陳春琳劉祥王成祥張曉娟俱雄張濤吳三橋

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723001；2. 安徽省肥西縣特殊教育學(xué)校，合肥 231200）

銅綠假單胞菌外膜蛋白I的原核表達(dá)、純化及免疫保護(hù)作用研究

陳春琳1劉祥1王成祥2張曉娟1俱雄1張濤1吳三橋1

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723001；2. 安徽省肥西縣特殊教育學(xué)校，合肥 231200）

銅綠假單胞菌外膜蛋白OprI具有較強(qiáng)的免疫原性，在疫苗上具有開發(fā)前景。利用分子方法獲得OprI蛋白的表達(dá)菌株。Western blotting 驗(yàn)證表明抗體能與OprI蛋白特異性結(jié)合。SDS-PAGE電泳切膠純化獲得OprI蛋白。將OprI蛋白免疫小鼠并攻毒銅綠假單胞菌，發(fā)現(xiàn)OprI蛋白激活的特異性免疫對(duì)小鼠銅綠假單胞菌感染的保護(hù)率達(dá)到57.14%，與對(duì)照組相比較達(dá)到顯著性。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得OprI菌株最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：加IPTG菌夜OD600值0.8，加IPTG終濃度 0.3 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間 8 h，誘導(dǎo)溫度 28℃；菌株最佳培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速230 r/min，葡萄糖濃度0%，裝液量50 mL。

銅綠假單胞菌；OprI蛋白；免疫保護(hù)；正交試驗(yàn)；誘導(dǎo)條件

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），又名綠膿桿菌，是醫(yī)院感染最常見的條件致病菌之一，常分布于人與動(dòng)物皮膚和腸道上；在機(jī)體燒傷、免疫力下降、重大疾病創(chuàng)傷后，容易誘發(fā)感染，甚至導(dǎo)致感染性休克［1，2］。由于抗生素的大量使用，銅綠假單胞菌出現(xiàn)不同程度的耐藥性，增加了治療的難度，人們一直在尋找一種不產(chǎn)生耐藥性的防治藥物［3，4］。

銅綠假單胞菌主要的免疫保護(hù)抗原有OprI，OprF和OprH。OprI為銅綠假單胞菌主要的外膜蛋白之一，可激活機(jī)體非特異性免疫，并與抗原遞呈細(xì)胞（Antigen-presenting cells，APC）相互作用，提高與其融合的蛋白的保護(hù)率［5，6］。研究發(fā)現(xiàn)OprI免疫小鼠產(chǎn)生的抗體可有效抵抗銅綠假單胞菌的感染［7］，其激發(fā)的非特異性免疫對(duì)豬瘟（Classical swine fever，CSF）也有免疫保護(hù)作用［8］；人體免疫試驗(yàn)證實(shí)OprI可顯著增強(qiáng)機(jī)體的特異性抗體水平［9］。可見OprI在疫苗上具有很好的應(yīng)用前景［5，10］。

本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆方法獲得銅綠假單胞菌OprI表達(dá)菌株；純化OprI蛋白，免疫小鼠，攻毒銅綠假單胞菌研究其免疫保護(hù)作用；通過正交試驗(yàn)確定OprI最佳的表達(dá)條件與培養(yǎng)條件，旨為OprI工業(yè)發(fā)酵、蛋白功能與疫苗開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

