趙煜++++++曾杰

[摘要] 目的 檢測胃癌組織中核因子κB（nuclear factor kappa binding，NF-κB）的表達(dá)情況，探索NF-κB與臨床病理的相關(guān)性。 方法 選取2004年1月～2009年1月四川省人民醫(yī)院病理科收入的50例胃癌患者和同期的50例非腫瘤患者，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測胃癌患者病灶組織及癌旁組織、非腫瘤患者胃黏膜組織的NF-κB，比較分析不同臨床病例特征者的NF-κB的表達(dá)情況，并比較不同的NF-κB表達(dá)情況者的5年生存率。 結(jié)果 胃癌患者胃癌組織、癌旁組織和非腫瘤患者胃黏膜組織中NF-κB蛋白陽性表達(dá)率分別為76.0%（38/50）、4.0%（2/50）和16.0%（8/50），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.404，43.511，6.655，均P < 0.05）；胃癌組織中NF-κB的表達(dá)與脈管侵犯、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、當(dāng)腫瘤直徑<5 cm時(shí)，與腫瘤大小呈正相關(guān)（r=0.318，0.243，0.315，0.350；P=0.002， 0.002，0.035，0.001），與分化程度無相關(guān)性（r=0.119，P=0.242），非腫瘤患者NF-κB低表達(dá)者的5年生存率顯著高于高表達(dá)者（P < 0.05）。 結(jié)論 NF-κB陽性表達(dá)與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測NF-κB的表達(dá)對(duì)胃癌病情監(jiān)測及轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后估計(jì)等方面有重要參考價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 胃癌；NF-κB；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）10（b）-0070-04

Study on the correlation between the expression of NF-κB in gastric cancer and clinical pathology

ZHAO Yu ZENG Jie

Department of Emergency Surgery， Sichuan Provincial People's Hospital， Sichuan Province， Chendu 610072， China

[Abstract] Objective To detect the expression of nuclear factor κB in gastric cancer tissue （NF-κB） and explore its correlation with clinicopathologic. Methods From January 2004 to January 2009， 50 patients with gastric cancer and 50 cases without tumor in Sichuan Provincial People's Hospital were selected， then the expression of NF-κB in lesion tissue and adjacent tissues of patients with lung cancer and gastric mucosa tissue of non-tumer patients were detected with immunohistochemistry （SP method）. The expression of NF-κB with different clinicopathological features were compared，and the 5-year survival rates were observed. Results The positive expression rates of NF-κB in lesion tissue and adjacent tissues of patients with lung cancer and in gastric mucosa tissue of non-tumer patients were respectively 76.0%（38/50），4.0%（2/50） and 16.0%（8/50），the differences were statistically significant（χ2=20.404， 43.511， 6.655，P < 0.05），In lesion tissue， the expression of NF-κB was positive correlation with vascular invasion， degree of infiltration， lymph node metastasis and tumor size when the size was 5 cm below （r = 0.318， 0.243， 0.315， 0.350； P = 0.002， 0.002， 0.035， 0.001），but no correlation with the differentiated degree（r=0.119， P=0.242）. 5-year survival rates of patients with low NF-κB expression was significantly higher than that with high NF-κB expression （P < 0.05）. Conclusion NF-κB expression is closely related with the invasion and metastasis in gastric cancer， and the detection of it is very important to monitor the condition and metastatic potential， and evaluate prognosis of gastric cancer.endprint

[Key words] Gastric cancer； NF-κB； Immunohistochemistry

我國胃癌的新發(fā)病例數(shù)和胃癌死亡率居惡性腫瘤之首，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未完全明確。大約65%胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。故侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制成為胃癌研究的重要方向，研究顯示，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[2]。NF-κB是一種細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子，活化的NF-κB能靶向調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[3]。NF-κB與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但與胃癌的關(guān)系研究不多。我們通過免疫組化法分析NF-κB在胃癌組織中的表達(dá)，探討其作為判斷胃癌預(yù)后指標(biāo)的臨床意義，現(xiàn)將材料歸納如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2004年1月～2009年1月四川省人民醫(yī)院病理科收治的50例胃癌根治標(biāo)本，其中男38例，女12例，年齡30～78歲；高、中分化23例，低、未分化27例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例；腫瘤直徑≥5 cm者33例，<5 cm者17例；患者術(shù)前均未接受放療和化療。另取同期50例非腫瘤患者胃黏膜組織作為對(duì)照，其中男35例，女15例，年齡30～75歲。所有患者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

