劉 佳 黃艷平 丁文媛 孫志強(qiáng) 楊俊君 韓建文呂新翔 烏日娜

內(nèi)蒙古漢族尋常型銀屑病GJB2基因rs72474224位點(diǎn)檢測(cè)

劉 佳 黃艷平 丁文媛 孫志強(qiáng) 楊俊君 韓建文*呂新翔 烏日娜*

目的： 檢測(cè)內(nèi)蒙古漢族尋常型銀屑病GJB2基因rs72474224位點(diǎn)的多態(tài)性。方法： 提取294例尋常型銀屑病患者及287名正常對(duì)照外周血DNA，利用PCR和連接酶檢測(cè)反應(yīng)檢測(cè)GJB2基因rs72474224的多態(tài)性。結(jié)果： SNP rs72474224等位基因T在病例組和對(duì)照組中的頻率分別為0.03571和0.01045，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004267）。結(jié)論： GJB2基因多態(tài)性rs72474224可能與內(nèi)蒙古漢族人群尋常型銀屑病的易感性相關(guān)。

尋常型銀屑病； GJB2

銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性增殖性炎癥性皮膚病，根據(jù)臨床表現(xiàn)不同主要分為4種類型，其中以尋常型銀屑病最多見，占所有病例90%以上。在中國(guó)銀屑病發(fā)病率大約為0.123%。1近年來，遺傳關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)一大批銀屑病相關(guān)的易感基因。22014年，Tang等3通過全基因組外顯子測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)GJB2基因的一個(gè)錯(cuò)義突變（rs72474224，c.324C＞T，p.Val37Ile）與中國(guó)漢族人群銀屑病易感性相關(guān)。為進(jìn)一步證實(shí)其研究結(jié)果，本研究利用連接酶檢測(cè)反應(yīng)（ligase detection reaction，LDR）對(duì)rs72474224進(jìn)行基因分型，探討其與漢族人群尋常型銀屑病的相關(guān)性。

1　資料和方法

1.1資料 研究對(duì)象：從內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收集尋常型銀屑病患者294例，正常對(duì)照287例。經(jīng)知情同意并簽字后抽取外周靜脈血5 m L，EDTA抗凝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有患者?jīng)臨床及病理證實(shí)診斷，符合尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有對(duì)照排除銀屑病及其他自身免疫疾病，排除銀屑病家族史。本研究經(jīng)過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，并在實(shí)施過程中遵守赫爾辛基宣言。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 利用AxyPrep，AP-MX-BL -GDNA-25基因組DNA提取試劑盒提取患者及對(duì)照基因組DNA，利用分光光度儀檢測(cè)260 nm和280 nm吸光度，計(jì)算DNA濃度。并利用凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，所有DNA樣本均合格。

1.2.2引物及探針的合成 利用 Primer 3 online（Version 0.4.0）軟件（http：//frodo.wi.mit.edu/）和Oligo（Version 6.31）（Molecular Biology Insights Inc.，USA）軟件設(shè)計(jì)特異性引物和LDR探針，針對(duì)該基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條引物，要盡量保證所有基因位點(diǎn)的引物T值相同，PCR反應(yīng)引物序列見表1。根據(jù)LDR探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)LDR的上下游探針，4上游探針5'端用磷酸化修飾，LDR反應(yīng)探針序列見表2。

表1　PCR反應(yīng)引物序列

1.2.3多重PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系為（20μL） 1 μL模板，2μL Buffer緩沖液，0.6μL Mg2+，2μL dNTP，0.2μL TaqDNA聚合酶，2μL引物混合液，加水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；94℃30 s。56℃退火1.5 min。65℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。最后65℃延伸10 min。

