金聲瑯，闕　斐，王　瑩，韋笑笑

（1.黃山學(xué)院旅游學(xué)院，安徽黃山245021；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江杭州310018；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

貢菊多糖對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

金聲瑯1，闕斐2，王瑩3，韋笑笑1

（1.黃山學(xué)院旅游學(xué)院，安徽黃山245021；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江杭州310018；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

目的：探討貢菊多糖對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的抗衰老的作用。方法：將小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組，D-半乳糖衰老模型對(duì)照組（80mg/kg·d bw），貢菊多糖低、中、高劑量組（50、100、150mg/kg·d bw），考察血清和肝中SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC和血清、肝及腦中的MDA等指標(biāo)。結(jié)果：貢菊多糖能拮抗D-半乳糖所致的小鼠衰老，使小鼠血清及肝組織SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC活性明顯回升，血清、肝臟和腦組織中MDA的水平下降。結(jié)論：貢菊多糖具有延緩衰老的作用。

貢菊，多糖，D-半乳糖，衰老，抗氧化

貢菊（Dendranthema morifolium），菊科植物，產(chǎn)于安徽省黃山市，是國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局批準(zhǔn)的實(shí)施原產(chǎn)地域保護(hù)的植物。貢菊多產(chǎn)于高海拔的山地，是一種富含多糖成分的野生植物［1］。作為一類生物大分子，多糖在動(dòng)植物和微生物細(xì)胞中較為多見，其生物活性已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)［2-6］。目前已有研究者開始了關(guān)于貢菊多糖提取分離、抗菌性以及免疫活性等方面的研究［7-8］，而關(guān)于貢菊多糖的抗衰老活性方面的研究尚未見報(bào)道。本研究從貢菊中提取多糖，利用D-半乳糖建立衰老模型，通過分析小鼠血清、肝臟及腦組織中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）活性的變化，探討貢菊多糖的抗衰老作用，以期為今后貢菊的精深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

貢菊產(chǎn)于黃山；清潔級(jí)雌性KM小鼠50只，體重（25±2）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)SCXK（滬2014-0005）；MDA、SOD、CAT、TAOC、GSH-Px測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所；D-半乳糖上海研域生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250北京中生瑞泰科技公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純，市售。

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀常州杰博森儀器有限公司；60-C3數(shù)顯恒溫水浴箱上海將來實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW100中草藥粉碎機(jī)上海譜振生物科技有限公司；751-GW可見光分光光度計(jì)上海精密儀器儀表有限公司；T10高速組織勻漿機(jī)廣州市金晶穗達(dá)科學(xué)儀器有限公司；H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)河南兄弟儀器設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多糖提取和純化將貢菊放置干燥箱中干燥，80℃，然后在粉碎機(jī)中粉碎，過100目篩。采用熱水超聲提?。?0℃，料液比1∶15g/mL，1h，3次），過濾后進(jìn)行濃縮，選擇4倍體積無水乙醇進(jìn)行醇沉，過夜，第2d離心干燥（3000r/min，8min；60℃，真空烘干）即得貢菊粗多糖制品。選用石油醚多次沖洗貢菊粗多糖制品，溶解脫色后采用Sevage法除蛋白，將上層液濃縮，繼續(xù)選用4倍體積無水乙醇進(jìn)行醇沉，過夜，第2d離心干燥（3000r/min，8min；60℃，真空烘干）即得貢菊精多糖制品［6］。應(yīng)用硫酸－苯酚法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)的貢菊多糖的純度為86.24%。用滅菌生理鹽水將純度為86.24%的貢菊多糖制成濃度分別為50、100、150mg/mL的溶液，過濾除菌后在5℃環(huán)境下備用。

1.2.2動(dòng)物分組及處理參照《抗氧化功能評(píng)價(jià)方法》［9］（國家食品藥品監(jiān)督管理總局，2012）。隨機(jī)將小鼠分成5組，每組10只，設(shè)為模型對(duì)照組、空白對(duì)照組、高多糖組、中多糖組和低多糖組。采用皮下注射的方式，除空白對(duì)照組以外，其他各組每日注射D-半乳糖80mg/kg·d bw；將空白對(duì)照組的小鼠每日注射相同劑量（80mg/kg·d bw）生理鹽水；將貢菊多糖分別以50、100、150mg/kg·d bw的量灌胃，空白對(duì)照組及模型對(duì)照組組則灌胃等容積生理鹽水。