RAW 264.7細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海細(xì)胞所產(chǎn)品）；重組質(zhì)粒NF-κB熒光素酶（NF-κB-LUC）（美國國立癌癥研究所提供）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitmgen公司產(chǎn)品）；熒光素酶分析試劑（美國Promega公司產(chǎn)品）兔抗大鼠NF-κB p65抗體一抗（武漢博士德）。SA-1022山羊抗兔IgG二抗SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德）；核-胞漿蛋白制備試劑盒（Pierce公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 標(biāo)本處理 RAW 264.7細(xì)胞在37℃、5%CO2的條件下，在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO-BRL）中貼壁生長。用Lipofectamine 2000介導(dǎo)NF-κB-LUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW 264.7細(xì)胞。首先采集兩組研究對(duì)象的靜脈血標(biāo)本，采集量為80 mL，分別取4.0 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）試管及BD試管。將EDTA試管中血液樣本進(jìn)行處理，以PBS液進(jìn)行混合，再以淋巴細(xì)胞液加入并離心，3500 r/min，離心15 min，取上清液進(jìn)行檢測，去沉淀物，然后以核-胞漿蛋白制備試劑盒進(jìn)行檢測，依次再進(jìn)行細(xì)胞胞漿提取液（CERI）加入、震蕩、冰浴，再進(jìn)行CERI加入、震蕩、冰浴及離心，取胞漿冷藏，沉淀層反復(fù)進(jìn)行上述處理4次，后離心進(jìn)行上清液冷藏。

1.3.2 組織芯片的制備及免疫組化染色處理 由兩名資深病理科醫(yī)師進(jìn)行相應(yīng)的處理，將空白石蠟芯片放入組織，然后以鼠組織定位，并連續(xù)切片，后貼在載玻片上以HE染色進(jìn)行對(duì)照。以SP免疫組化染色試劑盒及DAB酶底物顯色劑對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色處理，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) NF-κB主要在細(xì)胞漿內(nèi)陽性表達(dá)，顏色成棕黃色。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野（400倍鏡下），每個(gè)視野下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。另以陽性細(xì)胞所在比例≥40%和<40%分別表示高表達(dá)和低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織、癌旁組織和非腫瘤患者胃黏膜組織中NF-κB的表達(dá)比較

胃癌組織、癌旁組織和非腫瘤患者胃黏膜組織中NF-κB蛋白的表達(dá)，表達(dá)陽性率分別為76.0%（38/50）、4.0%（2/50）和16.0%（8/50），三者相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。其中，胃癌組織與癌旁組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.404，P=0.000）；胃癌組織與正常胃黏膜組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=43.51l，P=0.000）；癌旁組織與正常胃黏膜組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.655，P=0.010）。見圖1（封三）。

2.2 NF-κB表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征關(guān)系的比較

50例胃癌組織中NF-κB的表達(dá)與脈管侵犯呈正相關(guān)（r=0.318，P=0.002），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.243，P=0.035），當(dāng)腫瘤直徑<5 cm時(shí)，與腫瘤大小呈正相關(guān)（r=0.315，P=0.002），與浸潤程度呈正相關(guān)（r=0.350，P=0.001），與分化程度無相關(guān)性（r=0.119，P=0.242）。不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、脈管侵犯情況的胃癌患者NF-κB陽性表達(dá)例數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 不同NF-κB表達(dá)情況者5年生存率比較分析

