馬巧靈，申元英，，*，楊芳，郭樂，王云紅，李超男

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

蘋果酵素對代謝性疾病模型小鼠的實驗研究

馬巧靈1，申元英1，2，*，楊芳1，郭樂1，王云紅1，李超男2

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

研究自制蘋果酵素對高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）建立II型糖尿病小鼠模型的降糖、降脂效果。造模成功的70只8周齡雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、酵素高劑量組、酵素中劑量組、酵素低劑量組及陽性組（二甲雙胍），并分別對各組每天灌胃干預(yù)治療28 d；檢測每組小鼠空腹血糖（afsting blood glucose，F(xiàn)BG）、血脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）；每周稱量每組小鼠體重，動態(tài)觀察小鼠體重變化及小鼠飲食水量變化。模型組血糖較正常組上升（P＜0.05），且維持較好，說明造模成功；酵素高劑量組、陽性組空腹血糖及甘油三脂，總膽固醇較模型組有下降，且維持較好（P＜0.05）。酵素對II型糖尿病小鼠具有良好的降血糖、降血脂作用。

酵素；II型糖尿病；血糖；血脂；動物模型

II型糖尿病是由于胰島素抵抗或胰島素分泌不足而引起碳水化合物、脂肪及蛋白質(zhì)代謝紊亂的綜合征，約占糖尿病人總數(shù)的90%。糖尿病是全球性嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，發(fā)展迅速，對人類健康危害巨大。近年來，糖尿病及其并發(fā)癥造成的醫(yī)療開支巨幅增長，并給發(fā)展中國家?guī)韯趧恿Φ木薮髶p失。

酵素廣泛存在于自然界的生命體中，所有的生命活動與酵素密不可分，因此有“酵素是生命的起源”的說法［1］，微生物酵素中所含的微生物主要是酵母菌（接合酵母屬Zygosaccharomyces spp．）、畢赤酵母Pichia spp．）、曲霉（米曲霉Aspergillus oryzae）、乳酸菌（明串珠菌leuconostoc spp．）［2］等。于曉艷［3］等研究認(rèn)為蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶等是微生物酵素類保健食品的主要功效酶。

通過自制蘋果酵素對II型糖尿病模型小鼠血糖、血糖及血脂的影響研究，尋找一種較為安全的調(diào)節(jié)或治療人類代謝疾病的方法。

1材料與方法

1.1試驗試劑與儀器

血糖試紙條及血糖儀：購自艾康生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇測定試劑盒：均購自長春匯力生物技術(shù)有限公司；UV-T6紫外分光光度儀：北京瑞利分析儀器公司；TGL-16G菲恰爾臺式離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；灌胃針頭、體重秤、脫脂棉。

1.2試驗動物

清潔級昆明種雄性小鼠70只，購自大理學(xué)院實驗動物中心，8周齡，體重（42±2.93）g，室溫保持在20℃～25℃。動物自由進(jìn)食、進(jìn)水。開始試驗前動物適應(yīng)環(huán)境1周。隨機(jī)將小鼠隨機(jī)分為正常組（n=10），酵素高劑量組（n=12）、酵素中劑量組組（n=12）、酵素低劑量組（n= 12）、模型組（n=12）和二甲雙胍組（n=12）。

1.3飼料

常規(guī)及高脂飼料，高脂飼料為（小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料+ 20%豬油+10%白砂糖+25%的蛋白質(zhì)）。

1.4試驗用藥物

鏈脲佐菌素（STZ）美國Sigma公司，臨時溶于0.1 mol/L，pH4.4的檸檬酸溶液中，0.22 μm微孔過濾，保持冰??；4℃預(yù)冷，現(xiàn)用現(xiàn)配；鹽酸二甲雙胍片，10%甲醛溶液。

1.5試驗方法

1.5.1動物造模

STZ致糖尿病小鼠模型的建立，雄性小鼠，普通飼料飼養(yǎng)1周，正常對照組喂基礎(chǔ)飼料，余下各組小鼠喂高脂飲食，喂養(yǎng)4周后注射STZ，注射前禁食18 h，II型糖尿病模型組連續(xù)5 d小劑量70 mg/kg腹腔注射STZ，正常對照組注射等體積的檸檬酸緩沖液。注射后，正常對照組喂普通飼料；其余各組繼續(xù)給予高脂飲食。小鼠禁食8 h后第7天后尾靜脈取血測空腹血糖，用滅菌小剪刀剪尾取血，應(yīng)用血糖儀測定血糖，血糖≥11.1 mmol/L確定為糖尿病模型成功。

1.5.2動物分組

將造模成功（II型糖尿病治療組）的小鼠隨機(jī)分成6組：正常對照組、酵素組（高、中、低）、陽性對照組（二甲雙胍150 mg/kg）和模型組，所有糖尿病造模小鼠每天進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)給藥28 d。

