屈園園楊 洪普雄明

新疆地區(qū)水痘帶狀皰疹病毒臨床分離株基因型分析

屈園園1楊 洪2普雄明1

目的： 明確新疆地區(qū)水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）流行的主要基因型。方法： 采集6例水痘和119例帶狀皰疹患者的水皰液，提取標(biāo)本中的DNA，PCR擴(kuò)增ORF22、38、54、62 DNA片段并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的VZV參考株基因序列進(jìn)行比較，并用DNAMAN軟件分析核酸序列和酶切位點(diǎn)。結(jié)果： PCR后電泳顯示125份皰液標(biāo)本中有120份VZV陽(yáng)性。通過(guò)ORF22酶切位點(diǎn)分析，120份VZV臨床分離株經(jīng)序列對(duì)比J型79株，M1型40株，E型1株；通過(guò)ORF38、54酶切位點(diǎn)分析，119例VZV臨床分離株為Pst I+Bgl I+型，1株VZV為Pst I+Bgl I-型；通過(guò)ORF62酶切位點(diǎn)分析，120株毒株均為Sma I-，都是野生株。結(jié)論： 新疆地區(qū)水痘-帶狀皰疹病毒臨床分離株主要為J型野生株。

水痘帶狀皰疹病毒； 基因型； 單核苷酸多態(tài)性

水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）屬皰疹病毒α亞科，稱人類皰疹病毒3型（human herpesvirus 3，HHV-3）。人類對(duì)VZV普遍易感，引起水痘和帶狀皰疹。水痘減毒活疫苗預(yù)防接種顯著降低了水痘和帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛發(fā)生率，但水痘疫苗不能提供100%的保護(hù)，約有5%兒童和10%成人仍有可能感染VZV，其中由疫苗株引起的占40%，稱為“突破”感染，這些感染者的臨床表現(xiàn)比野生毒株所引起的輕得多。1，2不僅如此，疫苗也可以與野毒株一樣，潛伏在疫苗接種者的感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中，并能被再激活而引發(fā)帶狀皰疹。因此在廣泛使用減毒活疫苗的同時(shí)，有必要檢測(cè)水痘和帶狀皰疹病例中VZV毒株是否由疫苗株引起。3

VZV基因組保守，為 124884bp的線狀雙鏈DNA，包含71個(gè)開放讀碼框，病毒株間的差異小于0.2%，但是不同毒株間在基因序列上卻存在差異，因此從基因?qū)W上探索不同毒株間的差異及基因分型對(duì)水痘-帶狀皰疹病毒疫苗的研究及VZV感染的控制具有重要意義，并越來(lái)越受到世界各國(guó)的重視。目前的VZV基因分型方案多基于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）進(jìn)行，如基于散在SNPs方案，4，5分析 VZV ORF-1、-21、-50和-54中的SNPs；基于ORF22中6個(gè)SNP位點(diǎn)方案；6基于糖蛋白/IE62方案。7

本文則對(duì)來(lái)自新疆地區(qū)125例水痘和帶狀皰疹患者臨床標(biāo)本進(jìn)行分析，明確新疆地區(qū)VZV的基因型并鑒別其野毒株或疫苗株屬性。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2012年4月至2013年1月，本科門診或住院臨床確診為水痘或帶狀皰疹患者共125例，其中水痘6例，年齡5～29歲，平均16.83±10.30歲，男2例，女4例，漢族3例，維族2例，回族1例，病程1～7天，平均3.48±2.39天；帶狀皰疹119例，年齡13～96歲，平均53.88±17.61歲，男57例，女62例，漢族70例，維族41例，回族8例，病程5～14天，平均8.37±4.26天，所有患者均有典型臨床癥狀和體征，符合水痘或帶狀皰疹的診斷標(biāo)準(zhǔn)，8出生并長(zhǎng)期生活在新疆地區(qū)，對(duì)每一個(gè)患者詢問(wèn)并記錄有無(wú)VZV疫苗接種史，發(fā)病前有無(wú)異地外出史。排除標(biāo)準(zhǔn)：非出生于新疆地區(qū)的患者，或雖出生于新疆地區(qū)但并未長(zhǎng)期居住的患者；診斷不明確的；病程超過(guò)2周的；不愿配合或無(wú)法配合本研究的患者。

陽(yáng)性對(duì)照：來(lái)源于凍干水痘減毒活疫苗（v-Oka），購(gòu)自烏市天山區(qū)社區(qū)服務(wù)部（批號(hào)：S20083005）。

