù)建立并優(yōu)化了用于食品中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白含量對的雙抗夾心ELISA檢測方法。

1材料與方法

1.1材料

卵類黏蛋白、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白（BSA）、羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標(biāo)物、羊抗鼠IgG辣根過氧化物酶標(biāo)物、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（含量≥99.9%）、甘氨酸，BCA蛋白定量試劑盒、十二烷基磺酸鈉（SDS）、過氧化氫脲（CH6N2O3）、3，3'，5，5'－四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、脫脂乳粉、魚皮膠：購自Sigma公司；Tween 20：購自上海浦東化工試劑廠。丙三醇：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；變色硅膠：天津市化學(xué)試劑一廠；β-環(huán)糊精和二甲基亞砜（DMSO）：德國Merck公司；Protein A-Sepharose 4B和Protein G-Sepharose：美國Amersham公司；96孔酶標(biāo)板：美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1卵類黏蛋白兔多克隆抗體的制備

以卵類黏蛋白過敏原蛋白為免疫原對新西蘭大耳白兔進(jìn)行免疫，并制備卵類黏蛋白特異性抗體。兩周免疫1次，共免疫5次。從第3次開始耳緣靜脈采血，最后1次采用股動脈采全血。并用間接ELISA法測定血清的效價(jià)。利用Protein A-Sepharose 4B免疫親和層析柱對抗體進(jìn)行純化。

1.2.2卵類黏蛋白鼠多克隆抗體的制備

試驗(yàn)用BALB/c小鼠約為6周～7周大，雌性。免疫原與弗氏完全佐劑或者弗氏不完全佐劑以1∶1的體積混合，免疫劑量為100 μg/只，第4次免疫后取血并純化后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗夾心ELISA方法的建立

將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白兔多抗包被于96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板中（100 μL/孔），然后4℃下孵育12 h～16 h。PBST洗液洗板3次后，在酶標(biāo)板中加入封閉液（200 μL/孔），于37℃烘箱中封閉1 h。之后用PBST洗液洗板3次，每孔加入卵轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，于37℃烘箱中反應(yīng)1 h，取出后用PBST洗液洗板3次。隨后，將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白鼠多抗加入到酶標(biāo)板中（100 μL/孔），于37℃烘箱中反應(yīng)1 h，取出后用PBST洗液洗板4次，然后將HRP標(biāo)記的鼠二抗加入酶標(biāo)板中（100 μL/孔），37℃下反應(yīng)30 min。PBST洗液洗板5次后，向每孔中加入底物A和B的混合液（100 μL/孔），至于37℃烘箱中顯色約15 min～20 min。然后加入終止液（50 μL/孔）并利用酶標(biāo)儀采用雙波長方式（450 nm～650 nm）讀取吸光度值（OD值）。

1.2.4雙抗夾心檢測方法特異性的測定

抗體的特異性通過交叉反應(yīng)測定。以PBS作為陰性對照，如果交叉反應(yīng)物孔的吸光度值P，是陰性孔吸光度值N的2倍以上，即P/N＞2時(shí)，則說明抗體對此蛋白有交叉。

2結(jié)果與討論

2.1卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗夾心ELISA方法的建立

2.1.1封閉液的優(yōu)化

由于夾心ELISA方法檢測限與空白值的大小緊密相關(guān)，因此首先通過封閉液的優(yōu)化來降低空白值。試驗(yàn)選擇了0.5%的脫脂乳粉、1%的脫脂乳粉、5%的脫脂乳粉、1%BSA溶液、0.5%魚皮膠、1%明膠、0.5%酪蛋白作為封閉液，分別得到空白值，如表1所示。本試驗(yàn)選擇了封閉效果較好，及空白值最小的0.5%乳粉作為封閉液。

表1　不同封閉液下空白的平均吸光度值Table 1Absorption values at the different blocking buffer

2.1.2捕獲抗體包被量的優(yōu)化

試驗(yàn)選擇0.05、0.075、0.1、0.3 μg/孔作為抗體包被量，繪制檢測曲線見圖1。

圖1　不同捕獲抗體包被量對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測的影響Fig.1Effect of different capture antibody coating quantity on OVT sandwich ELISA

如圖1所示，包被量為0.075 μg/孔時(shí)空白值最低，且最大吸光度值接近1.0。因此選擇兔抗卵轉(zhuǎn)鐵蛋白0.075 μg/孔作為捕獲抗體的最終包被量。

2.1.3檢測抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

將對應(yīng)的鼠多抗檢測抗體分別稀釋1.7×105倍、2×105倍和2.4×105倍，固定其它的試驗(yàn)條件，繪制檢測曲線圖，結(jié)果通過線性相關(guān)系數(shù)以及空白值選擇合適的檢測抗體稀釋倍數(shù)，結(jié)果見圖2。

如圖2所示。由于2×105倍時(shí)的線性相關(guān)系數(shù)較好且空白值較低，因此選擇卵轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測抗體的稀釋倍數(shù)為2×105倍。