1.5.3統(tǒng)計分析

1.5.4生化指標(biāo)檢測

在第28天給藥后禁食8 h，測定生化指標(biāo)：空腹血糖、TC（總膽固醇）、TG（甘油三酯）作為評判酵素治療II型糖尿病藥效的指標(biāo)。酵素對II型糖尿病小鼠體質(zhì)量及空腹血糖的影響。體重作為衡量糖尿病小鼠癥狀的重要指標(biāo)，試驗過程中采用（42±2.93）g昆明種小鼠，經(jīng)過28 d灌胃后，各組小鼠空腹血糖值，詳見表1。如表1所示。

表1　酵素對小鼠血糖的影響Table 1Effects of enzyme on blood glucose in mice

由表1可知，模型對照組小鼠空腹血糖水平顯著高于正常對照組（P＜0.05），血糖達(dá)22.31 mmol/L，表明小鼠高血糖模型成功。與模型對照組相比，陽性對照組的降血糖作用具有顯著性差異（P＜0.05），同樣模型組與酵素組比較血糖，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明酵素能抑制糖尿病小鼠血糖升高。各組降糖率（降糖率=（治療前血糖濃度一治療后血糖濃度）/治療前血糖濃度）：陽性組、酵素高劑量、中劑量組、低劑量組組分別為33.02%、20.44%、14.17%、11.28%，詳見表2。

表2　酵素對小鼠體質(zhì)量的影響（±s，g）Table 2Effects of enzyme on the weight in mice（±s，g）

表2　酵素對小鼠體質(zhì)量的影響（±s，g）Table 2Effects of enzyme on the weight in mice（±s，g）

組別給藥前給藥后第7天第14天第21天第28天正常對照組43.52± 3.26 43.26± 1.96模型對照組42.71± 2.93 43.98± 1.39 43.62± 2.09 43.28± 1.56 35.02± 2.87酵素高劑量組42.50± 4.54 34.09± 4.17陽性對照組43.10± 1.96 36.64± 2.73 34.9± 2.89 34.10± 2.83 36.67± 3.05 34.61± 3.33 34.56± 3.36 34.83± 4.72酵素中劑量組42.58± 3.23 38.98± 5.49 35.45± 5.29 34.90± 4.27 35.31± 4.81酵素低劑量組43.66± 1.34 38.38± 5.05 35.05± 4.28 35.56± 3.96 41.31± 7.83 37.27± 7.99 37.62± 7.90 37.56± 7.87

從表2可見，正常對照組小鼠體重穩(wěn)定，其他各組小鼠體重較給藥前有下降趨勢，造模初期體重下降幅度較大，后期處于一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

1.5.5酵素對II型糖尿病小鼠血清中TC、TG的影響

據(jù)有關(guān)報道，糖尿病患者可發(fā)生異常高血脂癥。本研究中STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠出現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常，主要特征為TG、TC值升高，而脂質(zhì)代謝紊亂是糖尿病并發(fā)癥之一，因此改善脂代謝異常也是糖尿病的有效治療手段之一。經(jīng)過28 d灌胃后，小鼠血脂指標(biāo)，詳見表3。

表3　酵素對小鼠血脂指標(biāo)的影響（±s）Table 3Effects of enzyme on blood lipid in mice（±s）

表3　酵素對小鼠血脂指標(biāo)的影響（±s）Table 3Effects of enzyme on blood lipid in mice（±s）

注:與正常組比較☆P＜0.05；模型組比較★P＜0.05。

組別例數(shù)（N）TG/（mmol/L）TC/（mmol/L）正常對照組90.88±0.34★2.01±0.76★模型對照組92.11±0.71☆5.93±0.67☆陽性對照組80.67±0.50☆★5.02±1.67☆酵素高劑量組100.38±0.26☆★3.76±1.38☆★酵素中劑量組90.43±0.35★4.13±1.64☆★酵素低劑量組90.86±0.39★4.88±0.98☆

如表3所示。模型對照組小鼠血清中TC、TG水平均顯著高于空白組（P＜0.05）。酵素給藥組能降低II型糖尿病小鼠血清TG、TC水平，尤其是酵素高劑量組降低血脂和總膽固醇明顯，血清TG、TC水平總體上具有降低的趨勢；而相對模型對照組與酵素組比較具有顯著性差異（P＜0.05）；酵素具有調(diào)節(jié)II型糖尿病小鼠血脂和總膽固醇的作用，能顯著降低小鼠血清中TG、TC水平。

2結(jié)論與討論

II型糖尿病的病因非常復(fù)雜，涉及到遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用，其主要發(fā)病機(jī)制為胰島素抵抗或胰島素分泌相對不足。發(fā)生II型糖尿病時多表現(xiàn)為高胰島素血癥、高血糖和肥胖，本研究中顯示高脂飼料加一定劑量STZ小鼠的血糖、體重、飲水量均明顯升高，本試驗方案是經(jīng)過預(yù)試的，在研究中使用的是高脂飼料，該飼料具有很高的誘導(dǎo)胰島素抵抗和肥胖的成功率。

