胡志華，馬明波，何 肖，魯 庚，周文龍

（浙江理工大學(xué)材料與紡織學(xué)院，杭州310018）

天然綠色棉色素組分的提取及性能研究

胡志華，馬明波，何 肖，魯 庚，周文龍

（浙江理工大學(xué)材料與紡織學(xué)院，杭州310018）

采用正相柱層析法分段富集綠色棉色素，用紫外-可見光譜分析富集組分的光譜特性，并研究富集組分對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）和2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+·）兩種自由基的清除能力。結(jié)果表明：正相柱對天然綠色棉色素具有更有效的分離效果，0%甲醇能富集到天然綠色棉色素中的黃綠色組分；綠色棉粗提色素及其分段富集組分都具有較好的DPPH·和ABTS+·清除能力。

天然綠色棉；色素；分離；抗氧化

0　引 言

天然彩色棉在加工使用過程中不需要經(jīng)過化學(xué)漂染，在降低生產(chǎn)成本的同時也避免了對環(huán)境的污染［1］。用彩棉纖維加工的面料滿足了消費者對服飾的自然生態(tài)、舒適、健康的需要［2］。然而，人們對天然彩棉纖維的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，只有通過深入的研究，開發(fā)其潛在的功能，才能拓寬其應(yīng)用范圍［3-5］。

有研究表明，天然綠色棉色素的主要成分含有多酚類物質(zhì)［6-8］，而多酚類物質(zhì)由于酚羥基的存在，大多具有一定的抗氧化性能。雖然紡織品的抗氧化性能不如其他性（功）能（如抗菌性能、防紫外性能和阻燃性能等）引人關(guān)注，但抗氧化性能的織物具有清除人體表皮的自由基的潛在功能，防止自由基造成的皮膚老化及抵抗力下降等傷害。為研究綠棉色素的抗氧化性，本研究采用柱層析法對綠色棉色素進(jìn)行富集分離，以維生素C（Vc）為參照，考察各富集組分對DPPH·和ABTS+·兩種自由基的清除能力。

1　實驗部分

1.1實驗材料與試劑

實驗材料：天然綠色棉纖維（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供）。

化學(xué)藥品和試劑：柱層析用硅膠（100～200目，青島海洋化工廠），二氯甲烷、甲醇和乙醇（分析純，杭州高精精細(xì)化工有限公司），二氯甲烷和甲醇（色譜純，阿拉丁試劑有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1綠色棉粗提色素

利用FZ-102微型植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）將綠棉纖維粉碎，然后以二氯甲烷/乙醇（體積比50/50）混合液為提取劑，浴比1∶50（g/ mL），在JK-3200DB超聲波清洗機(jī)（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）中超聲提取2 h，抽濾，在R201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）上將溶劑蒸干，獲得粗提色素備用。

1.2.2綠色棉粗提色素的高效液相色譜（HPLC）分析

分別采用Agilent-1200反相高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）與Waters1525正相高效液相色譜儀（美國沃特斯公司）檢測分析粗提色素的成分，正相檢測條件：流動相A：CH2Cl2；流動相B：體積比為100∶15∶0.6的CH2Cl2、CH3OH和CH3COOH混合溶液，色譜柱Agilent Zorbax Rx-Sil（4.6×250 mm，5μm），流速0.8 m L/min，進(jìn)樣量10μL，檢測波長320 nm，梯度洗脫：0～15 min，20%～60%B；15～25 min，60%～70%B；25～30 min，70%～100%B；30～35 min，100%～0B。反相檢測條件：流動相A：甲醇；流動相B：0.03%三氟乙酸，色譜柱Agilent Zorbax Edipse XDB-C18（4.6×150 mm，5μm），流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10μL，檢測波長320 nm，梯度洗脫：0～12 min，60%～100%A；12～22 min，100%A；22～26 min，100%～60%A。

1.2.3綠色棉色素組分的富集

將正相硅膠于110℃烘箱中烘1.5 h，然后將其緩慢倒入正己烷中，并攪拌，待混合均勻后，再填入預(yù)裝有少量正己烷的層析柱中。在保證液面始終高于填料的前提下，用正己烷沖洗柱子，使填料填實。采用干法上樣：色素粉末與適量硅膠混合，利用二氯甲烷/乙醇溶液溶解，然后將溶劑蒸干，緩慢加在層析柱中。洗脫劑采用二氯甲烷與甲醇的混合溶液，甲醇的體積百分比依次為0%、10%、30%、60%、100%，將溶劑蒸干備用。

1.2.4綠色棉色素組分的紫外光譜測定

將粗提色素與各富集的色素組分用適量二氯甲烷/乙醇（體積比50/50）溶液溶解，以二氯甲烷/乙醇（體積比50/50）為參照，用TU-1950紫外-可見分光光度計（北京譜析通用儀器有限公司）測試試樣的紫外可見吸收光譜。