1.2.3檢測(cè)樣品的制備實(shí)驗(yàn)第8周后，各組小鼠均禁食1d，并用乙醚進(jìn)行麻醉。從小鼠眼眶采血，用檸檬酸鈉抗凝，5℃，3000r/min離心15min分離血清，上清液-20℃保存以待檢測(cè)。取小鼠的腦和肝臟以冰生理鹽水洗去浮血，并用濾紙將水分吸干，稱濕重，再加入生理鹽水，放入研磨器內(nèi)進(jìn)行勻漿處理，分別制成10%腦勻漿和10%肝勻漿，5℃，2000r/min，離心10min，取上清液在-20℃下保存以待下一步檢測(cè)［10］。

1.2.4生化指標(biāo)測(cè)定上述檢測(cè)樣品的MDA含量以及T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性均按照試劑盒規(guī)定的方法，分別進(jìn)行測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，用隨即設(shè)計(jì)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1小鼠肝組織和血清中SOD活性的測(cè)定

由表1可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對(duì)照組小鼠肝組織和血清SOD活性均顯著低于空白對(duì)照組，且差異極顯著（p＜0.01），說明此次造模是成功的。從小鼠肝組織SOD活性對(duì)比可知，與模型對(duì)照組比較，中多糖組、高多糖組SOD活性顯著提升，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05或p＜0.01），但低多糖組對(duì)肝組織SOD活性無明顯影響。從小鼠血清SOD活性對(duì)比可知，與模型對(duì)照組比較，各劑量的貢菊多糖組SOD活性均顯著提高，高多糖組和中多糖組差異均為極顯著（p＜0.01），低多糖組差異顯著（p＜0.05），并且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

表1　小鼠肝組織和血清SOD活性的測(cè)定結(jié)果Table 1　The content of SOD in liver and serum in aging mice

2.2小鼠血清、腦和肝組織中MDA含量的測(cè)定

由表2可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對(duì)照組小鼠肝組織和血清MDA含量均顯著高于空白對(duì)照組，且差異極顯著（p＜0.01），說明此次造模是成功的。從小鼠血清、腦和肝組織MDA含量對(duì)比可知，貢菊多糖能拮抗D-半乳糖的作用，與模型對(duì)照組比較，各劑量多糖組MDA含量顯著下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），其中小鼠血清中高多糖組中MDA含量差異極顯著（p＜0.01），并且各組之間呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

表2　小鼠血清、腦、肝組織MDA含量的測(cè)定結(jié)果Table 2　The content of MDA in serum，brain and liver in aging mice

2.3小鼠肝組織和血清中CAT活性的測(cè)定

由表3可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對(duì)照組中小鼠血清CAT活性均顯著低于空白對(duì)照組，且差異顯著（p＜0.05），小鼠肝組織CAT活性顯著低于空白對(duì)照組，且差異極顯著（p＜0.01），說明此次造模是成功的。從小鼠肝組織CAT活性對(duì)比可知，與模型對(duì)照組比較，中多糖組、高多糖組SOD活性顯著提升，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05或p＜0.01），但低多糖組對(duì)肝組織CAT活性無明顯影響。從小鼠血清CAT活性對(duì)比可知，與模型對(duì)照組比較，各劑量的貢菊多糖組CAT活性均顯著提高，高多糖組差異為極顯著（p＜0.01），低多糖和中多糖組差異均為較為顯著（p＜0.05），并且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

表3　小鼠肝組織和血清CAT活性的測(cè)定結(jié)果Table 3　The activities of CAT in liver and serum in aging mice

2.4小鼠肝組織和血清中T-AOC活性的測(cè)定

由表4可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對(duì)照組中小鼠肝組織T-AOC活性低于空白對(duì)照組，且差異極顯著（p＜0.01），鼠血清T-AOC活性低于空白對(duì)照組，且差異顯著（p＜0.05），說明此次造模是成功的。從小鼠肝組織T-AOC活性對(duì)比可知，與模型對(duì)照組比較，各劑量多糖組SOD活性顯著提升，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），并且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。從小鼠血清T-AOC活性對(duì)比可知，與模型對(duì)照組比較，各劑量的貢菊多糖組T-AOC活性均顯著提高（p＜0.05），也呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

表4　小鼠肝組織和血清T-AOC活性的測(cè)定結(jié)果Table 4　The activities of T-AOC in liver and serum in aging mice