研究顯示，胃癌組織低表達(dá)的16例患者中，達(dá)到5年生存率的占68.75%（11/16），高表達(dá)的22例患者中，達(dá)到5年生存率的占27.27%（6/22） NF-κB低表達(dá)者的5年生存率顯著高于高表達(dá)者（χ2=14.642，P < 0.05），5年生存率與NF-κB表達(dá)關(guān)系分析結(jié)果顯示5年生存率與NF-κB表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.337，P=0.003）。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，NF-κB與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系，目前已證明在乳腺癌、甲狀腺癌、T或B淋巴細(xì)胞白血病、結(jié)腸癌及幾種病毒誘導(dǎo)的腫瘤中，均存在NF-κB活性高表達(dá)[5-7]。胃腺癌在男性常見癌癥中位于第4位，在女性中為第5位，并且與慢性炎癥密切相關(guān)[8]。目前普遍認(rèn)為幽門螺桿菌在胃炎到胃癌的惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，但僅有約l%感染人群最終轉(zhuǎn)變?yōu)槲赴9]。這種差異的出現(xiàn)可能是因?yàn)槭艿骄植垦装Y因子的遺傳易感性的影響。幽門螺桿菌是慢性胃炎的主要病因，亦是第一類致胃癌因子[10]。幽門螺桿菌感染后，患者內(nèi)皮細(xì)胞上的多種與癌通道受到影響，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，而這些受影響的指標(biāo)即有NF-κB。NF-κB表達(dá)與胃癌發(fā)生的關(guān)系，目前報(bào)道較少，觀點(diǎn)也不一致。研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌可以激活NF-κB，從而進(jìn)一步導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[11-12]。NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異性結(jié)合并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白因子，其活化形式通常指NF-κB p65。NF-κB調(diào)控的基因參與了腫瘤的發(fā)生、血管生成和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，同時(shí)NF-κB基因產(chǎn)物異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[13]。NF-κB在腫瘤中的異常狀態(tài)與癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，而TLR4/NF-κB又與炎性及免疫應(yīng)激有一定的關(guān)系，通過通路與抗炎免疫機(jī)制密切相關(guān)，該通路的MYD 88依賴和非依賴兩條途徑發(fā)揮作用，形成相輔相承的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[14]。TLR4受體的激活所需的四種蛋白又與上述指標(biāo)相關(guān)，并對(duì)炎癥細(xì)胞，尤其是促炎細(xì)胞產(chǎn)生影響，對(duì)其表達(dá)狀態(tài)產(chǎn)生一定的影響作用[15]。相關(guān)研究認(rèn)為，NF-κB p65對(duì)于胃癌的早期診斷有較高的價(jià)值，主要與其在此類患者早期組織中的表達(dá)狀態(tài)有關(guān)，且其表達(dá)越高則患者生存率越高[16]，另外其與患者治療后的生存期也密切相關(guān)，因此臨床認(rèn)為可將其作為胃癌預(yù)后的重要了解及監(jiān)測指標(biāo)[17]。有研究表明NF-κB轉(zhuǎn)錄因子亞單位的結(jié)合位點(diǎn)在TFF3的5′端區(qū)域。TFF3可通過IKK短暫激活NF-κB的炎性應(yīng)激反應(yīng)，并進(jìn)一步影響Twist蛋白，兩者相互抑制，從而抑制炎癥及腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[18-19]。endprint

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測了胃癌組織和癌旁肺組織中NF-κB的表達(dá)，結(jié)果提示，在胃癌組織中，NF-κB陽性表達(dá)明顯高于癌旁組織，提示NF-κB表達(dá)可能與胃癌發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)NF-κB表達(dá)陽性率越高，淋巴轉(zhuǎn)移率越高，預(yù)后也越差。有針對(duì)性地選擇其活化途徑的不同水平層次進(jìn)行選擇性調(diào)控NF-κB的活性，可以從基因水平上防治胃癌，是抗癌藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)很好的靶點(diǎn)，為臨床治療胃癌提供一條新的途徑。NF-κB是一種多項(xiàng)多功能核轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)許多重要的生理過程，包括細(xì)胞生長、凋亡和腫瘤形成，同時(shí)可能影響腫瘤的血管形成，促進(jìn)腫瘤的生長浸潤和轉(zhuǎn)移[20]。本研究結(jié)果顯示NF-κB的表達(dá)與脈管侵犯，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小呈正相關(guān)，與分化程度無相關(guān)性。

綜上所述，NF-κB陽性表達(dá)與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測NF-κB的表達(dá)對(duì)胃癌病情監(jiān)測及轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后估計(jì)等方面有重要參考價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Loercher A，Lee TL，Ricker JL，et al. Nuclear factor-kappaB is an important modulator of the altered gene expression profile and malignant phenotype in squamous cell carcinoma [J]. Cancer Res，2004，64（18）：6511-6523.

