趙　帥　宋　蔚

CFH ELN基因多態(tài)性與PCV及隱匿性CNV的相關(guān)性

趙帥宋蔚

目的 探討補體因子H（CFH） Y402Hrs3753394基因多態(tài)性﹑彈性蛋白（ELN）rs2301995基因多態(tài)性與中國北方人群息肉狀脈絡(luò)膜血管病變 （PCV）及隱匿性脈絡(luò)膜新生血管膜（CNV）疾病的關(guān)系。方法 選取PCV患者25例 （PCV組）和隱匿性CNV患者22例（CNV組）及健康體檢者23例 （對照組）。采集所有受試者的外周血，提取DNA，通過聚合酶聯(lián)（PCR）技術(shù)擴增后測序，檢測CFH 與ELN單核苷酸多態(tài)性，分析基因變異結(jié)果與PCV及隱匿性CNV疾病的相關(guān)性。結(jié)果 PCV組和CNV組的CFH Y402H基因SNP rs3753394位點的基因型及等位基因發(fā)生頻率分別與對照組比較明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PCV組的ELN基因SNP rs2301995位點TT基因型及T﹑C等位基因發(fā)生頻率分別與對照組比較明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。SNPrs2301995與PCV具有相關(guān)性，而與隱匿性CNV無相關(guān)性。結(jié)論 中國北方人群CFH Y402H基因SNP rs3753394位點與ELN基因SNP rs2301995位點基因分布頻率的檢測可作為PCV和隱匿性CNV疾病的鑒別診斷，并為這兩種疾病的預(yù)防及治療提供新的思路。

CFH Y402H基因 SNP rs3753394位點 ELN基因 SNP rs2301995位點 隱匿性CNV PCV

眼底病是我國目前致盲的主要原因，已經(jīng)嚴重威脅人們的健康和生活質(zhì)量。臨床上對脈絡(luò)膜息肉樣變性（PCV）與隱匿性脈絡(luò)膜新生血管疾病（隱匿性CNV）的鑒別診斷較困難［1］。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指由于單個核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核苷酸序列的多態(tài)性，其是基因組中最為穩(wěn)定的變異，因而成為基因疾病的重要遺傳標記。本文通過研究分析補體因子H（CFH）和彈性蛋白（ELN）等2個SNP位點基因型頻率分布，旨在探討SNP在鑒別PCV與隱匿性CNV疾病中的應(yīng)用價值。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2012年10月至2014年10月在本院眼科確診為PCV的患者25例（32眼）（PCV組）和隱匿性CNV患者22例（28眼）（CNV組），另選取同期本院健康體檢者23例（46眼）（對照組）。PCV組患者，男17例，女8例；平均年齡（62.38±7.32）歲。CNV組患者，男17例，女5例；平均年齡（66.32±9.37）歲。對照組患者，男13例，女10例；平均年齡（66.30±5.57）歲。所有患者均行視力、眼底彩色照相、熒光素眼底血管造影、吲哚青綠血管造影（ICGA）和光相干斷層掃描（OCT）檢查。CNV分型依照參考文獻［2］標準或病理診斷。PCV臨床診斷依據(jù)ICGA檢查結(jié)果，即沿脈絡(luò)膜血管分支走行可見末端息肉狀脈絡(luò)膜血管病變［3，4］。47例PCV或隱匿性CNV患者中明確有PCV或年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）家族史5例（10.63%）、有中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變（CSC）病史2例（4.25%）、有高血壓病史16例（34.04%）、有高血脂病史22例（46.80%），有糖尿病病史5例（10.63%）、有吸煙史15例（31.91%）。排除其它眼底病變。各組的年齡性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本項目經(jīng)本院倫理委員會批準，并簽署知情同意書。