STZ為對一定種屬動物的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，能誘發(fā)許多動物產(chǎn)生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造動物模型。而注射較少量STZ時，由于只是破壞一部分胰島β細(xì)胞的功能，造成外周組織對胰島素不敏感，同時給予高熱量飼料喂養(yǎng)，兩者結(jié)合便誘導(dǎo)出II型糖尿病小鼠模型。小鼠對STZ有一定的耐受性，研究顯示有一次性大劑量給藥方法，也有連續(xù)多次給藥方法，使用的藥物劑量也從20 mg/kg至 240 mg/kg不等［4-5］，得到的模型的血糖水平以及血糖維持時間也有差距。注射150 mg/kg或者更大劑量可以引起明顯的胰島β細(xì)胞受損，使血糖明顯升高，這種方法誘導(dǎo)迅速建立的是I型糖尿病模型。在本研究中使用70 mg/kg的STZ可以使胰島β細(xì)胞發(fā)生輕度的受損，使血糖較注射前輕度升高。但是在高脂飼料的導(dǎo)致胰島素抵抗的基礎(chǔ)上，受損的胰島β細(xì)胞不足以維持正常的血糖穩(wěn)態(tài)，至少可以維持12 w，致使血糖顯著升高［6］。

本試驗以高脂飼料喂養(yǎng)4周與腹腔注射STZ，聯(lián)合造II型糖尿病小鼠模型，考察了酵素對II型糖尿病小鼠的影響，并且自制的蘋果酵素采用市售的可以放心食用的蘋果，經(jīng)過一段時間的發(fā)酵即可食用。28 d小鼠灌胃試驗表明，酵素能緩解II型糖尿病小鼠多飲多食等癥狀的作用。同時酵素可抑制糖尿病小鼠血糖升高，在第28天與試驗起始相比，陽性組和酵素高劑量組小鼠空腹血糖值比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，尚不能認(rèn)為它們在降血糖上有差異。同時酵素劑量組能降低II型糖尿病小鼠血清中TG、TC含量，說明酵素還具有調(diào)節(jié)II型糖尿病小鼠脂代謝的作用。

綜上所述，酵素能抑制II型糖尿病小鼠血糖值的增加，降低血清中TG、TC含量。但有關(guān)酵素如何參與機(jī)體的血糖、血脂代謝，以及其分子層面更深入的降糖、降脂機(jī)理尚有待研究，本文也為其預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥提供了試驗和理論參考。

［1］板倉弘重.食用酵素食品預(yù)防生活習(xí)慣［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，22（4）:80

［2］Hideki Okada，Naoki Kawazoe，Akira Yamamori，et al．Structural analysis and synthesis of oligosaccha-rides isolated from fermented beverage of plant extract［J］．Journal of Applied Glycoscience，2008，55: 143-148

［3］于曉艷，任清，盧舒嫻，等．微生物酵素主要功效酶活力的測定［J］．食品科技，2008（7）:193-196

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［6］閔筱輝，陳其奎，于濤，等.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立長期穩(wěn)定糖尿病小鼠模型的給藥方案研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10（4）:7-10

Experimental Study of Model Mice on the Apple Enzyme of Metabolic Disease

MA Qiao-ling1，SHEN Yuan-ying1，2，*，YANG Fang1，GUO Le1，WANG Yun-hong1，LI Chao-nan2
（1.School of Public Health，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China；2.Pre-clinical College，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

To study on homemade apple enzyme with high fat diet and streptozotocin（Streptozotocin，STZ）to establish the mice models of type II diabetes mellitus hypoglycemic，lipid-lowering effect.The number of 70 two month's mice were randomly divided into normal group，type II diabetes mellitus model group enzyme treated group，enzyme and low dose treated group，enzyme and middle dose treated group，enzyme and high dose treated group，enzyme and high dose in 28 d．The capability of afsting blood glucose and blood lipid．The weight of mice was monitored every week．Food and drink of the mice were also observed in the cages.The afsting blood glucose level of type II diabetes mellitus model was obviously higher than that of normal group（p＜0.05）and steady．The glucose level of metformin treated group was decreased．The glucose level and blood lipid level of enzyme and high dose treated group were obvious difference．Compared with the model group，the levels of TC and TG in this group were lowered remarkably.Enzyme may be related to improving hypoglycemic and hypolipidemic effect in type II diabetes mellitus mice.

enzyme；type II diabetic；afsting blood glucose；blood lipid；animal model

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.004

2015-01-27

2014年度科學(xué)技術(shù)項目（2014SF11）

馬巧靈（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)。