P. aeruginosa PAO1，E. coli DH5α，E. coli BL21，pET-32a質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室保存。昆明鼠購(gòu)于西安交通大學(xué)動(dòng)物中心。引物合成、基因序列測(cè)定均由西安沃爾森生物技術(shù)有限公司完成。Protein Marker，NDA Marker，Taq酶，限制性內(nèi)切酶，T4-DNA 連接酶，均為TaKaRa 公司產(chǎn)品；IPTG，蛋白胨，酵母提取物均購(gòu)于美國(guó)MP公司；質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒與膠回收試劑盒為上海生物工程公司；小鼠抗OprI血清本實(shí)驗(yàn)室制備；山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI公布的P. aeruginosa PAO1基因序列，設(shè)計(jì)oprI基因引物：Sense Primer：5'- ACAGGATCCATGAACAACGTTCTGAAA -3'；Anti-sense Primer：5'- ACTCTCGAGTTACTTGCGGCTGGCTTT -3'，下劃線分別為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH I和Xho I。PCR反應(yīng)體系（50 mL）：PCR反應(yīng)緩沖液5 mL，模板DNA 3 mL，10 mmol/L dNTP 2 mL，25 mmol/L引 物 各1 mL，Taq 酶0.5 mL，補(bǔ)水至50 mL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，30個(gè)PCR循環(huán)（94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸90 s），72℃充分延伸10 min，最后4℃保溫。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段的大小，膠回收試劑盒回收DNA片段。pET-23a質(zhì)粒載體與PCR產(chǎn)物均采用BamH I和Xho I雙酶切后，T4-連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序鑒定，檢驗(yàn)正確后轉(zhuǎn)化E. coli BL21表達(dá)菌株，進(jìn)行OprI蛋白表達(dá)測(cè)定。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)與蛋白純化 取經(jīng)鑒定的重組菌過夜培養(yǎng)，以1∶100倍轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，待OD600約0.6時(shí)，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，加入上樣緩沖液，用SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)OprI蛋白表達(dá)情況；并利用SDS-PAGE電泳切膠的方法對(duì)OprI進(jìn)行蛋白純化。

1.2.3 重組蛋白的Western blotting檢測(cè) 采用Western blotting方法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況［11］，簡(jiǎn)要步驟為：將OprI表達(dá)菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)（對(duì)照為未誘導(dǎo)），SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)NC膜，5%牛奶封閉后，加入小鼠OprI多克隆抗血清，洗滌后，二抗孵育，最后DAB顯色，確認(rèn)OprI的表達(dá)。

1.2.4 重組蛋白的小鼠免疫 選用4-5周齡的昆明鼠，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各15只。實(shí)驗(yàn)組免疫純化的OprI蛋白，對(duì)照組免疫從pET32質(zhì)粒菌株中誘導(dǎo)、表達(dá)與純化的免疫標(biāo)簽蛋白。小鼠采用腹腔免疫的方式，實(shí)驗(yàn)組每只免疫OprI蛋白50 μg/每次，對(duì)照組免疫PBS；第1次采用弗氏完全佐劑，免疫10 d后進(jìn)行第2次免疫；第2次免疫7 d后進(jìn)行銅綠假單胞菌攻毒實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 免疫小鼠的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行免疫動(dòng)物的攻毒實(shí)驗(yàn)。末次免疫7 d 后，以107CFU單位銅綠假單胞菌注入小鼠腹腔進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒后密切觀察實(shí)驗(yàn)小鼠的活動(dòng)、攝食及精神狀態(tài)15 d。依據(jù)公式：保護(hù)率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組死亡率/對(duì)照組死亡率）×100%，計(jì)算OprI的免疫保護(hù)作用；利用SPSS軟件計(jì)算顯著性。

1.2.6 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 為確定OprI蛋白最佳表達(dá)條件，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，分為菌最適培養(yǎng)條件與蛋白最適誘導(dǎo)表達(dá)條件2部分，因子與水平分別見表1和表2［12］。

菌株培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)主要步驟為：取單菌落入LB 培養(yǎng)液中，37℃，培養(yǎng)16 h，以1∶100轉(zhuǎn)接菌體入正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵?50 mL錐形瓶中，按表1的條件培養(yǎng)，記錄所得菌液的OD600值。依據(jù)OD值進(jìn)行數(shù)據(jù)的極差分析，使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析。