1.2方法 臨床標(biāo)本收集：首先清潔皮損處，用無(wú)菌注射器挑破水皰，用無(wú)菌拭子從水皰的一邊開始向另一邊按壓擦拭水皰，收集水皰液，待拭子室溫干燥，將拭子折斷，放入1.5 mL EP管中，-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提?。簩?.5 mL無(wú)菌生理鹽水加入帶有拭子的EP管中，劇烈振蕩以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，待其自然沉淀，吸取上清液。用TIANamp Virus DNA/RNA Kit（北京天根生化科技有限公司）提取總DNA。v-Oka DNA可從減毒活疫苗中直接提取。所有提取DNA經(jīng)紫外分光光度法確定濃度以后，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR采用 VZV各相關(guān)基因的特異性引物6，9，10（表1），用PCR擴(kuò)增ORF22、38、54、62 DNA片段，使用即用PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工生物有限公司）。按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行：使用Touchdown PCR，首先94℃ 4 min熱啟動(dòng)，在接下來(lái)的10個(gè)循環(huán)中每個(gè)循環(huán)為94℃ 1 min，56℃（0.4℃↓）45 s，72℃ 1 min；隨后的20個(gè)循環(huán)為94℃1 min，52℃45 s，72℃ 1 min；最后72℃延伸7min。PCR反應(yīng)完成后，分別取2μL ORF22、38、54、62的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠100V電泳35 min，電泳后的凝膠經(jīng)溴乙錠染色，拍照分析結(jié)果。

序列測(cè)定與基因型判定：PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證陽(yáng)性后送上海生工公司測(cè)序。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載VZV各基因型參考株的序列資料，采用DNAMAN軟件進(jìn)行相關(guān)對(duì)比分析基因型及酶切位點(diǎn)。

表1　VZV基因分型的引物

2　結(jié)果

2.1擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 共采集臨床確診水痘或帶狀皰疹患者的水皰液標(biāo)本125例，其中6例水痘有4例核酸檢測(cè)陽(yáng)性，119例帶狀皰疹有116例核酸檢測(cè)陽(yáng)性，核酸陽(yáng)性標(biāo)本共120例，陽(yáng)性率96%。ORF22、38、54、62的PCR產(chǎn)物分別在447 bp、647 bp、497 bp、268 bp處有一明顯的特異性條帶，鑒定為水痘帶狀皰疹病毒（圖1）。

2.2序列分析結(jié)果 本研究參考Loparev等62004年報(bào)道的基因分型方法，按ORF22中6個(gè)SNPs位點(diǎn)（37902、38019、38055、38081、38177、38229）堿基突變組合，能夠準(zhǔn)確地將VZV分為E、M1、M2、J四種主要基因型。新疆地區(qū)120份VZV臨床分離株ORF22的PCR產(chǎn)物測(cè)序后分別與基因庫(kù)中Dumas、CA123、DR、pOka、vOka等參考株對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，基因型J有79株，基因型M1有40株，基因型E有1株（表2）。

2.3酶切位點(diǎn)分析

2.3.1ORF38（Pst I）酶切位點(diǎn)分析 ORF38的PCR產(chǎn)物為647 bp，如果該片段中存在Pst I位點(diǎn)，則被切成357 bp和290 bp兩個(gè)片段。采用DNAMAN5.2.2軟件進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析測(cè)序結(jié)果及基因庫(kù)中Dumas、CA123、DR、pOka、vOka參考株，120例VZV臨床分離株、Dumas、CA123、DR參考株均含有Pst I酶切位點(diǎn)，而pOka、vOka參考株、疫苗則沒(méi)有相應(yīng)的Pst I酶切位點(diǎn)，與之前的報(bào)道一致。11

2.3.2ORF54（Bgl I）酶切位點(diǎn)分析 ORF54的PCR產(chǎn)物為497 bp，如果該片段中存在Bgl I位點(diǎn)，則被切成256 bp和241 bp兩個(gè)片段。分析表明 CA123、DR、pOka、vOka參考株、119例VZV臨床分離株、疫苗含有Bgl I位點(diǎn)，而Dumas、1例VZV臨床分離株（VZV-005）沒(méi)有相應(yīng)的Bgl I酶切位點(diǎn)。此外結(jié)果發(fā)現(xiàn)VZV-062在ORF54 SNP95250發(fā)生了T代替了C，提示其基因可能發(fā)生了點(diǎn)突變。