2.5小鼠肝組織和血清中GSH-Px活性的測(cè)定

表5　小鼠肝組織和血清GSH-Px活性的測(cè)定結(jié)果Table 5　The activities of GSH-Px in liver and serum in aging mice

由表5可知，小鼠給予D-半乳糖后，模型對(duì)照組小鼠肝組織和血清GSH-Px活性均顯著低于空白對(duì)照組，且差異極顯著（p＜0.01），說明此次造模是成功的。從小鼠肝組織GSH-Px活性對(duì)比可知，與模型對(duì)照組比較，各劑量的貢菊多糖組GSH-Px活性顯著提升，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05或p＜0.01）。從小鼠血清GSH-Px活性對(duì)比可知，與模型對(duì)照組比較，中多糖組和高多糖組GSH-Px活性均顯著提高（p＜0.05），但低多糖組對(duì)小鼠血清GSH-Px活性無顯著影響。

3　結(jié)論與討論

D-半乳糖模型作為衰老模型，目前被國內(nèi)外學(xué)者普遍用在關(guān)于衰老機(jī)理方面的實(shí)驗(yàn)和分析［10-12］。我國科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)了注射D-半乳糖可誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物發(fā)生與自然衰老相似的變化［13］。小鼠在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)被注射大劑量D-半乳糖后，機(jī)體內(nèi)D-半乳糖濃度增高，D-半乳糖在小鼠體內(nèi)醛糖還原酶的作用下被還原成半乳糖醇，然后在羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的作用下，又被氧化成半乳糖醛和過氧化氫。在二價(jià)鐵離子的影響之下，過氧化氫跟小鼠體內(nèi)超氧陰離子進(jìn)一步反應(yīng)生成了活性更強(qiáng)的羥自由基。小鼠體內(nèi)過量的過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子等自由基會(huì)使體內(nèi)的SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX等抗氧化物水平降低，從而表現(xiàn)出衰老［14-16］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，貢菊多糖50、100、150mg/kg·d bw劑量組均可使D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠血清和肝組織SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px活性升高和血清、肝臟和腦組織的脂質(zhì)過氧化物MDA水平下降，從而實(shí)現(xiàn)其在小鼠體內(nèi)的抗氧化作用，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。這可能是因?yàn)樨暰斩嗵且种屏俗杂苫漠a(chǎn)生，通過降解超氧陰離子和過氧化氫為無毒性的水和氧，從而增加了體內(nèi)抗氧化酶的活性，也減輕了自由基對(duì)小鼠體內(nèi)組織的損傷作用。本實(shí)驗(yàn)為深入探討貢菊多糖抗衰老機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步綜合利用和深加工貢菊具有一定的參考意義。

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Anti-aging effect of total polysaccharide from Dendranthema morifolium on aging mouse induced by D-galactose

JIN Sheng-lang1，QUE Fei2，WANG Ying3，WEI Xiao-xiao1
（1.Tourism College，Huangshan University，Huangshan 245021，China；2.Department of Applied Engineering，Zhejiang Economic and Trade Polytechnic，Hangzhou 310018，China；3.School of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

Objective:To study the anti-ageing effects of polysaccharide from Dendranthema morifolium on aging mice induced by D-galactose and explore the underlying mechanisms.Methods:Healthy female mice were randomly divided into 5 groups:control group，aging model group（80mg/kg·d bw），and low-，medium-and high-dose polysaccharide groups（50，100，150mg/kg·d bw）.The mice were then sacrificed，and the serum，liver and brain tissue were collected.The concentration of malondialdehyde（MDA）in the blood，liver and brain tissue and the activities of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），Catalase（CAT），total antioxidant activity（T-AOC）in the serum and liver were then measured.The polysaccharide from Dendranthema morifolium had antagonism effects on the mice aging induced by D-galactose，had evident rebound of activities of SOD，GSH-Px，CAT and T-AOC at all three doses in the blood and liver，and had a decrease of MDA in the serum，liver and brain tissue.Conclusion:The polysaccharide from Dendranthema morifolium had anti-aging effects on aging model mice.

Dendranthema morifolium；polysaccharide；D-galactose；aging；antioxidant

TS255.1

A

1002-0306（2015）10-0349-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.065

2014－08－14

金聲瑯（1980-），男，博士，副教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品精深加工方面的研究。

2014年度安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2014A243）；2014年度安徽省哲學(xué)社會(huì)科學(xué)規(guī)劃項(xiàng)目（AHSKQ2014D59）。