陳利飛 李猛 馬春玲 楊建樓

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353）

克雷伯氏菌產(chǎn)1，3-丙二醇ldhA基因缺失菌株的構(gòu)建

陳利飛 李猛 馬春玲 楊建樓

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353）

克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）甘油歧化發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇（1，3-PD）的過(guò)程中，乳酸是氧化途徑最主要的副產(chǎn)物，乳酸的產(chǎn)生和積累，不僅限制了菌體本身的生長(zhǎng)，而且嚴(yán)重影響了1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率。利用λRed重組技術(shù)對(duì)Klebsiella pneumonia中的酶乳酸脫氫酶基因（ldhA）進(jìn)行改造。在λRed重組系統(tǒng)作用下，將帶有300 bp的線性同源片段ldhA1-Cm-ldhA2與基因組DNA的同源重組，經(jīng)過(guò)抗性篩選和PCR鑒定最終獲得了ldhA基因缺失菌株K. pneumonia2-1ΔldhA。經(jīng)過(guò)24 h發(fā)酵可知，乳酸最大產(chǎn)出濃度由原來(lái)的10.16 g/L降為0.49 g/L，1，3-PD由原來(lái)的78.83 g/L增長(zhǎng)為85.76 g/L，甘油轉(zhuǎn)化率由60.64%增長(zhǎng)到65.97%，提高了5.33%。

克雷伯氏菌；ldhA基因；λRed同源重組；1，3-丙二醇

1，3-丙二醇（1，3-propanediol，簡(jiǎn)稱1，3-PD）是一種重要的化工原料，被廣泛應(yīng)用于印染、涂料、油墨、藥物、抗凍劑、潤(rùn)滑劑等領(lǐng)域［1］，尤其作為單體合成新型聚酯材料PTT（聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯）受到人們廣泛關(guān)注。1，3-PD的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，近年來(lái)?xiàng)l件溫和、原材料來(lái)源廣泛以及環(huán)境污染小的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-PD成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［2］，肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）是一種典型的微生物發(fā)酵產(chǎn)1，3-PD的菌種［3］，以甘油為代謝底物，K. pneumonia一方面通過(guò)還原途徑在與1，3-丙二醇氧化還原酶的作用下產(chǎn)1，3-PD；另一方面通過(guò)氧化途徑獲取菌體生長(zhǎng)所需能量和還原氫［4，5］，與此同時(shí)氧化途徑還產(chǎn)出了大量的副產(chǎn)物，如乳酸等。乳酸的產(chǎn)生和積累，不僅限制了菌體本身的生長(zhǎng)，而且嚴(yán)重影響了1，3-PD的轉(zhuǎn)化率，并且為后續(xù)提取工藝帶來(lái)了不便，最終提高了生產(chǎn)成本［6］，可利用基因工程切除乳酸的代謝途徑解決此問(wèn)題。λRed重組系統(tǒng)是由pKD46、pKD3、pCP20三個(gè)質(zhì)粒來(lái)共同完成使帶有一定長(zhǎng)度同源臂的線性片段與基因組DNA實(shí)現(xiàn)基因重組。pKD46為溫度敏感型質(zhì)粒，在阿拉伯糖誘導(dǎo)下使exo、bet和gam基因表達(dá)，以此來(lái)介導(dǎo)線性片段與相應(yīng)基因發(fā)生同源重組。pKD3可作為克隆模板來(lái)克隆兩端帶有FRT位點(diǎn)的氯霉素基因。pCP20也是溫敏型質(zhì)粒，編碼FLP重組酶，此酶能夠識(shí)別FRT位點(diǎn)，除去抗性基因，最終實(shí)現(xiàn)基因的無(wú)痕敲除［7］。

本研究利用λRed重組技術(shù)［8］對(duì)K. pneumonia產(chǎn)乳酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶基因（ldhA）進(jìn)行敲除，以期獲得高產(chǎn)1，3-PD的乳酸脫氫酶基因缺失菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物 具體詳見(jiàn)表1和表2。

表1 本試驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒

表2 本試驗(yàn)所用引物

1.1.2 主要儀器與試劑 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，Taq DNA聚合酶、T4連接酶及相關(guān)分子生物學(xué)試劑盒均為上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品，氨芐青霉素、氯霉素和L-阿拉伯糖購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司，酵母浸粉和蛋白胨為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。高效液相色譜儀為島津公司產(chǎn)品，氣相色譜儀為浙江福立分析儀器有限公司產(chǎn)品，5 L發(fā)酵罐為上海百侖生物科技有限公產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法