[2] Yu HG，Yu LL，Yang Y，et al.Increased expression of RelA/nucle-ar factor-kappa B protein correlates with colorectal tumorigenesis [J]. Oncology，2003，65（1）：37-45.

[3] Shishodia S，Aggarwal BB.Nuclear factor-kappaB activation medi-ares cellular transformation，proliferation，invasion angiogenesis and metastasis of cancer [J]. Cancer Treat Res，2004，119（3）：139-173.

[4] Sasaki N，Morisaki T，Hashizume K，et al.Nuclear factor-kappaBn 065（RelA）transcription factor is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue Clin[J]. Cancer Res，2001，7（12）：436-442.

[5] Jemal A，Bray F，Center MM，et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[6] Fox JG，Rogers AB，Whary MT，et al. Accelerated progression of gastritis to dysplasia in the pyloric antrum of TFFC/C CBL x Sv Helicobacter pylori-infected mice [J]. Am J Pathol，2007，171（5）：1520-1528.

[7] Beales IL. Efkct of interlukin-1β on proliferation of gastric epithelial cells in culture [J]. BMC Gastmenterol，2002，2：7.

[8] Kasza A. IL-1 and EGF regulate expression of genes important in inflammation and cancer [J]. Cytokine，2013，62（1）：22-33.

[9] Carmi Y，Dotan S，Rider P，et al. The Role of IL-1 beta in the early tumor cell-induced angiogenic response [J]. J Immunol，2013，190（7）：3500-3509.

[10] 方瑩，楊洪彬，韓亞楠，等，幽門螺桿菌感染后兒童與成人胃黏膜免疫狀態(tài)差異[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（4）：103-107.

[11] Zhang H. Anti-IL-I beta therapies[J]. Recent Pat DNA Gene Seq，2011，5（2）：126-135.

[12] Fan Y，Yu Y，Mao R，et al. TAKl Lys-158 but not Lys-209 is required for IL-1 beta-induced Lys63-linked TAKl polyubiquitination and IKK/NF-kappaB activation [J]. Cell Signal，2011，23（4）：660-665.

[13] 康丹，袁媛，幽門螺桿菌重組蛋白SlyD對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制[D].沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2014.

[14] 馬建霞，孫運(yùn)良，王一倩，等，雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞Toll樣受體4/核因子-κB信號(hào)通路的影響[J].中華胰腺病雜志，2013，13（2）：114-117.endprint

[15] Dileva G，Piovan C，Gasparini P，et al. Estrogen mediated-activation of miR-191/425 cluster modulates tumorigenicity of breast cancer cells depending on estrogen receptor status [J]. PLoS Genet，2013，9（3）：311.

[16] Yu M，Trobridge P，Wang Y，et al. Inactivation of TGF-beta signaling and loss of PTEN cooperate to induce colon cancer in vivo [J]. Oncogene，2014，33（12）：1538-1547.

[17] 王曉晨，吉愛國.NF-κB信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2014，45（1）：68-71.

[18] Vasudevan KM，Gurumurthy S，Rangnekar VM. Suppression of PTEN expression by NF-kappa B prevents apoptosis [J]. Mol Cell Biol，2004，24（3）：1007-1021.

[19] Wu W，Yang J，F(xiàn)eng X，et al. MicroRNA-32（miR-32） regulates phosphatase and tensin homologue（PTEN）expression and promotes growth，migration，and invasion in colorectal carcinoma cells [J]. Mol Cancer，2013，12：30.

[20] Wang S，Liu Z，Wang L，et al.NF-kappa B signaling pathway，inflammation and eolorectal cancer[J]. Cell Mol Immunol，2009，6（5）：327-334.

（收稿日期：2015-05-06 本文編輯：關(guān) 婧）endprint