1.2.4多重LDR反應(yīng) LDR反應(yīng)體系為（10μL）

1μL Buffer緩沖液，1μL探針混合液，0.05μL Taq DNA連接酶，4μL PCR產(chǎn)物，加水補(bǔ)足10μL。探針混合液濃度為2 pmol/μL。LDR反應(yīng)條件：95℃ 2 min預(yù)變性，94℃15 s，50℃ 25 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.5測(cè)序與基因分型 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過，ABI3730測(cè)序儀測(cè)序分析，最后用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，判讀各位點(diǎn)上的基因分型。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)SNP數(shù)據(jù)質(zhì)控、統(tǒng)計(jì)分析利用PLINK 1.07軟件完成（http：//pngu.mgh.harvard. edu/purcell/plink/）。5計(jì)算其等位基因頻率，病例組及對(duì)照中分別進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)?？ǚ綑z驗(yàn)（χ2）比較病例組及對(duì)照組等位基因頻率，并計(jì)算等位基因的相對(duì)危險(xiǎn)度估計(jì)值比值比OR及其95%可信區(qū)間（95%CI）。Fisher精確概率法比較病例組與對(duì)照組間的基因型頻率，所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1病例組及對(duì)照組質(zhì)控 病例及對(duì)照樣本在性別及年齡方面無顯著性差異，具有可比性（P＞0.05），樣本信息見表3。該SNP在對(duì)照中符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P=1）。

2.2等位基因頻率比較 經(jīng)PLINK 1.07軟件統(tǒng)計(jì)分析，SNP rs72474224的等位基因T在病例組和對(duì)照組中的頻率分別為0.03571和0.01045，兩組之間等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004267，OR= 3.51，95%CI：1.41～8.75）。根據(jù)患者發(fā)病年齡進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，等位基因T在早發(fā)型銀屑?。òl(fā)病年齡小于40歲）中的頻率更高（0.04545），明顯高于對(duì)照組（P=0.0005621，OR=4.51，95%CI：1.77～11.46），而晚發(fā)型銀屑?。òl(fā)病年齡≥40歲）中的等位基因頻率與對(duì)照組無顯著性差異（P=0.5648）（表4）。

2.3基因型頻率分布情況 為分析該SNP的遺傳模式，分別按照累加、隱性、顯性三種模式下比較病例組與對(duì)照組的基因型頻率。利用Fisher確切概率法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在顯性模式下最為顯著（P=0.009），而且在早發(fā)型銀屑病中差異更為顯著（P=0.002），晚發(fā)型銀屑病與對(duì)照組間基因型分布在三種模式下均無顯著性差異（P＞0.05）（表5）。

表3　尋常型銀屑病及對(duì)照組樣本信息

表4　尋常型銀屑病和對(duì)照中rs72474224等位基因頻率分布

表5　尋常型銀屑病和對(duì)照中rs72474224基因型分布

3　討論

2010年，Sun等的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究首次報(bào)道GJB2基因多態(tài)性與銀屑病易感性相關(guān)。62014年全基因組外顯子測(cè)序研究3再次證實(shí)GJB2基因與銀屑病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)位于GJB2基因上錯(cuò)義突變與銀屑病相關(guān)聯(lián)。

GJB2基因定位于13q11-12區(qū)域，全長(zhǎng)為4804 bp，編碼區(qū)為678 bp，由兩個(gè)外顯子組成，即一個(gè)簡(jiǎn)短的外顯子1（exon1）和一個(gè)長(zhǎng)蛋白編碼外顯子 2（exon2），編碼區(qū)主要存在于exon2，編碼在耳蝸和表皮中表達(dá)的β類縫隙連接蛋白Connexin26（Cx26）。Cx26蛋白包括 2個(gè)胞外域（extracellular domain，EC），3個(gè)胞內(nèi)域（intracellular，IC），4個(gè)跨膜域（tans menbrane domain，TM）、細(xì)胞質(zhì)氨基末端和羧基末端，它存在于很多的細(xì)胞和組織中，包括耳蝸，手掌和腳掌，毛囊和汗腺。7GJB2基因突變包括移碼突變、缺失、插入等，可產(chǎn)生有功能缺陷或無功能的Connexin26蛋白，在其蛋白翻譯及通道蛋白聚集水平產(chǎn)生影響。這個(gè)域的突變會(huì)導(dǎo)致Cx26的渠道活動(dòng)受到干擾和聽覺器官的間隙連接因子的功能缺陷。既往研究發(fā)現(xiàn)Cx26的突變均與常染色體隱性非綜合性耳聾（ARNHL），常染色體顯性綜合性耳聾（ADHL）和掌跖角化癥（PPK）有關(guān)。8Bowcock等發(fā)現(xiàn)Cx26在銀屑病皮損中表達(dá)上調(diào)。9缺乏轉(zhuǎn)錄因子Kruppel-likefactor 4（Klf4）的缺陷小鼠在表皮屏障的表達(dá)上產(chǎn)生嚴(yán)重缺陷。Klf4缺陷的新生兒皮膚也顯示出與斑塊狀銀屑病皮損相似的基因表達(dá)改變，并且縫隙連接蛋白Cx26的表達(dá)也顯著上調(diào)。10免疫組化法證實(shí)Cx26在銀屑病患者皮損區(qū)表皮全層有表達(dá)，且蛋白表達(dá)量較非皮損區(qū)及正常對(duì)照顯著增加。8Cx26轉(zhuǎn)基因鼠的皮膚出現(xiàn)銀屑病樣皮損，并具備角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖、分化不全及皮膚屏障功能缺陷等銀屑病皮損特征。8這些研究都提示GJB2基因與銀屑病的發(fā)病密切相關(guān)，可能在維持角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化平衡中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示rs72474224在銀屑病中突變頻率高于正常人，與Tang等3研究結(jié)果類似，均能增加銀屑病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。證實(shí)了其與中國(guó)漢族人尋常型銀屑病的相關(guān)性，更進(jìn)一步提示GJB2基因在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。但是該錯(cuò)義突變?nèi)绾斡绊慍onnexin26蛋白的翻譯及功能仍需要進(jìn)一步功能學(xué)研究。