表1 OprI表達(dá)菌株培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)因子與水平

表2 OprI蛋白誘導(dǎo)條件正交試驗(yàn)的因子與水平

菌株誘導(dǎo)表達(dá)條件正交實(shí)驗(yàn)主要步驟為：根據(jù)菌最適培養(yǎng)條件獲得的結(jié)果，快速培養(yǎng)菌體至表2要求的不同OD600值，再按照正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臈l件加入不同濃度的IPTG，誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間，吸取1 mL菌液離心，沉淀加入300 mL的2×SDS 上樣緩沖液，沸水中煮樣5 min，上樣10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳。使用軟件Phoretix 1D對(duì)電泳得到的OprI蛋白表達(dá)圖譜進(jìn)行光密度分析；使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以銅綠假單胞菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增oprI基因，獲得252 bp左右的基因片段，與預(yù)期大小一致（圖1-A）。將PCR產(chǎn)物與pET-32a質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，T4-DNA連接酶作用后，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α菌株，提取質(zhì)粒，用BamH I和Xho I雙酶切獲得252 bp片段，與目的基因大小一致（圖1-B）；序列測(cè)序顯示與NCBI公布的基因序列相同，證明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

圖1 銅綠假單胞菌oprI基因重組質(zhì)粒構(gòu)建

2.2 重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)與蛋白純化

為驗(yàn)證重組蛋白表達(dá)情況，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳獲得30 kD的蛋白條帶，包含OprI蛋白9.24 kD大小，以及pET-32a質(zhì)粒自帶的20.4 kD 融合蛋白標(biāo)簽，重組蛋白表達(dá)情況與預(yù)期大小一致；并利用SDS-PAGE電泳切膠的方法獲得純化的OprI蛋白，如圖2所示。

圖2 OprI蛋白表達(dá)與純化

2.3 重組蛋白的Western blotting檢測(cè)

利用蛋白Western blotting顯色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)重組菌株獲得的蛋白有條帶顯示，而對(duì)照組未出現(xiàn)，如圖3所示。證明重組的OprI蛋白可與抗體結(jié)合，OprI表達(dá)正確。

2.4 重組蛋白的免疫保護(hù)作用

小鼠通過免疫OprI蛋白，攻毒銅綠假單胞菌發(fā)現(xiàn)24 h內(nèi)均出現(xiàn)較重的中毒癥狀，毛蓬松皺褶、攝食減少、精神萎靡嗜睡，并出現(xiàn)大量死亡，在4 d后死亡得到控制，小鼠能夠逐漸恢復(fù)，一旦恢復(fù)可長(zhǎng)期存活。實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組小鼠具體的存活與死亡情況及時(shí)間，如表3 所示。

2.5 OprI菌株誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定

2.5.1 OprI菌株最適培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn) 根據(jù)表1 設(shè)計(jì)的因素、水平，按照正交試驗(yàn) L9（34）模式設(shè)計(jì)各個(gè)試驗(yàn)組合，進(jìn)行3次重復(fù)，獲得OprI表達(dá)菌株菌液濃度的OD600數(shù)值（表4）。將數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析（表5）顯示，組合A1B3C1為菌株最適培養(yǎng)條件，即培養(yǎng)基中不需要加入葡萄糖，轉(zhuǎn)速230 r/min，裝液量50 mL；方差分析結(jié)果（表6）顯示葡萄糖濃度、轉(zhuǎn)速及裝液量均達(dá)到顯著性。因而，實(shí)際發(fā)酵工程菌時(shí)，不需要額外補(bǔ)充葡萄糖，可適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)前菌體的快速培養(yǎng)。

