衛(wèi)亞麗，吳嬌，鄧永蘋

（貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院貴州少數(shù)民族醫(yī)藥資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化土大黃總黃酮超聲提取工藝

衛(wèi)亞麗，吳嬌，鄧永蘋

（貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院貴州少數(shù)民族醫(yī)藥資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025）

優(yōu)化土大黃總黃酮的提取工藝。以土大黃為材料，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)。土大黃總黃酮超聲提取的最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度54%，提取時(shí)間110 min，物料比為1∶99（g/mL），且乙醇的濃度對總黃酮提取率的影響最大。在最佳優(yōu)化條件下土大黃總黃酮得率為（16.7±0.03）mg/g，為預(yù)測值的96.5%，可用于土大黃總黃酮的提取。

土大黃；總黃酮；響應(yīng)曲面法；超聲提取法

土大黃為蓼科酸模屬植物土大黃（Rumex madaio Makino［R.daiwoo Makino］），以根和葉入藥，具有清熱解毒，止血，祛瘀，通便，殺蟲功效。研究表明［1-3］：土大黃主要的化學(xué)成分為蒽醌類、黃酮類、二苯乙烯類、糖苷類等，其中黃酮類化合物具有抗炎癥［4］、抗菌［5］、抗過敏、抗氧化［6］、抗病毒［7］等多種活性，還有抗癌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤［8］、治療心腦血管疾?。?-10］等藥用保健功能，具有比較大的開發(fā)價(jià)值。目前關(guān)于黃酮類物質(zhì)的提取、分離、純化、含量測定的研究報(bào)道較多［11-13］，但目前土大黃總黃酮的提取工藝優(yōu)化研究筆者鮮見國內(nèi)外報(bào)道。本研究利用響應(yīng)曲面優(yōu)化土大黃的超聲提取工藝，以期為土大黃總黃酮提取工藝優(yōu)化提供理論參考，為土大黃的綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1儀器與材料

1.1.1儀器

756紫外可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；XFB500粉碎機(jī)：湖南中誠制藥機(jī)械廠；超聲器波清洗儀SB-100：上海比朗儀器有限公司。

1.1.2材料

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（＞98%）：貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司；無水乙醇、鹽酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁均為分析純；土大黃購自安徽毫州中藥材市場。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品0.010 0 g，置10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，搖勻，即得蘆丁對照品溶液（1 mg/mL）。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取蘆丁對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL的容量瓶中，再分別加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL 50%的乙醇，加入5%的亞硝酸鈉0.5 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%的硝酸鋁0.5 mL，靜置6 min，然后加入4%氫氧化鈉4.0 mL，最后用50%乙醇定容，搖勻，靜置15 min后，在510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁的濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度y（Abs）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.3土大黃總黃酮提取

稱取土大黃200 g在60℃真空干燥至恒重、粉碎、過60目篩、備用。取0.5g樣品粉末，精密稱定，置于三角瓶內(nèi)，加入50%乙醇30 mL，40℃下超聲90 min，抽濾、洗滌，最后定容于50 mL容量瓶中，用于總黃酮含量測定。

1.2.4總黃酮的含量測定

總黃酮含量測定的方法為經(jīng)典亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法。取樣品溶液0.2 mL于10 mL容量瓶內(nèi)，按1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線下的方法進(jìn)行測定。

1.2.5單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇提取溫度、提取時(shí)間、物料比和乙醇濃度這4個對土大黃總黃酮提取工藝有影響的參數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。具體條件見表1。

表1　單因素設(shè)計(jì)Table 1The single factors design conditions

1.2.6響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇的響應(yīng)曲面試驗(yàn)范圍，選定提取溫度為40℃，利用Design-Expert8.0軟件，以提取時(shí)間（X1，min）、乙醇濃度（X2，%）、物料比（X3，g/mL）作為變量，以-1、0、1代表變量水平，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)方案，見表2。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design Expert分析。

表2　土大黃總黃酮提取因素與水平Table 2Factors and levels of total flavonoids extraction from Rumex madaio Makino

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard curve of rutin

以蘆丁的濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度y（Abs）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為y= 11.182x-0.000 8，R=0.999，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃0.02mg/mL～0.10 mg/mL范圍時(shí)，線性關(guān)系良好。