1.2.1.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 LB培養(yǎng)基：10.0 g/L蛋白胨；5.0 g/L酵母浸粉；10.0 g/L NaCl；pH7；蒸餾水1 000 mL。種子培養(yǎng)基：甘油20.0 g；（NH4）2SO42 g；K2HPO43.4 g；KH2PO41.3 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCl 2×10-3g；FeSO·7HO 5×10-3g；酵母浸242粉 1.0 g；檸檬酸 0.42 g；微量元素A液 2 mL；蒸餾水1 000 mL。微量元素A液：CoCl2·6H2O 0.2 g；MnCl2·4H2O 0.1 g；ZnCl20.07 g；H3BO30.06 g；Na2MoO4·2H2O 0.035 g；CuCl2·2H2O 0.02 g；NiCl2·6H2O 0.025 g；蒸餾水1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：甘 油 50.0 g；（NH4）2SO46.6 g；NaH2PO41.38 g；Na2SO40.28 g；KCl 0.75 g；MgCl2·6H2O 0.26 g；CaCl2·2H2O 0.29 g；酵母浸粉1.0 g；檸檬酸0.42 g；微量元素B液 5 mL；蒸餾水1 000 mL。微量元素溶液B：CuCl2·2H2O 0.17 g；MnCl2·4H2O 2.0 g；ZnCl2·6H2O 0.68 g；H3BO30.06 g；Na2MoO4·2H2O 0.005 g；CoCl2·6H2O 0.47 g；FeCl3·6H2O 5.4 g；蒸餾水1 000 mL。以上培養(yǎng)基用2.5 mol/L的KOH溶液調(diào)節(jié)pH到7.0，121℃滅菌20 min待用［10］。種子培養(yǎng)：挑取4℃斜面保存的菌種，在裝有固體LB培養(yǎng)基的平板上劃線活化，挑取單菌落接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37℃，180 r/min搖床培養(yǎng)14 h。發(fā)酵罐培養(yǎng)：在5 L全自動(dòng)攪拌發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝液量3 L（發(fā)酵培養(yǎng)基），接種量10%（V/V），發(fā)酵溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵過(guò)程通入0.4 vvm的氮?dú)饩S持厭氧環(huán)境，并用2.5 mol/L的KOH溶液自動(dòng)調(diào)節(jié)pH為7.0，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期按照甘油反饋流加方式，使底物甘油濃度保持在20 g/L左右［11］。

1.2.1.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備與電轉(zhuǎn)化 克雷伯氏菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備參見(jiàn)魏東［12］的方法，電轉(zhuǎn)化條件確定為2 500 V，25 μF，200 Ω，2 mm電擊杯。

1.2.1.3 同源重組線性片段ldhA1-Cm-ldhA2的制備［7，13，14］首先以A1、A2為引物，以克雷伯氏菌基因組DNA為模板克隆出ldhA基因，然后ldhA基因與載體pMD19-T（simple）連接獲得重組質(zhì)粒pMD19-T-ldhA；其次以A3、A4為引物、pMD19-T-ldhA為模板對(duì)其進(jìn)行反向克隆，以期獲得兩端帶有300 bp同源臂的線性片段ldhA1-T-ldhA2；再次以L1和L2為引物、pKD3為模板，克隆帶有FRT位點(diǎn)的Cm基因，之后對(duì)ldhA1-T-ldhA2和Cm基因進(jìn)行Kpn I、Xho I雙酶切，然后連接，獲得pMD19-T-ldhA1-CmldhA2質(zhì)粒，最后再以A1、A2為引物、pMD19-T-ldhA1-Cm-ldhA2為模板，以期獲得兩端帶有300 bp同源臂的同源重組線性片段ldhA1-Cm-ldhA2（圖1）。

圖1 同源重組線性片段ldhA1-Cm-ldhA2的制備流程圖

1.2.1.4 ldhA基因的敲除 首先將pKD46質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入K. pneumonia2-1，加入LB培養(yǎng)基30℃復(fù)蘇培養(yǎng)3-4 h，然后涂布到含有氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)12-14 h，篩選出含有pKD46質(zhì)粒的菌株。其次，在L-阿拉伯糖（10 mmol/L）誘導(dǎo)的條件下以含有pKD46質(zhì)粒的克雷伯氏菌為受體菌做電轉(zhuǎn)化感受態(tài)，將帶有300 bp同源臂的同源重組線性片段ldhA1-Cm-ldhA2電轉(zhuǎn)到含有pKD46質(zhì)粒的菌株，LB培養(yǎng)基中30℃復(fù)蘇培養(yǎng)3-4h后涂布到含有氯霉素（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，升溫到42℃培養(yǎng)12-14 h除去pKD46質(zhì)粒。最后將pCP20電轉(zhuǎn)到陽(yáng)性菌株中以去除其中的Cm抗性基因，再升溫到42℃培養(yǎng)12-14 h去除pCP20質(zhì)粒。