圖3 OprI表達(dá)菌株Western blotting驗(yàn)證

表3 昆明鼠主動(dòng)免疫OprI及攻毒銅綠假單胞菌

表4 OprI表達(dá)菌株培養(yǎng)條件試驗(yàn)的菌液濃度

表5 OprI表達(dá)菌株培養(yǎng)條件的極差分析

表6 OprI表達(dá)菌株培養(yǎng)條件的方差分析

2.5.2 OprI菌株誘導(dǎo)表達(dá)條件的正交實(shí)驗(yàn) 為檢測(cè)OprI的最佳表達(dá)情況，進(jìn)行3次重復(fù)，通過SDSPAGE電泳，獲得OprI蛋白表達(dá)圖譜（圖4）；然后通過軟件Phoretix 1D分析圖譜中的蛋白條帶，獲得蛋白的光密度值（表7）。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析獲得最佳OprI蛋白表達(dá)組合為E2F2G2H1（加IPTG菌液OD600值：0.8；IPTG終濃度：0.3 mmol/L；誘導(dǎo)時(shí)間：8 h；誘導(dǎo)溫度：28℃）（表8）。方差分析結(jié)果顯示，加IPTG時(shí)菌液濃度、加IPTG終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)溫度，這4個(gè)因素對(duì)于蛋白表達(dá)的影響均達(dá)到顯著性（表9）?？梢奜prI工程菌誘導(dǎo)時(shí)應(yīng)采用：加入低濃度IPTG、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期誘導(dǎo)、低溫誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)時(shí)間不易過長(zhǎng)。

2.5.3 最優(yōu)化條件OprI表達(dá)檢測(cè) 根據(jù)最優(yōu)化的OprI表達(dá)條件（培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基中不加入葡萄糖，轉(zhuǎn)速230 r/min，裝液量50 mL；誘導(dǎo)條件：加IPTG菌液OD600值 0.8，IPTG終濃度 0.3 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間 8 h，誘導(dǎo)溫度 28℃），進(jìn)行OprI表達(dá)菌株的蛋白誘導(dǎo)，獲得的蛋白條帶如圖5所示。將最優(yōu)化誘導(dǎo)條件結(jié)果使用軟件Phoretix 1D分析光密度，并與之前實(shí)驗(yàn)（圖4）獲得的光密度相比較，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)化條件獲得的光密度高于其它的試驗(yàn)條件（表10）。證明最優(yōu)化條件下OprI蛋白得到很好的表達(dá)。

圖4 OprI表達(dá)菌株IPTG誘導(dǎo)的正交試驗(yàn)

表7 Phoretix 1D軟件分析OprI表達(dá)圖譜

表8 OprI蛋白表達(dá)圖數(shù)據(jù)的極差分析

表9 OprI蛋白表達(dá)圖數(shù)據(jù)的方差分析

圖5 最優(yōu)化條件下OprI蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

表10 OprI最優(yōu)化條件與其它誘導(dǎo)條件比較

3 討論

由于抗生素廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌快速產(chǎn)生耐藥性，增加致病菌的治療難度。基因工程疫苗以其無(wú)耐藥性特點(diǎn)，受到人們高度重視［13，14］。因而，利用基因工程獲得多肽類物質(zhì)，用于后續(xù)的疫苗開發(fā)與科學(xué)研究尤為重要［15］。

OprI是銅綠假單胞菌主要外膜蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性［5］，本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆獲得OprI表達(dá)菌株，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠的免疫保護(hù)率達(dá)到顯著性的57.14%，為開發(fā)OprI蛋白免疫制劑奠定理論基礎(chǔ)。

