宋雪樊，李　楠，熊　偉，曾麗萍，鄔應龍

（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

響應面法優(yōu)化紫甘薯酒中花色苷含量

宋雪樊，李楠，熊偉，曾麗萍，鄔應龍*

（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

以紫甘薯酒為研究對象，在單因素實驗的基礎上，應用Box-Behnken方法進行三因素三水平實驗，以液料比、發(fā)酵初始pH和發(fā)酵溫度為影響因素，花色苷含量為響應值，進行響應面分析。確定最佳發(fā)酵工藝條件為液料比1.4∶1，pH4.15，發(fā)酵溫度24℃。在此條件下發(fā)酵，可得酒度為12.3°，花色苷含量為123.34mg/L的紫甘薯酒，花色苷含量與其理論值124.54mg/L接近，相對誤差小于0.96%。結果表明，采用響應面分析法對紫甘薯酒中的花色苷含量進行優(yōu)化合理可行，可為進一步研究提供依據。

花色苷，紫甘薯酒，響應面法，發(fā)酵

紫甘薯富含淀粉、水溶性膳食纖維、粗蛋白等營養(yǎng)元素，其最大的特點是富含花色苷色素［1］。紫甘薯花色苷主要組成成分是矢車菊素和芍藥素，花色苷含量的測定是紫甘薯酒一項重要的理化指標［2］。花色苷具有清除自由基［3］、抗腫瘤［4］、抑菌［5］、降血糖［6］、保護肝功能［7］等生理功能，紫甘薯用作釀酒原料，花色苷會保留在酒液中，得到具有較強抗氧化活性的保健酒［8］。

研究表明，花色苷的穩(wěn)定性受到pH、溫度、光照等影響［9-10］。本實驗在前期實驗的基礎上［11］，選擇打漿液料比、初始pH和發(fā)酵溫度作為單因素，花色苷含量為響應值，采用響應面法優(yōu)化紫甘薯酒的釀造工藝條件，用以提高酒中花色苷含量，為紫甘薯酒的進一步開發(fā)提供技術參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蒸紫甘薯漢源紫甘薯酒廠提供；酵母菌118四川農業(yè)大學功能性實驗室保藏；α-淀粉酶（酶活力＞3600U/g）、葡萄糖酶（酶活力＞105U/g）上海瑞豐生物有限公司；蔗糖太古煉糖廠有限公司；所用其他試劑均為分析純。

BT-124S型電子天平北京賽多斯儀器系統有限公司；JOUANBR4i型恒溫水浴鍋上海光地儀器設備有限公司；UV-2101型紫外可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；打漿機美的電器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1紫甘薯酒的制作流程蒸紫甘薯→打漿→α-淀粉酶酶解液化→葡萄糖酶酶解糖化→調節(jié)pH→調節(jié)糖度→殺菌→加釀酒酵母→發(fā)酵7d→過濾→紫甘薯酒［12］。

1.2.2紫甘薯酒發(fā)酵過程中花色苷含量和酒度的變化規(guī)律探討固定蒸紫甘薯打漿液料比為1.5∶1，酵母添加量1%，在α-淀粉酶添加量1%，液化溫度90℃條件下液化1h，葡萄糖酶添加量1%，糖化溫度65℃條件下糖化時間1h，調節(jié)初始pH4.0，調糖度至22°Bx，發(fā)酵溫度24℃，發(fā)酵7d［13-14］。每天跟蹤測量花色苷含量及酒度，探究它們在發(fā)酵過程中變化規(guī)律及在發(fā)酵結束時是否趨于穩(wěn)定。

1.2.3發(fā)酵條件的單因素實驗設計以發(fā)酵7d結束時酒中花色苷含量和酒度為指標，固定酵母添加量1%，在α-淀粉酶添加量1%，液化溫度90℃，液化時間1h，葡萄糖酶添加量1%，糖化溫度65℃，糖化時間1h，調糖度至22°Bx，發(fā)酵7d，分別考察液料比（1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1），初始pH（3、3.5、4、4.5、5），發(fā)酵溫度（16、20、24、28、32℃）對花色苷含量及酒度的影響。

1.2.4響應面的實驗設計在單因素實驗分析的基礎上，采用三因素三水平的Box-Behnken響應面設計方法［15-16］，選擇液料比，初始發(fā)酵pH和發(fā)酵溫度這3個因素進行響應面實驗，以花色苷含量為指標進行優(yōu)化，所有實驗均重復3次。實驗因素水平設計具體見表1。