1.2.5綠色棉色素組分對DPPH·的清除

適當(dāng)修改Gülc in clhami［9］的試驗方法，以無水乙醇為溶劑配制0.1 mmol/L的DPPH·溶液，體積比1∶1的無水乙醇和二氯甲烷混合液溶解色素組分，備用。分別取1 mL濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.1 g/L粗提色素與各富集組分溶液，往其中加入2 mL的DPPH溶液和7 mL的二氯甲烷/乙醇（50/50）混合溶液。37℃恒溫振蕩30 min，測定517 nm處的吸光度，記作A樣品。空白組測定方法為8 mL的二氯甲烷/乙醇（50/50）混合溶液中加入2 mL的DPPH溶液，37℃恒溫振蕩30 min，測定517 nm處的吸光度，記作A空白。為消除色素在517 nm處的可見吸收對實驗的影響，設(shè)定對照組，測定方法為在1 mL的色素溶液中加入9 mL的二氯甲烷/乙醇（50/50）混合溶液，37℃恒溫振蕩30 min，測定517 nm處的吸光度，記作A對照。DPPH的清除率I的計算：

1.2.6綠色棉色素組分對ABTS+·的清除

適當(dāng)修改Gülc in clhami的試驗方法，配制ABTS+·溶液：先配制2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液，并以此來配制7 mmol/L的ABTS+·溶液，將該溶液室溫避光放置12～16 h，在測試時需將ABTS+·溶液用0.1mol/L p H=7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋，使其在734 nm處的吸光度在0.68～0.72之間。測試方法為在1 mL濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.1g/L的粗提色素與各富集組分溶液中分別加入10 mL的稀釋之后的ABTS+·溶液，充分振蕩，密封避光，6 min之后測試734 nm處的吸光度，記作A樣品?？瞻捉M測定方法為1 mL的無水乙醇中加入10 mL的稀釋之后的ABTS+·溶液，6 min之后測試734 nm處的吸光度，記作A空白。對照組測定方法為1 mL的色素溶液中加入10 mL的0.1 mol/L p H=7.4的磷酸鹽緩沖液，6 min之后測試734 nm處的吸光度，記作A對照。ABTS+·的清除率I用式（1）計算。

2　結(jié)果與討論

2.1綠色棉粗提色素的HPLC分析

圖1為采用正相柱和反相柱進(jìn)行天然綠色棉色素組分分離的HPLC圖譜。圖1顯示，天然綠色棉色素由多種組分組成。采用反相柱對天然綠色棉色素分離已經(jīng)有人做過探索［6］，其分離結(jié)果和本文一致；而采用正相柱進(jìn)行天然綠色棉組分的分離此前還未見報道。從圖1（b）中可以看出，采用正相色譜柱能分離檢測到更多的色素組分。其中正相HPLC圖譜中保留時間為20.5～24.0 min的組分和反相HPLC圖譜檢測到的組分一致，而正相HPLC圖譜中保留時間在12.0～20.0min的一系列組分，并不能在反相HPLC中檢測到。說明正相柱可以更有效地對天然綠色棉色素實施組分分離。因而本文采用正相柱層析法來分段富集綠色棉色素。

2.2綠色棉色素組分的紫外-可見光譜分析

綠色棉粗提色素及其各富集組分的紫外-可見吸收測試結(jié)果見圖2。圖2顯示，粗提色素的最大吸收峰在228、242、293 nm和327 nm，與咖啡酸的紫外吸收曲線類似［10］，推測綠棉色素中可能含有咖啡酸的衍生物，與楊永林［7］的研究相吻合。綠棉色素及其各富集組分在紫外區(qū)的摩爾吸光系數(shù)遠(yuǎn)大于可見區(qū)，適當(dāng)濃縮，發(fā)現(xiàn)在665 nm左右綠棉粗提色素及0%甲醇富集組分都出現(xiàn)一個吸收峰，說明粗提色素和0%甲醇富集組分具有藍(lán)綠光顯色特性［11］。0%甲醇富集組分在400 nm左右具有強(qiáng)的吸收，其吸收的形式不是銳峰而是肩峰的形式，具有黃色的顯色特性，因而0%甲醇富集組分顯示為黃綠色。10%、30%、60%甲醇富集組分在可見區(qū)的380～450nm波段都有一定的吸收，具有黃光的顯色特性。而100%甲醇富集組在可見區(qū)都沒有明顯吸收，為無色或顏色較淺的組分。