2.3.3ORF62（Sma I）酶切位點(diǎn)分析 ORF62的PCR產(chǎn)物為268 bp，疫苗株比野生株在該片段中多一個(gè)Sma I位點(diǎn)，這是鑒別VZV野生毒株和疫苗株的主要方法之一。12結(jié)果顯示vOka參考株、疫苗多一個(gè)Sma I位點(diǎn)，而Dumas、CA123、DR、pOka參考株、120例VZV臨床分離株均缺少一個(gè)Sma I酶切位點(diǎn)。故表明新疆120份VZV病毒株均為野生株。

圖1　VZV臨床分離株ORF22、38、54、62的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

表2　新疆地區(qū)120株VZV臨床分離株的基因型

2.4E型Pst I+Bgl I-VZV毒株來(lái)源及“突破”感染情況 通過(guò)上述分析可知119例VZV臨床分離株為Pst I+Bgl I+型，1株VZV為Pst I+Bgl I-型（此株后被證實(shí)為E型毒株）。對(duì)E型Pst I+Bgl I-VZV毒株感染的患者資料調(diào)查發(fā)現(xiàn)，此患者為63歲維族女性，烏魯木齊人，發(fā)生帶狀皰疹前1周曾至西安旅游，考慮帶狀皰疹是潛伏在體內(nèi)的VZV再激活所致，故此型仍屬于新疆VZV病毒基因型的特點(diǎn)。與此同時(shí)，我們對(duì)所收集樣本中6例水痘患者進(jìn)行再次追溯研究，確認(rèn)在發(fā)病前無(wú)流動(dòng)及異地外出史。

本次收集的新疆地區(qū)120份VZV臨床分離株均為野生株，進(jìn)一步對(duì)這120例患者的v-Oka預(yù)防接種史進(jìn)行調(diào)查顯示4例水痘患者中2例有明確的水痘疫苗接種史（未提供接種卡及時(shí)間），而116例帶狀皰疹患者均表示預(yù)防接種史不詳，可見新疆地區(qū)也出現(xiàn)了疫苗的“突破”感染，這種突破由野生株所引起。進(jìn)而我們?cè)賹?duì)這2例發(fā)生疫苗突破感染的患者進(jìn)行臨床資料分析，顯示2例患者均為女性，分別為漢族和維族，在臨床表現(xiàn)皮疹數(shù)量均大于50個(gè)，1例維族女性有高熱的癥狀，2例均無(wú)并發(fā)癥。

3　討論

VZV的基因型分布具有密切的地理相關(guān)性，不同基因型的毒株在各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的分布不同。J型主要分布于日本、朝鮮、蒙古等亞洲國(guó)家；M1、M2型主要分布在熱帶和亞熱帶；E型主要分布在溫帶、歐美等國(guó)家。6中國(guó)關(guān)于VZV分離株基因型的報(bào)道也逐漸增多，楊吉星等132008年報(bào)道上海地區(qū)1株VZV基因型為 J型；周小勇等142009年報(bào)道武漢地區(qū)78株VZV基因型均為J型；劉靜靜等122009年報(bào)道安徽省19株VZV基因型均為J型；王艷等152012年報(bào)道遼寧省3株VZV基因型均為J型；陳婷婷等162012年報(bào)道福建省44株VZV基因型均為J型；馬瑞等172012年報(bào)道寧波市15株VZV基因型，J型13株，M1型2株；劉蘭等182012年報(bào)道西藏地區(qū)10株VZV基因型，J1型3株，A1型3株，A2型4株。可以看出J型毒株目前為國(guó)內(nèi)流行的主要毒株，而西藏由于地位位置特殊，VZV基因型也呈現(xiàn)出多樣性。本文采用ORF22中6個(gè)SNPs位點(diǎn)堿基突變組合，6將新疆地區(qū)120份VZV臨床分離株分為J型79株，M1型40株，E型1株，結(jié)果符合新疆獨(dú)特的地理分布特點(diǎn)，首先新疆地處亞洲，所以在亞洲流行的基因型J型在新疆占據(jù)65.8%；其次新疆南部與巴基斯坦、印度接界，所以出現(xiàn)了非洲、印度的基因型M1型；再次北疆與俄羅斯聯(lián)邦接壤，流行于歐美的E型也在新疆出現(xiàn)。在美國(guó)、英國(guó)等西方國(guó)家中，絕大多數(shù)野毒株為Pst I+Bgl I-，19本文所分離的120例VZV臨床毒株在ORF38都存在Pst I酶切位點(diǎn)，這和美國(guó)20、英國(guó)21、印度22的報(bào)道相似，但與同處亞洲的日本不同；9另外，本文119例新疆VZV臨床分離株在ORF54都含有Bgl I酶切位點(diǎn)，這與西方的情況有明顯區(qū)別。在美國(guó)和英國(guó)，只有19%～20%的毒株含有Bgl I酶切位點(diǎn)，20，21而印度22及國(guó)內(nèi)合肥、武漢12，14的研究和我們的結(jié)果類似，即所有分析的毒株均含有Bgl I酶切位點(diǎn)。故以往認(rèn)為溫帶地區(qū)除日本外主要流行ORF54（Bgl I-）病毒株，這一觀點(diǎn)可能要重新認(rèn)識(shí)。