表1　Box-Behnken響應面實驗設計因素水平Table 1　Coded values and corresponding real values of fermentation conditions tested in Box-Behnken experimental design

1.3指標檢測方法

1.3.1花色苷含量的檢測方法采用pH示差法［17-18］，取1mL發(fā)酵酒液加入pH為1.0、4.5的緩沖液24mL，靜置平衡60min后，以去離子水為空白，在520nm和700nm波長下測定吸光度。

A=（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5；

式中：A為由公式計算得的吸光度差值；Mw為矢車菊素葡萄糖苷的相對分子質量（449.2g/mol）；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數（26900L/mol·cm）；Df為稀釋因子（樣品總的稀釋倍數）；103為轉換系數，g轉換為mg。

1.3.2常規(guī)指標測定還原糖含量：GB/T 5009.7-2008，直接滴定法；pH：pH計直接測定；酒度：采用GB/T 5009.48-2003比重計法，以乙醇的體積分數計。

1.4數據的統計與分析

利用Origin 8.0軟件對單因素實驗的數據進行處理，并采用Design-Expert 7.0軟件對響應面實驗得到的數據進行線性回歸和方差分析。

2　結果與分析

2.1發(fā)酵過程中花色苷含量和酒度的變化規(guī)律

由圖1可知，在發(fā)酵初期酒精度上升明顯，臨近發(fā)酵結束時酒精度上升緩慢甚至不變。前期，由于花色苷的積累與酒精的浸漬作用，花色苷含量逐漸增大，在發(fā)酵第4d達到最大值；在發(fā)酵后期，隨著糖分漸漸減少，酵母菌的老化會在某種程度上吸附一部分色素［19］，致使花色苷含量減少并逐步穩(wěn)定。發(fā)酵結束時，酒度與花色苷含量均已趨于穩(wěn)定。因此，采用發(fā)酵第7d的花色苷含量為指標進行單因素及響應面實驗。

圖1　發(fā)酵過程中花色苷含量隨時間的變化Fig.1　Changes of the anthocyanin content of the time

2.2單因素實驗結果與分析

2.2.1液料比對花色苷含量及酒度的影響從圖2可知，花色苷含量與酒度在液料比為1.5∶1時均有最大值。當液料比為1∶1時，紫甘薯漿液成糊狀，不利于花色苷的析出；隨著加水量的增加，花色苷含量增加，在液料比為1.5∶1時達到最大值；后加水量繼續(xù)增加，紫甘薯漿液的濃度降低，花色苷含量隨之逐漸降低。因此，液料比選擇1.5∶1為宜。

圖2　液料比對花色苷含量的影響

2.2.2初始pH對花色苷含量及酒度的影響花色苷在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定，其穩(wěn)定性隨著堿度的增加而降低［9］；在pH為4.0時，花色苷的降解速度最慢［20］，具有最大的穩(wěn)定性。由圖3可知，花色苷含量隨著pH的升高而升高，到達pH為4.0后，花色苷含量隨著pH的增大而逐漸減小，這符合花色苷的理化性質。微酸性環(huán)境有利于酵母菌的生長和高級醇的形成［12］，酒度在pH為4.0時也有最大值。因此，發(fā)酵的初始pH以4.0為宜。

圖3　發(fā)酵初始pH對花色苷含量的影響Fig.3　Effect of extraction pH on anthocyanin content of purple potato wine

2.2.3發(fā)酵溫度對花色苷含量及酒度的影響從圖4可以看出，當發(fā)酵溫度為24℃時，酒中花色苷的含量和酒度都為最高。當溫度小于24℃時，隨著發(fā)酵溫度的增加，花色苷的含量和酒度都逐漸升高；當溫度大于24℃時，因花色苷的穩(wěn)定性隨著溫度的升高而降低［20］，所以花色苷含量開始降低，且隨著發(fā)酵溫度的增加，酵母菌發(fā)酵速度快衰老快，酒度也隨之下降。因此，發(fā)酵溫度選擇24℃最優(yōu)。

圖4　發(fā)酵溫度對花色苷含量的影響Fig.4　Effect of extraction temperature on anthocyanin content of purple potato wine

2.3響應面法發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1響應面實驗設計及結果根據表1的實驗編碼表進行實驗，表2是響應面實驗設計及結果。

采用Design Expert 7.0軟件對實驗數據進行分析，得到二次回歸方程如下：Y=122.39-7.13A+6.35B-5.48C+3.49AB-5.24AC+9.41BC-10.05A2-7.89B2-8.67C2。對表2實驗結果進行統計分析，方差結果如表3所示。