2.1.4不同pH的優(yōu)化

適宜的離子強(qiáng)度和pH能提高檢測的靈敏度。不同pH對雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測的影響就見表2。

圖2　不同檢測抗體稀釋倍數(shù)對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測的影響Fig.2Effect of different detect antibody dilution factor on OVT sandwich ELISA

表2　不同pH對雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測的影響Table 2Effect of pH of PBS on sandwich ELISA

如表2所示，當(dāng)pH=7.4時(shí)，空白值最低同時(shí)線性也最好，最終選擇pH 7.4的緩沖液作為樣品的稀釋液。可見過酸或者過堿都會對待測蛋白的活性產(chǎn)生影響。這一結(jié)果與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有一定關(guān)系［13-14］。

2.1.5卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗夾心ELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

綜合上述優(yōu)化的結(jié)果，繪制吸光度值與蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為雙抗體夾心ELISA檢測卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3　卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=8）Fig.3Standard curve of OVT allergens on sandwich ELISA（n=8）

如圖3所示，得到卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的最低檢出限（LOD）值為（15.37±1.20）ng/mL（n=8）。

2.1.6卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗夾心ELISA方法的特異性

試驗(yàn)選擇了11種常見致敏源（黏蛋白、白蛋白、溶菌酶、α-乳白蛋白、牛奶總蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、花生總蛋白、大豆、杏仁和綠豆），將11種交叉反應(yīng)物蛋白稀釋至10、1、0.1μg/mL 3個(gè)濃度，計(jì)算得到P/N值，結(jié)果見表3。

表3　雙抗體夾心ELISA檢測方法的特異性Table 3Cross-reactivity of selected common foods in the sandwich ELISA

由表3可知所建立的檢測方法與白蛋白有交叉反應(yīng)，與其他10種食物沒有交叉反應(yīng)。

2.2卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗夾心ELISA方法的精密度

本試驗(yàn)選擇7個(gè)不同濃度（0、7.812 5、15.625、31.25、62.5、125、250、500 ng/mL）的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液進(jìn)行分析，分別考查板內(nèi)變異和板間變異，對建立的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法進(jìn)行精密度測試。

2.2.1卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗夾心板內(nèi)變異

選擇7個(gè)不同濃度的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液進(jìn)行分析，根據(jù)每一個(gè)濃度對應(yīng)得到的吸光度值計(jì)算平均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到變異系數(shù)，結(jié)果如表4所示。

表4　卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測法板內(nèi)變異（n=5）Table 4Variance in-plate of sandwich ELISA for OVT allergen protein（n=5）

由表4可以看出其中A450-650值變異系數(shù)為大部分在2.37%～10.75%，均具有良好的板內(nèi)重復(fù)性，具有較高的精密度。

2.2.2卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗夾心板間變異

在相同條件下，取空白和7個(gè)不同濃度的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液，進(jìn)行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法分析，如表5所示。

表5　卵轉(zhuǎn)鐵蛋白雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測法板間變異（n=5）Table 5Variance between-plate of sandwich ELISA for OVT allergen protein（n=5）

由表5可以看出其中A450-650值變異系數(shù)為2.21%～14.84%，具有良好的板間重復(fù)性，表明方法精密度高。

3結(jié)論

本試驗(yàn)通過對封閉液濃度，捕獲抗體的包被濃度，檢測抗體的稀釋倍數(shù)以及pH的優(yōu)化，建立了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的雙抗夾心ELISA方法。優(yōu)化的方法選用0.5%乳粉作為封閉液，包被濃度為0.075 μg/孔，檢測抗體的稀釋倍數(shù)為2×105倍，檢測pH為7.4。該方法的最低檢出限達(dá)到（15.37±1.20）ng/mL，且對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白具有良好的特異性和板間板內(nèi)重現(xiàn)性，可用于對卵類黏蛋白的定量檢測。

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The Development of Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay（ELISA）for Detecting Ovotransferrin

LI Jing1，WANG Wei2，ZHANG Yan2，LU Yang2，WANG Shuo2，*
（1.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of Industrial Product Safety Technical Center，Tianjin 300308，China；2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety Ministry of Education of China，The School of Food Engineering and Biotechnology of Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Ovotransferrin was one of the main allergen in egg.A sandwich ELISA was developed for detecting ovotransferrin.The limit of detection was（15.37±1.20）ng/mL.Except albumin，the assay had no cross-reaction with mucin，lysozyme，alpha-lactalbumin，milk protein casein，beta-lacto globulin，total protein，soy，peanuts，almonds and green beans.The assay showed good repeatability and reproducibility，which could be used for detecting ovotransferrin.

ovotransferrin；sandwich ELISA；allergen

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.004

2015-05-08

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310067）

李晶（1976—），女（滿），研究員，博士，生物技術(shù)與食品工程專業(yè)。