朱鵬武　吳春松　鄭海紅

大腸癌組織中Six1和CyclinD1的表達(dá)及其臨床意義

朱鵬武吳春松鄭海紅

目的 探討胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)因子（Six1）和細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在大腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，分析Six1和CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性。方法 采用免疫組化En Vision法檢測(cè)65例大腸癌組織和20例癌旁正常組織中Six1和CyclinD1的表達(dá)。結(jié)果 大腸癌組織中Six1和CyclinD1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 70.77% 和60.00%，均明顯高于癌旁正常組織的15.00% 和0%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Six1和CyclinD1表達(dá)與大腸癌患者臨床分期﹑浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡﹑性別﹑腫瘤大小及分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）。大腸癌組織中Six1和CyclinD1的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 Six1和CyclinD1過(guò)表達(dá)可能與大腸癌的發(fā)生﹑發(fā)展密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)Six1和CyclinD1表達(dá)可用于評(píng)估大腸癌的浸潤(rùn)﹑轉(zhuǎn)移能力和預(yù)后。

大腸癌 Six1 CyclinD1 浸潤(rùn) 轉(zhuǎn)移

大腸癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的第2位常見(jiàn)的原因，約50%大腸癌患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的并發(fā)癥［1］。Six1蛋白參與染色質(zhì)重構(gòu)和基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的作用。Six1過(guò)表達(dá)與肝癌［2］、胃癌［3］和宮頸癌［4］等多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）是一個(gè)重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞周期G1/S關(guān)鍵點(diǎn)起著正向調(diào)控作用。研究［5］認(rèn)為，腦膠質(zhì)瘤中CyclinD1表達(dá)升高，提示CyclinD1可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本文旨在探討Six1和CyclinD1聯(lián)合表達(dá)的臨床意義。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2009年10月至2013年12月臨海市第一人民醫(yī)院和臺(tái)州醫(yī)院手術(shù)切除大腸癌標(biāo)本65例，標(biāo)本均經(jīng)病理檢查明確診斷，患者術(shù)前均未接受放療、化療、生物治療或免疫治療。其中男35例，女30例；年齡32～80歲，平均（60.35±12.87）歲。組織學(xué)分級(jí)：高中分化37例、低分化28例。參照2010年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）/國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）修訂的TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例、Ⅲ～Ⅳ期34例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：有轉(zhuǎn)移20例、無(wú)轉(zhuǎn)移45例。所有患者均有完整的臨床病理資料。選擇同期20例癌旁組織為對(duì)照組，癌旁組織距腫瘤原發(fā)灶＞5cm，病理證實(shí)為正常大腸組織。

1.2主要試劑 兔抗人Six1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗人CyclinD1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，即用型羊抗兔免疫組化En VisionTM檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)自Dako公司。

1.3檢測(cè)方法 所有組織標(biāo)本離體后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋保存。采用En Vision二步法進(jìn)行免疫組化染色，高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉30min，一抗4℃冰箱過(guò)夜，二抗孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定 Six1和CyclinD1染色陽(yáng)性信號(hào)為出現(xiàn)棕黃色顆粒，均定位于細(xì)胞核。選?。?個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)≥200個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性，＜10%為陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件。Six1和CyclinD1在大腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，兩者表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大腸癌和癌旁正常組織中Six1和CyclinD1的表達(dá) Six1和CyclinD1均以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性（見(jiàn)圖1和圖2）。大腸癌組織中Six1和CyclinD1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.77% 和60.00 %，均明顯高于癌旁正常組織的15.00 % 和0 %，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖1　Six1在大腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)（En Vision×400）

圖2　CyclinD1在大腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)（En Vision×400）

表1　Six1和CyclinD1在大腸癌和癌旁正常組織中的表達(dá)［n（%）］

2.2Six1和CyclinD1表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系 Six1和CyclinD1蛋白表達(dá)在大腸癌患者臨床分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2　Six1和CyclinD1表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

2.3大腸癌組織中Six1和CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性 65例大腸癌組織中，Six1和CyclinD1表達(dá)共陽(yáng)性36例，陰性16例，Six1和CyclinD1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3　Six1和CyclinD1在大腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性（n）