1.2方法 所有受試者均抽取5ml外周靜脈血，用乙二胺四乙酸鈉抗凝，于-80℃保存?zhèn)溆谩＃?）外周血基因組DNA的提?。篋NA提取使用德國QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒。（2）SNP檢測：儀器、試劑和引物：lightCycler熒光PCR儀使用德國Roche公司產(chǎn)品。 PCR試劑盒采用上海久盛醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品。 PCR擴增：用pfimer5軟件設(shè)計引物，CFH基因 Y402H rs3753394的引物序列為：正義鏈5'- CAAGCACTGCATTCTTGGCA -3'，反義鏈 5'-GCTGTGACCGGCTCTTGGAC -3'；β-actin作為內(nèi)參照，引物序列為：正義鏈5'-TGGAATCCTG TGGCATCCATGAAAC-3'，反義鏈5'-TAAAACGCAGC ACAGTAACAGTCCG-3'. ELN SNP rs2301995引物序列為：正義鏈5'-ATGCCACCCACAACAACTTT-3'，反義鏈5'-CGCGTCCTTCAAACTAACGG-3'反應(yīng)條件：95℃3min→95℃ 30s，54℃ 30s，72℃1min，40個循環(huán)，72℃ 10min，4℃保存。（3）基因片段序列測定和分析：使用測序儀對PCR產(chǎn)物進行序列測定。將測序結(jié)果通過BLAST應(yīng)用軟件與GenBank中的已知序列進行同源性比較。（4）對擴增的目的片斷進行凝膠電泳，通過紫外光凝膠成像系統(tǒng)進行掃描并記錄，用四維成像處理系統(tǒng)，測定各組DNA的特異性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用%表示，組間比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ICGA表現(xiàn) CNV組病變位于黃斑中心凹下17眼（60.7%），中心凹旁7眼（25.0%），中心凹外4眼（14.3%）。PCV組息肉狀病灶位于黃斑區(qū)16眼（50.0%）；血管弓區(qū)6眼，（18.7%）；視盤旁區(qū)4眼（12.5%）；混合區(qū)6眼（18.8%）。

2.2各組CFH Y402H基因SNP rs3753394位點基因型與等位基因分布比較 PCV組和CNV組的CFH Y402H基因SNP rs3753394位點的基因型及等位基因發(fā)生頻率分別與對照組比較明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組CFH Y402H基因SNP rs3753394位點分布比較（%）

2.3各組ELN基因SNP rs2301995位點分布比較 PCV組的ELN基因SNP rs2301995位點TT基因型及T、C等位基因發(fā)生頻率分別與對照組比較明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01），見表2。

表2　各組ELN基因SNP rs2301995位點分布比較（%）

3　討論

目前PCV的確切病因尚不清楚。PCV和AMD在臨床表現(xiàn)上存在較多相似之處，因此有學(xué)者推測與AMD相關(guān)的SNP位點有可能也存在于PCV中。近年CFH基因Y402H 、CFB基因變異與AMD的相關(guān)性獲得國際眼科界的普遍認同［5，6］。CFH是補體旁路激活途徑的調(diào)節(jié)因子，定位于染色體lq32。CFH基因的9號外顯子編碼的多態(tài)性已被確認［7～9］。SNP基因分型技術(shù)已成功確定CFH基因9號外顯子上的Y402H基因位點為第一個AMD易感等位基因［10］。研究證實Y402H與AMD的發(fā)生密切相關(guān)，其與各期AMD的比值達2.45～3.33［5，9］，而與晚期AMD的比值達3.45～7.4［5，8］。目前的研究顯示，CFH的SNP與 AMD的發(fā)生密切相關(guān)，且其SNP位點增加AMD 和 PCV的發(fā)生概率［11］。Lee 等［12］對CFH五個SNP位點進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新加坡中國 人群PCV與CFH兩個位點（rs3753394 和 rs800292 ）相關(guān)，但與CFH 的 Y402H 變異體 （rsl061170）無相關(guān)性。但其它亞洲地區(qū)的報道則與以上結(jié)論有明顯不同，在中國臺灣地區(qū)［13］進行的研究結(jié)果顯示C等位基因的頻率在病例組（11.3%）和對照組（2.8%）間存在顯著差異。本資料結(jié)果顯示，病例組和對照組均符合Hardy-Weinberg平衡，在CNV組，PCV組中Y402H rs rs3753394基因型及等位基因分別與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明Y420Hrs rs3753394與CNV，PCV顯著相關(guān)。與上述研究結(jié)果相符。因此作者認為，隱匿性CNV和PCV 可能有著相同的基因背景 。