2.2單因素對土大黃總黃酮提取率的影響

2.2.1時(shí)間對土大黃總黃酮提取率的影響

時(shí)間對土大黃總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2。

圖2　提取時(shí)間對土大黃總黃酮提取率的影響Fig.2Effect of extraction time on the extraction rateof total flavonoids from Rumex madaio Makino

由圖2可知，當(dāng)時(shí)間在30 min～90 min之間時(shí)，土大黃總黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長而呈上升趨勢，90 min時(shí)達(dá)到最大值，超過90 min土大黃總黃酮的提取率而逐漸下降。這說明總黃酮浸出過程與時(shí)間密切相關(guān)，時(shí)間短產(chǎn)物溶解不充分，但時(shí)間過長又會引起黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而使提取率降低。

2.2.2乙醇濃度對土大黃總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對土大黃總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3　乙醇濃度對土大黃總黃酮提取率的影響Fig.3Effect of ethanol concentration on the extraction rateof total flavonoids from Rumex madaio Makino

由圖3可知，當(dāng)乙醇濃度在25%～50%之間時(shí)，土大黃總黃酮提取率隨乙醇濃度的升高而呈上升趨勢，這可能是因?yàn)殡S著乙醇濃度的提高，溶于乙醇中的總黃酮溶出量增加，提取率隨之提高，當(dāng)乙醇濃度超過50%時(shí)，總黃酮提取率隨乙醇濃度的升高而逐漸降低。當(dāng)乙醇濃度增加到一定條件時(shí)，溶于乙醇中的總黃酮溶出量降低，可能是隨著乙醇濃度升高，其極性與黃酮類物質(zhì)的極性相差逐漸增大，從而導(dǎo)致溶液對黃酮類化合物溶解度降低，同時(shí)一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分等溶出增多，也不利于黃酮類化合物提取測定，進(jìn)而影響提取率［14］。因此乙醇濃度選用50%為宜。

2.2.3溫度對土大黃總黃酮提取率的影響

溫度對土大黃總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4　提取溫度對土大黃總黃酮提取率的影響Fig.4Effect of extraction temperature on the extraction rateof total flavonoids from Rumex madaio Makino

由圖4可知，當(dāng)溫度在常溫到40℃之間時(shí)，土大黃總黃酮的提取率隨溫度的升高呈上升趨勢，在40℃時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)超過40℃之后，土大黃總黃酮的提取率隨著溫度的升高而下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)溫度溫度升高到一定程度可能會破壞樣品中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成樣品中黃酮類物質(zhì)的損失。

2.2.4物料比對土大黃總黃酮提取率的影響

物料比對土大黃總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖5。

由圖5可知，在物料比為1∶10（g/mL）～1∶100（g/mL）之間時(shí)，土大黃總黃酮的提取率呈上升趨勢，當(dāng)物料比為1∶100（g/mL）時(shí)提取率達(dá)到最大。在物料比為1∶10（g/mL）～1∶40（g/mL）之間，提取率的升高趨勢非常明顯，在物料比為1∶40（g/mL）～1∶100（g/mL）之間，提取率的升高趨勢并不是很明顯，這可能是因?yàn)槭钱?dāng)提取溶劑量太大時(shí)，黃酮的溶出已基本達(dá)到平衡，再增加溶劑量，提取效果并不能明顯提高。

圖5　物料比對土大黃總黃酮提取率的影響Fig.5Effect of material-to-liqud ratio on the the extraction rateof total flavonoids from Rumex madaio Makino

2.3土大黃總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.3.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間、乙醇濃度、物料比3個因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，研究三因素不同組合對土大黃總黃酮提取率的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3　土大黃總黃酮提取的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3Response surface design and results of total flavonoids extraction from Rumex madaio Makino