3　討論

Six1是轉(zhuǎn)錄因子Six同源結(jié)構(gòu)域家族成員之一，是一種進(jìn)化上高度保守的轉(zhuǎn)錄因子［6］。早期的研究顯示，Six1是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)與Eya家族蛋白相互作用激活基因轉(zhuǎn)錄，參與神經(jīng)、肌肉和腎的發(fā)生［7］。近來(lái)研究［8，9］認(rèn)為，Six1在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，在惡性腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和存活中起著重要作用。Li等［10］采用慢病毒載體介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA（shRNA）基因敲除的方法來(lái)抑制大腸癌細(xì)胞Six1表達(dá)。研究表明shRNA能有效地降低其表達(dá)在大腸癌細(xì)胞中Six1 mRNA和蛋白水平。體外功能實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)Six1顯著抑制細(xì)胞增殖，抑制結(jié)、直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲。此外，腫瘤異種移植模型表明，下調(diào)Six1顯著抑制體內(nèi)的大腸癌生長(zhǎng)。CyclinD1屬于Cyclins家族成員之一。CyclinD1定位于11q13，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼295個(gè)氨基酸，分子量為34KD。CyclinD1是細(xì)胞周期起始和進(jìn)展的一個(gè)重要傳感器和激活器，CyclinD1過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期引起細(xì)胞周期調(diào)控異常，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖。在一些惡性腫瘤中CyclinD1表達(dá)升高被認(rèn)為與腫瘤的進(jìn)展和系統(tǒng)治療反應(yīng)有關(guān)［11］。

本資料結(jié)果顯示，大腸癌組織中Six1和CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示Six1和CyclinD1過(guò)表達(dá)可能參與大腸黏膜上綜上所述，大腸癌組織中Six1和CyclinD1呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，其表達(dá)可能與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)Six1和CyclinD1表達(dá)情況可用于評(píng)估大腸癌的局部浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力和預(yù)后。

皮惡性轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步研究結(jié)果分析，Six1和CyclinD1蛋白表達(dá)在大腸癌患者臨床分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）。表明聯(lián)合檢測(cè)Six1和CyclinD1蛋白表達(dá)情況可用于評(píng)估大腸癌的局部浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力和預(yù)后。Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，大腸癌組織中Six1和CyclinD1表達(dá)呈正相關(guān)。提示Six1表達(dá)升高，可能通過(guò)調(diào)控CyclinD1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期異常，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常。與Li等［12］研究認(rèn)為Six1通過(guò)上調(diào)CyclinD1促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖的結(jié)果一致。

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Objiective To study the expression of Six1 and CyclinD1 in colorectal cancer and its clinical signifi cance，analyzing the relationship between expression of Six1 and CyclinD1 protein. Methods The expressions of Six1 and CyclinD1 in 65 cases of colorectal cancer and 20 cases of corresponding para-carcinoma colorectal mucosa tissues were deteted by immunohitochemical En Vision method. Results The positive rate of Six1 and CyclinD1 protein in colorectal cancer tissues was 70.77% and 60.00% respectively，compared to para-carcinoma colorectal tissues（15.00% and 0%），the difference was statistically signifi cant（P＜0.05）. The expression of Six1 and CyclinD1 protein was correlated with clinical stage，infi ltration depth and lymoh node metastasis（P＜0.05），but no correlated with age，sex，tumor size or degree of differentiation（P＞0.05）. Exressions of Six1 were negatively associated with expression of CyclinD1 in colorectal cancer（P＜0.05）. Conclusions The overexpression of Six1 and CyclinD1 is closely associated with occurrence and development of colorectal cancer The combined detection of Six1 and CyclinD1 expression may be used to assess the ability of invasion，metastasis and prognosis of colorectal cancer.

Colorectal cancer Six1 CyclinD1 Invasion Metastasis

317000浙江省臨海市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科（朱鵬武吳春松）317000 浙江省臺(tái)州醫(yī)院病理科（鄭海紅）