外源基因表達(dá)的影響因素很多，但誘導(dǎo)條件的最佳組合往往是唯一的［12］。本實(shí)驗(yàn)利用正交實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行銅綠假單胞菌OprI蛋白的表達(dá)研究，結(jié)果表明，在未誘導(dǎo)時(shí)，OprI表達(dá)菌株最適培養(yǎng)條件為：葡萄糖濃度0%，轉(zhuǎn)速230 r/min，裝液量50 mL；菌體加入IPTG誘導(dǎo)后，最佳蛋白表達(dá)條件為：加IPTG時(shí)菌液OD600值：0.8；IPTG終濃度：0.3 mmol/L；誘導(dǎo)時(shí)間：8 h；誘導(dǎo)溫度：28℃。實(shí)驗(yàn)證實(shí)提高培養(yǎng)基轉(zhuǎn)速增加營(yíng)養(yǎng)與氧氣的供給，利于菌體的生長(zhǎng)［16］，這與本研究發(fā)現(xiàn)的提高轉(zhuǎn)速結(jié)果一致。低溫誘導(dǎo)利于蛋白表達(dá)［12］，與本研究結(jié)果一致，生產(chǎn)中應(yīng)采用低溫誘導(dǎo)。IPTG具有毒性，不利于菌體蛋白表達(dá)［17］，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)濟(jì)角度考慮，可采用低濃度IPTG誘導(dǎo)。合適的誘導(dǎo)時(shí)間利于蛋白的表達(dá)［18］，在工程菌發(fā)酵上應(yīng)采用合適的誘導(dǎo)時(shí)間。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最優(yōu)化條件下OprI的表達(dá)量高于其它的實(shí)驗(yàn)組合，進(jìn)一步證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性，為實(shí)際生產(chǎn)提供依據(jù)。

因而，OprI工程菌蛋白發(fā)酵可按兩步進(jìn)行：（1）IPTG誘導(dǎo)前，提高培養(yǎng)基轉(zhuǎn)速加快菌體生長(zhǎng)到合適的誘導(dǎo)濃度；（2）IPTG誘導(dǎo)后，選擇菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期誘導(dǎo)、低溫、低濃度IPTG，以及誘導(dǎo)時(shí)間不易過長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)獲得OprI蛋白的表達(dá)菌株；Westernblotting 證實(shí)表達(dá)的OprI蛋白能與抗體特異性結(jié)合；將純化的OprI蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其激活的特異性免疫對(duì)小鼠銅綠假單胞菌感染的保護(hù)率達(dá)到顯著性的57.14%。正交試驗(yàn)獲得OprI菌株最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：加IPTG菌夜OD600值0.8，加IPTG終濃度 0.3 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間 8 h，誘導(dǎo)溫度 28℃；菌株最佳培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速230 r/min，葡萄糖濃度0%，裝液量50 mL。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression， Purification and Immunoprotection Potential of Pseudomonas aeruginosa Outer Membrane Lipoprotein I

Chen Chunlin1Liu Xiang1Wang Chengxiang2Zhang Xiaojuan1Ju Xiong1Zhang Tao1Wu Sanqiao1
（1. College of Biological Sciences and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001；2. Special Education School in Feixi County of Anhui Province，Hefei 231200）

Outer membrane lipoprotein I（OprI）in Pseudomonas aeruginosa has solid immunogenicity and holds prospects in the development of vaccine. The OprI-expressing strain was obtained by molecular cloning. Western blotting verified that antibody specifically combined with OprI. The purified OprI was gained by the SDS-PAGE gel slices. Immunizing mice with OprI， specific immunity activated by OprI protected 57. 14% mice from P. aeruginosa infection， which reached significant protection compared with the control group. The orthogonal experiment was employed to obtain the optimal inducing expressing condition of OprI strain：strain OD600value，IPTG final concentration，inducing time and temperature，were 0. 8，0. 3 mmol/L，8 h，and 28℃，respectively；the optimal culture condition was that the rotation rate，glucose concentration，and medium volume were 230 r/min，0% and 50 mL，respectively. This work laid the groundwork for the researches on industrial fermentation，protein function and vaccine development of OprI.

Pseudomonas aeruginosa；OprI protein；immunoprotection；orthogonal experiment；induction conditions

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.032

2014-11-18

陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃（14JK1152），陜西理工學(xué)院人才啟動(dòng)項(xiàng)目（SLGQD13-15）

陳春琳，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：chen2362505579@163.com

劉祥，男，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)與免疫學(xué)；E-mail：liuxiang888525@163.com