利用Design-Expert8.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到土大黃總黃酮提取率對以上3個因素的二次多項(xiàng)回歸模型：土大黃總黃酮提取率Y（%）=-25.747 29+0.546 67X1+4.415 33X2-0.098 750X3+0.025 333X1X2-1.041 67×10-3X1X3-2.700 00×10-3X2X3-8.45370×10-3X12-0.060893X22+6.05729×10-3X32。對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可以看出，模型F值=7.89，p=0.003 9，說明該回歸模型達(dá)到極顯著（p＜0.01）；失擬項(xiàng)F值為3.51，p=0.052＞0.05，不顯著，說明該模型可以用于土大黃總黃酮提取優(yōu)化。同時(shí)各因素中一次項(xiàng)X2顯著，X3極顯著，二次項(xiàng)X1X2顯著，X22極顯著，該模型相對應(yīng)的回歸項(xiàng)P值0.003 9小于0.01，具有極度的顯著性，表明模型是有效的。

表4　響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析Table 4Results of the analysis of variance to the response surface quadratic model

2.3.2響應(yīng)曲面分析

根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析提取時(shí)間、乙醇濃度和物料比對土大黃總黃酮提取率的影響，響應(yīng)曲面如圖6所示。

圖6兩因素之間交互作用對土大黃總黃酮提取含量影響的響應(yīng)面圖Fig.6Response surface plots showing the effects of two factors interaction on the extraction rate of total flavonoids from Rumex madaio Makino

圖6直觀大反映了各因素對響應(yīng)值得影響，乙醇濃度和物料比的相互作用較顯著。

采用Design-Expert 8.05軟件的響應(yīng)優(yōu)化功能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到模型最優(yōu)解：由軟件可得土大黃總黃酮的最佳提取工藝為：提取時(shí)間110.42 min，物料比為1∶99.13（g/mL），乙醇濃度為53.89%，此時(shí)總黃酮提取率為17.3 mg/g。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

為了試驗(yàn)的可操作性，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果并考慮到實(shí)際操作的方便性，選用乙醇濃度為54%，提取時(shí)間110 min，物料比為1∶99（g/mL），在該實(shí)驗(yàn)條件下，取0.5 g土大黃進(jìn)行總黃酮的提取，試驗(yàn)重復(fù)3次，平均值為（16.7±0.03）mg/g。因此，利用響應(yīng)曲面分析方法對土大黃中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效減少工藝操作的盲目性，從而為進(jìn)一步的試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)，為土大黃的開發(fā)利用提供依據(jù)。

表5　試驗(yàn)驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化條件Table 5Conformation results of the optimized extraction conditions

4討論

本文通過單因素和響應(yīng)曲面法討論了土大黃總黃酮的提取工藝條件，利用Design-Expert軟件建立了土大黃總黃酮提取率與乙醇濃度、提取時(shí)間及物料比的二次多項(xiàng)回歸模型，檢驗(yàn)證明該模型合理可靠，能較好的預(yù)測土大黃總黃酮的提取率。優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為：土大黃總黃酮超聲提取的最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度54%，提取時(shí)間110min，物料比為1∶99（g/mL），土大黃總黃酮的提取率為（16.7±0.03）mg/g，與預(yù)測值17.3 mg/g非常接近，可達(dá)預(yù)測值的96.5%。說明該模型比較可靠。

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Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Rumex madaio Makino

WEI Ya-li，WU Jiao，DENG Yong-ping
（College of Chemistry and Environmental Science，Gui zhou Minzu University Key Laboratory of Development and Using Medicine Resources of Ethnic Minority Groups of Guizhou，Guiyang 550025，Guizhou，China）

To optimize the process of total flavonoids from Rumex madaio Makino.Basis on the results of the single factor experiments，Rumex madaio Makino was used as materials to optimize the extraction conditions of total flavonoids by using response surface methodology involved a three leves，three variable Box-Behnken design.The optimum conditions of total flavonoids extraction were 54%ethanol as extraction solvent，materialratio 1∶99（g/mL）and extraction time 110 min.Under the optimum conditions，the experimental total flavonoids content of Rumex madaio Makino tested was（16.7±0.03）mg/g，which was well matched with the predicted content.The optimum conditions can be used to extract the total flavonoids from Rumex madaio Makino.

Rumex madaio Makino；total flavonoids；response surface methodology；ultrasonic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.006

2015-04-28

貴州省科技廳與貴州民族大學(xué)聯(lián)合基金［黔科合J字LKM（2012）04］

衛(wèi)亞麗（1977—），女（漢），副教授，在讀博士，研究方向：藥物分析。