彈性蛋白在脈絡(luò)膜血管壁中能維持血管壁的形態(tài)［14］。Kuroiwa等［15］發(fā)現(xiàn)PCV息肉狀血管灶中血管壁的彈性纖維層發(fā)生破壞，認為PCV的基本病理機制是脈絡(luò)膜動脈硬化和息肉灶血管壁的彈性蛋白功能受損。Kondo 等［16］對濕性AMD和PCV與5個彈性蛋白SNP位點相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，SNP位點（rs230199 5）增加PCV的7.5倍患病風(fēng) 險，而這些位點均與濕性AMD 無關(guān)，因此認為這一基因多態(tài)性的差異表明濕性AMD和PCV的病理機制不同，提示nAMD 和PCV的發(fā)病存在差異，Lima等［17］對高加索人群的 ELN基因SNP位點（rs2301995）研究發(fā)現(xiàn)，SNP位點（rs2301995）與PCV和AMD的發(fā)生均無相關(guān)性。本資料結(jié)果顯示，PCV組中ELN rs2301995的TT基因型及等位基因分別與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，（P＜0.05或0.01），而在CNV組的表達則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明中國人群ELN SNPrs2301995在PCV疾病中分布頻率顯著增高，而在隱匿性CNV疾病中則無差異，進一步揭示兩種疾病的發(fā)病機制有所不同。

綜上所述，中國北方人群CFH Y402H rs3753394、ELN rs2301995位點具有多態(tài)性，CFH Y402H rs3753394T/C多態(tài)性可能與中國北方地區(qū)人群PCV疾病和隱匿性CNV疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，ELN rs2301995C/T多態(tài)性可能與中國北方地區(qū)人群PCV疾病的病理相關(guān)，其基因分布頻率的差異可作為PCV疾病和隱匿性CNV疾病鑒別診斷，且為兩種疾病的預(yù)防和治療提供新的方案。

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Objective To investigate the association of polymorphisms of CFH（Y402H rs3753394）﹑ELNrs2301995 with PCV and occult CNV in a northern Chinese cohort. Methods The 25 cases of patients with PCV （PCV group）﹑22 cases of patients with occult CNV group （CNV group ） and 23 cases of normal persons from our physical examination center （control group）were selected，all of the subjects' peripheral blood DNA were collected to analyze the correlation between genetic variation results and the diseases with PCV and occult CNV by PCR amplifi cation in detection to single nucleotide polymorphism of CFH and ELN. Results In PCV and CNV groups the genotype and allele frequency of SNP rs3753394 loci in CFH Y402H gene were signifi cantly increased compared with controls，the differences were statistically signifi cant （P ＜ 0.05），in PCV group TT genotype and T，C allele frequency of SNP rs2301995 loci in ELN gene were signifi cantly increased compared with controls，the difference was statistically signifi cant （P＜0.05 or 0.05）.Rs2301995 was associated with PCV，and no correlation with occult CNV. Conclution People in northern China CFH Y402H gene SNP rs3753394 loci and ELN SNP rs2301995 site distribution of gene frequency of testing can be as a PCV and occult CNV differential diagnosis of the disease，In northern Chinese population the different of distribution of gene frequency can be as a PCV and occult CNV differential diagnosis of the disease by detection of CFH Y402H gene SNP rs3753394 loci and SNPS rs2301995 ELN gene loci，providing new ideas of prevention and treatment for the two kinds of diseases .

CFH Y402H gene SNP rs3753394 ELN gene SNP rs2301995 occult CNV PCV

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