圖1　綠棉色素的HPLC圖譜

圖2　綠棉色素及其各富集組分的紫外-可見譜圖

2.3綠色棉色素組分對DPPH·的清除能力

綠棉色素組分對DPPH·的清除能力的實驗結(jié)果見圖3。圖3可見，富集到的組分都有一定的DPPH·的清除能力，但低于Vc。對DPPH·的清除能力由高到低分別是60%甲醇、0%甲醇、100%甲醇、30%甲醇和10%甲醇富集的色素組分。由于在對綠棉色素分段富集時死吸附嚴(yán)重，推測死吸附的成分中可能含有比粗提色素本身抗氧化性能更優(yōu)異的成分。同時可以發(fā)現(xiàn)，在測試的質(zhì)量范圍內(nèi)，色素質(zhì)量與DPPH·清除率呈線性關(guān)系，其擬合線性方程見表1。以清除50%的自由基所需要的色素質(zhì)量IE50這一指標(biāo)來評估抗氧化性能，IE50越小，表明抗氧化活性越強(qiáng)。粗提色素的IE50為0.0356mg略高于Vc的0.0211mg，約是Vc的1.7倍，0甲醇富集組分的IE50約為Vc的2.5倍，10%甲醇富集組分的IE50約為Vc的7.4倍，30%甲醇富集組分的IE50約為Vc的6.4倍，60%甲醇富集組分的IE50約為Vc的1.7倍，100%甲醇富集組分的IE50約為Vc的4.3倍，雖然綠色棉各色素組分的抗氧化活性不如Vc的強(qiáng)，但也說明提取的綠棉色素組分均具有較優(yōu)異的DPPH·清除性能。

圖3　Vc和綠棉色素組分對DPPH·的清除率

2.4綠色棉色素組分對ABTS+·的清除能力

綠色棉色素組分對ABTS+·的清除能力實驗結(jié)果見圖4。圖4顯示，與清除DPPH·類似，富集到的色素組分均具有一定的ABTS+·的清除能力，但均略低于Vc。對ABTS+·的清除能力由高到低分別是60%甲醇、0%甲醇、100%甲醇、10%甲醇和30%甲醇富集到的色素組分。同樣，在測試的質(zhì)量范圍內(nèi)，色素質(zhì)量與ABTS+·清除率呈線性關(guān)系，見表2。以IE50這一指標(biāo)評估，粗提色素的IE50約為Vc的1.8倍，0%甲醇富集組分、10%甲醇富集組分、30%甲醇富集組分、60%甲醇富集組分、100%甲醇富集組分的IE50依次約為Vc的4.2、6.0、6.4、2.5、4.4倍，雖然綠色棉各色素組分的抗氧化活性不如Vc的強(qiáng)，但也說明富集到的綠棉色素組分均具有較優(yōu)異的ABTS+·清除性能。

圖4　Vc和綠棉色素組分對ABTS+·的清除率

表2　Vc和綠棉色素組分清除ABTS+·的線性擬合方程和lE50

3　結(jié) 論

利用正相色譜能更有效地檢測分離天然綠色棉色素成分，0%甲醇富集到的組分在665 nm有吸收峰，說明該組分具有藍(lán)綠光的顯色特性，在400 nm左右具有強(qiáng)的吸收，其吸收的形式不是銳峰而是肩峰的形式，具有黃色的顯色特性，因而該組分呈現(xiàn)黃綠色。綠色棉粗提色素及其分段富集組分都具有較好的DPPH·和ABTS+·清除能力，抗氧化性能略低于Vc。由于抗氧化實驗后的溶液是包含有未被氧化的色素、被氧化的色素、未被還原的自由基、被還原的自由基的混合溶液，因此還無法對氧化前后的綠色棉色素組分的光譜特性進(jìn)行研究。天然綠色棉色素組分的結(jié)構(gòu)目前還沒有定論，對于其抗氧化機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

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HU Zhi-hua，MA Ming-bo，HE Xiao，LU Geng，ZHOU Wen-long
（College of Materials and Textiles，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou，Zhejiang，310018，China）

In this paper，the extractions of green cotton pigment are segmented by using normal phase chromatography，and the spectral characteristics of enriched components with UV-VIS spectrum are analyzed.Besides，scavenging activities of free radicals DPPH·and ABTS+·are analyzed.The experimental result shows that normal phase column is more effective for the separation of pigment in green cotton；the yellowish green component can be enriched by the 0%methanol.Green cotton pigment and its segmented enrichment component have good DPPH·and ABTS+·scavenging activities.

natural colored cotton；green cotton；pigment；separation；antioxidation

TS102.2

A

1673-3851（2015）06-0757-04

（責(zé)任編輯：張祖堯）

2015-02-01

國家自然科學(xué)基金項目（51373156）

胡志華（1990-），男，江西新余人，碩士研究生，主要從事新型紡織材料與綠色紡織品的研究。

周文龍，E-mail：wzhou@zstu.edu.cn