從表3可知，該回歸模型p＜0.0001，模型極顯著，R2=0.9858，R2Adj=0.9676，說明模型與實際值擬合程度較好，建模成功；一次項A、B、C，交互項BC、AC及二次項A2、B2、C2極顯著（p＜0.01），交互項AB顯著（0.01＜p＜0.05），可用該回歸模型對紫甘薯酒發(fā)酵工藝進行分析和預測。

表2　Box-Behnken實驗設計及結果Table 2　Design and results of Box-Behnken experiment

表3　回歸方程方差分析表Table 3　Analysis result of regression and variance

由自變量的F值可知各因素對花色苷含量的影響依次為：A＞B＞C，即液料比＞pH＞發(fā)酵溫度。說明液料比對花色苷含量影響最大，其次為初始pH，發(fā)酵溫度影響最小。

2.3.2交互作用分析經Design Expert軟件分析可得到3個影響因子之間的響應面分析圖，如圖5所示。響應曲面坡度相對平緩，表示響應值可以忍受處理條件的變異；響應曲面坡度非常陡峭，表示響應值對于處理條件的改變非常敏感［21］。

由圖5a可以看出，液料比與初始pH對花色苷含量的作用顯著。當初始pH在3.8～4.0之間，液料比介于1.5～1.7時，花色苷含量可獲得最大值。當pH小于3.8或大于4.0，液料比小于1.5或大于1.7時，花色苷含量較小。由圖5b可知液料比與發(fā)酵溫度作用極顯著，花色苷含量隨著液料比和發(fā)酵溫度這兩個編碼值得變化而快速變化。當液料比在1.4～1.6之間，發(fā)酵溫度在22～24℃之間時花色苷含量有最大值。液料比增加，含量有所增加，在高于1.4左右開始下降；溫度下降，含量增加，在23℃左右時趨于平緩。從圖5c可以看出，發(fā)酵溫度與發(fā)酵初始pH對花色苷含量有極顯著影響，兩者在花色苷含量的提高中起到關鍵作用。當初始pH介于3.9～4.1之間，發(fā)酵溫度在23～25℃時，花色苷含量可獲得最大值，這與花色苷在低溫酸性條件下較穩(wěn)定的理化性質相符。

圖5　兩因素交互作用對提取效果的影響響應面圖Fig.5　Response surface for the effect of two factors on extraction rate

2.3.3發(fā)酵工藝條件驗證在上述響應面分析的結果確定的最佳工藝條件下，即液料比1.36∶1，初始pH4.15，發(fā)酵溫度23.73℃，考慮到實際操作的便利，確定工藝條件為液料比1.4∶1，初始pH4.15，發(fā)酵溫度24℃，做3組平行實驗，得到花色苷含量的平均值為123.34mg/L，酒度為12.3°的紫甘薯酒?；ㄉ蘸繉嶋H值與理論值124.54mg/L相對誤差在±0.96%以內。

3　結論

紫甘薯酒中花色苷含量在隨著發(fā)酵時間的延長而呈現上升趨勢，在發(fā)酵第4d出現峰值，后緩慢下降，在發(fā)酵結束時趨于穩(wěn)定；酒度隨著發(fā)酵進行而逐漸上升，在發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定。發(fā)酵過程中各因素中對花色苷含量的影響順序為：液料比＞初始pH＞發(fā)酵溫度。響應面方法優(yōu)化確定酒中花色苷含量最高的發(fā)酵條件為：打漿液料比1.4∶1，初始pH4.15，發(fā)酵溫度24℃。在此條件下發(fā)酵，可得酒度為12.3°，花色苷含量為123.34mg/L的紫甘薯酒，花色苷含量與其理論值124.54mg/L相對誤差為±0.96%以內，說明利用本實驗建立的模型的優(yōu)化結果與實際情況吻合。在優(yōu)化的工藝條件下測得的花色苷含量達123.34mg/L，為紫甘薯酒的進一步研發(fā)提供重要參考依據。

［1］馮曉群.紫薯的保健功能及應用前景［J］.甘肅科技，2011，27（9）：160-162.

［2］吳發(fā)萍，郝萍萍，張楷正，等.紫甘薯與紫甘薯清酒中花青素的測定及穩(wěn)定性研究［J］.釀酒科技，2012（11）：108-110.

［3］Kano M，Takayanagi T，Harada K，et al.Ant-oxidative activity of anthocyanins from purple sweet potato，Ipomoea batatas cultivar Ayamurasaki［J］.Biosci Biotechnology Biochem，2005，69（5）：979-988.