1 Zhang XJ，HuangW，Yang S，etal.Psoriasis genome-wide association study identifies susceptibility variantswithin LCE gene cluster at 1q21.Nat Genet，2009，41（2）：205-210.

2 Zhang X.Genome-wide association study of skin complex diseases.JDermatol Sci，2012，66（2）：89-97.

3 Tang HY，Jin X，Li Y，et al.A large-scale screen for coding variants predisposing to psoriasis.Nat Genet，2014，46（1）：45-50.

4 Yi P，Chen Z，Yu L，et al.Development of a PCR/LDR/capillary electrophoresis assaywith potential for the detection of a beta-thalassemia fetalmutation inmaternal plasma.JMatern Fetal Neonatal Med，2010，23（8）：920-927.

5Purcell S，Neale B，Todd-Brown K，et al.PLINK：a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses.Am JHum Genet，2007，81（3）：559-575.

6 Sun LD，Cheng H，Wang ZX，etal.Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population. Nat Genet，2010，42：1005-1009.

7 Evans WH，Martin PE.Gap junctions：structure and function（Review）.Mol Membr Biol，2002，19（2）：121-136.

8 Lucke T，Choudhry R，Thorn R，etal.Upregulation of connexin 26 is a feature of keratinocyte differentiation in hyperproliferative epidermis，vaginal epithelium，and buccal epithelium.J Invest Dermatol，1999，112：354-361.

9 Lizzul PF，Aphale A，Malaviva R，et al.Differential expressionof phosphorylated NF-kappaB/RelA treatmentwith etanercept.J Invest Dermatol，2005，124（6）：1275-1283.

10 Hollox EJ，Huffmeier U，Zee uwen PL，etal.Psoriasis is associated with increased beta-defensin genomic copy number.Nat Genet，2008，40（1）：23-25.

（收稿：2015-03-17 修回：2015-03-19）

·病例報(bào)告·

Detection of the polym orphism s of GJB2 gene rs72474224 in patients w ith psoriasis vu lgaris

LIU Jia，HUANG Yan-ping，DINGWen-yuan，et al.Department ofDermatology，the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot，010050

Objective：To detect the polymorphisms of GJB2 gene rs72474224 in patients with psoriasis vulgaris in Han population in Inner Mongolia.M ethods：DNA was extracted from the peripheral blood of 294 patients and 287 controls.The polymorphisms of GJB2 gene rs72474224 were genotyped by PCR-based ligase detection reaction（PCR-LDR）.Results：The genotype frequencies of T in patients and controlswere0.0357 and 0.01045，with a significant difference（P=0.004267）.Conclusion：The polymorphism of GJB2 gene rs72474224 is associated with psoriasis vulgaris in Han population in Inner Mongolia.

psoriasis vulgaris；GJB2

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31160192）

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（編號(hào)：NY2011QN005）

內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)療衛(wèi)生科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201303057）

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?！扒嗄昕萍加⒉胖С钟?jì)劃”（編號(hào)：NJYT-14-B17）

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，呼和浩特，010050