對(duì)于研究中僅1例E型Pst I+Bgl-VZV臨床分離株，分析原因可能由于本次研究樣本量不大及來(lái)源較單一有關(guān)，有待今后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，針對(duì)新疆地區(qū)地理位置獨(dú)特且具有民族代表性的地方進(jìn)行分層整群抽樣。

通過(guò)上述與國(guó)內(nèi)外基因型比較，結(jié)果顯示新疆地區(qū)VZV在遺傳特征上即具有高度保守性又具有多態(tài)性，保守性表現(xiàn)為擴(kuò)增的VZV序列之間變化較小、相似度高，而多態(tài)性則體現(xiàn)在單核苷酸多態(tài)性上，即根據(jù)這種特性我們將VZV分為不同亞型。這與中國(guó)其他地區(qū)相比具有獨(dú)特性，再次印證了VZV基因型的分布有著顯著地理差異。

本文通過(guò)分析VZV臨床分離株Sma I酶切位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合v-Oka預(yù)防接種史可以看出水痘疫苗接種并不能為接種者提供100%的保護(hù)，在新疆地區(qū)也出現(xiàn)了疫苗的“突破”感染，這種突破由野生株所引起；我們對(duì)這2例發(fā)生疫苗突破感染的患者進(jìn)行臨床資料分析，發(fā)現(xiàn)其臨床癥狀與未接種v-Oka的水痘患者無(wú)明顯差別，這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)有所區(qū)別。因?yàn)樗煌黄撇±呐R床特征通常表現(xiàn)為癥狀輕、皮損少于50個(gè)，23較少有發(fā)熱癥狀出現(xiàn)，24無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生，25病程也明顯縮短；24而國(guó)內(nèi)張雪等26發(fā)現(xiàn)少數(shù)水痘突破病例出現(xiàn)了肺炎等較重的并發(fā)癥，這與我們報(bào)道相似。本文所研究的帶狀皰疹均為野毒株感染所致，不存在疫苗株感染現(xiàn)象，但就v-Oka的高覆蓋率是否會(huì)導(dǎo)致帶狀皰疹發(fā)病率升高這一觀點(diǎn)，由于需要對(duì)新疆地區(qū)帶狀皰疹發(fā)生率的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，而相關(guān)數(shù)據(jù)也未見報(bào)道，所以尚未得出結(jié)論。

至今水痘尚未納入我國(guó)法定傳染病管理，而在基因型別研究上新疆基本上處于空白階段，雖然目前離特異性使用疫苗還要做很多研究，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為新疆地區(qū)的水痘及帶狀皰疹的防治提供理論依據(jù)和臨床參考。

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（收稿：2015-03-16）

·臨床研究·

Genotypic analysis of clinical varicella-zoster virus isolates in Xinjiang

QU Yuan-yuan，YANG Hong，PU Xiong-ming.Department of Dermatology，People's Hospital of Xinjiang Uyaur Autonomous Region，Urumqi，830001

Objective：To genotype varicella-zoster virus（VZV）strains isolated in Xinjiang.M ethods：DNA was extracted from the blisters fluid in 6 patientswith chickenpox and 119 patientswith zoster.PCR and nucleotide sequencing were performed on the partof open reading frames（ORF）22，38，54 and 62.To confirm the genotypes of isolated virus strains，the gene sequences obtained from PCR products were compared with that in GenBank of VZV strains，and the restriction enzyme sites were analyzed through DNAMAN software analysis.Results：One hundred and twenty samples of 125 were positive of VZV.Restriction enzyme site analysis of ORF 22 showed that 79 strains were genotype J，40 were genotype M1 and 1 was genotype E.Restriction enzyme site analysis of ORF38，54 showed 119 strainswere Pst I+Bgl I+，and 1 strain was Pst I+Bgl I-.Analysis of ORF 62 showed 120 strainswere all wide-type Sma I-.Conclusion：Genotype Jof the VZV isolates is themajor wild strain in Xinjiang region.

varicella-zoster virus；genotype；single nucleotide polymorphism

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院科研基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：20130102）

1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊，830001 2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院北院皮膚科，烏魯木齊，830001