［4］葉小利，李學剛，李坤培.紫色甘薯多糖對荷瘤小鼠抗腫瘤活性的影響［J］.西南師范大學學報：自然科學版，2005，30（2）：332-336.

［5］韓永斌，朱洪梅，顧振新，等.紫甘薯花色苷色素的抑菌作用研究［J］.微生物學通報，2008，35（6）：913-917.

［6］Matsui T，Ebuchi S，Kobayashi M，et al.Anti-hyperglycemic effect of diacylated anthocyanin derived from Ipomoea batatas cultivar Ayamurasaki can be achieved through the alphaglycosidase inhibitory action［J］.J Agric Food Chemistry，2002，50（25）：7244-7248.

［7］彭強，高彥祥，袁芳.紫甘薯及其花色苷的研究與開發(fā)進展［J］.食品科學，2010，31（23）：401-405.

［8］張明，王燕.紫甘薯中的功能性成分研究［J］.農產品加工，2010（5）：65-67.

［9］王晰銳.紫甘薯花色苷的結構鑒定以及穩(wěn)定性和功能性的研究［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學，2011.

［10］孫欣，趙林，厲玉婷，等.紫甘薯花色苷提取工藝研究［J］.中國食品添加劑，2013（1）：81-87.

［11］洪秀景.紫甘薯酒發(fā)酵工藝研究［D］.雅安：四川農業(yè)大學大學，2013.

［12］楚文靖，滕建文.紫甘薯酒發(fā)酵工藝條件研究［J］.資源開發(fā)與市場，2010，26（8）：686-688.

［13］楊大毅.紫甘薯發(fā)酵酒的生產工藝［J］.釀酒，2011，38（1）：77-78.

［14］楊雅利，闞建全，沈海亮，等.紫甘薯酒發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化［J］.食品科學，2012，33（3）：157-162.

［15］Vohra A，Satyanarayana T.Statistical optimization of themedium components by response surface methodology to enhance phytase production by pichia anomala［J］.Process Biochemistry，2002，37（9）：999-1004.

［16］Cui F J，Li Y，Xu HY，et al.Optimization of the medium composition for production of mycelial biomass and exo-polymer by Grifola frondosa GF9801 using response surface methodology［J］.Bioresource Technol，2006，97（10）：1209-1216.

［17］吳發(fā)萍，郝萍萍，張楷正，等.紫薯與紫薯清酒中花青素的測定及穩(wěn)定性研究［J］.釀酒科技，2012（11）：108-110.

［18］Lee J，Durst R W，Wrolstad R E.Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices，beverages，natural colorants，and wines by the pH differential method： Collaborative Study［J］.Journal of AOAC international，2005，88（5）：1269-1278.

［19］孫婧超.藍莓酒釀造過程中花色苷變化規(guī)律的研究［D］.煙臺：煙臺大學，2012.

［20］沈昌.優(yōu)良果酒酵母篩選與紫甘薯酒發(fā)酵工藝研究［D］.南京：南京農業(yè)大學，2007.

［21］劉振春，劉春萌，蘇彤.響應面優(yōu)化超聲波輔助提取大麥β-葡聚糖工藝［J］.食品科學，2013，34（14）：113-117.

［22］Shaileshkumar D S，Lele S S.Statistical optimization of media for dextran production by Leuconostoc sp.，isolated from fermented Idli batter［J］.Food Sci Biotechnol，2010，19（2）：471-478.

Optimization of anthocyanin content in purple potato wine by response surface analysis

SONG Xue-fan，LI Nan，XIONG Wei，ZENG Li-ping，WU Ying-long*
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

With purple potato wine as the research object，the methods of single factor and response surface was used to maximize the anthocyanin content in the wine.A regression equation was established to obtain the optimal fermentation parameters.The optimal fermentation conditions were as follows:proportion of water and material 1.4∶1，pH4.15，and fermentation temperature 24℃.Under this optimal fermentation conditions，the purple potato wine of 12.3°with a anthocyanin content of 123.34mg/L was obtained and the anthocyanin content was close to the predicted value 124.54mg/L with a relative error less than 0.96%.Accordingly，response surface could be a reasonable and feasible approach to maximize the anthocyanin content in purple potato wine，providing the basis for further researche.

anthocyanin；purple potato wine；response surface analysis；fermentation

TS262.7

B

1002-0306（2015）10-0297-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.054

2014－08－18

宋雪樊（1992-），女，本科在讀，研究方向：食品科學與工程。

鄔應龍（1963-），男，博士，教授，研究方向：功能性食品、糧油加工。

四川省科技廳2014年科技富民強縣項目。