1.2.1.5 陽(yáng)性菌株的鑒定 在電轉(zhuǎn)pCP20質(zhì)粒之前和之后，分別以A1、A2和L1、L2為引物對(duì)突變菌株和原始菌株進(jìn)行菌落PCR鑒定，以期驗(yàn)證ldhA基因在原始菌株K. pneumonia2-1中實(shí)現(xiàn)完全敲除。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 生物量的測(cè)定 發(fā)酵液中的菌體密度以分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定，發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，以蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定OD650的吸光值。

1.2.2.2 1，3-丙二醇的測(cè)定方法［15］用氣相色譜法測(cè)定，色譜條件如下：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）檢測(cè)器，2 m×Φ3 mm填充柱，填料為GDX-401。色譜條件：載氣為N2，柱溫220℃、進(jìn)樣口溫度260℃、檢測(cè)器溫度250℃；載氣為N2，流量40 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.2.3 乳酸的測(cè)定方法［16］采用高效液相色譜法，用KromasilC18色譜柱進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相為0.2%（V/V）磷酸和乙腈混合溶液（體積比為96.5∶3.5），流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20 μL。

圖2 重組片段ldhA1-Cm-ldhA2的雙酶切驗(yàn)證

圖3 ldhA基因非完全敲除的菌落PCR鑒定

圖4 ldhA基因完全敲除的菌落PCR鑒定

2 結(jié)果

2.1 K. pneumonia2-1ΔldhA菌的構(gòu)建與鑒定

重組片段ldhA1-Cm-ldhA2的雙酶切驗(yàn)證（圖2）表明，成功構(gòu)建出1 628 bp的線性同源片段ldhA1-Cm-ldhA2。對(duì)突變菌株和原始菌株進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果（圖3）顯示，泳道1為K.pneumonia2-1的ldhA基因990 bp，泳道2驗(yàn)證了K.pneumonia2-1中沒(méi)有Cm基因，泳道3和4鑒定出ldhA1-Cm-ldhA2和基因組中l(wèi)dhA基因發(fā)生同源重組，即實(shí)現(xiàn)了ldhA基因的非完全敲除。電轉(zhuǎn)pCP20質(zhì)粒，消除Cm基因后，對(duì)突變菌株和原始菌株進(jìn)行菌落PCR鑒定。結(jié)果（圖4）顯示，ldhA1-Cm-ldhA2和基因組中l(wèi)dhA基因發(fā)生同源重組，并確定實(shí)現(xiàn)了ldhA基因的完全敲除。上述試驗(yàn)結(jié)果與理論值一致，說(shuō)明ldhA基因完成敲除，K. pneumonia2-1ΔldhA菌的構(gòu)建成功。

2.2 K. pneumonia2-1ΔldhA菌株的生長(zhǎng)特性

原始菌株與突變菌株生長(zhǎng)特性結(jié)果（圖5）顯示，與原始菌株K. pneumonia2-1相比，基因缺失菌株K. pneumonia2-1ΔldhA菌體生長(zhǎng)狀況在6 h之前基本一致，進(jìn)入對(duì)數(shù)期后K. pneumonia2-1ΔldhA菌株比原始菌株生長(zhǎng)旺盛，其18 h時(shí)OD達(dá)到最大為14.34，比原始菌株最大OD值12.67要大。這說(shuō)明在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定生長(zhǎng)期突變菌株比原始菌株生長(zhǎng)旺盛。

圖5 原始菌株與突變菌株生長(zhǎng)特性比較

2.3 ldhA基因的敲除對(duì)1，3-PD的影響

原始菌株與突變菌株產(chǎn)1，3-PD比較的結(jié)果（圖6）顯示，原始菌株K. pneumonia2-1發(fā)酵到20 h時(shí)1，3-PD濃度達(dá)到最大值78.83 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為3.28 g/（L·h），質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為60.64%。經(jīng)過(guò)改造后K. pneumonia2-1ΔldhA產(chǎn)1，3-PD能力有所提高，發(fā)酵到20 h時(shí)1，3-PD的最大濃度為85.76 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為3.57 g/（L·h），質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為65.97%，比原始菌株K. pneumonia2-1提高了5.33%。表明ldhA基因的敲除提高了1，3-PD的產(chǎn)量，主要是因?yàn)槿樗岬拇x會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的消耗還原氫，而ldhA基因敲除后，有足夠的還原當(dāng)量供給產(chǎn)1，3-PD的代謝途徑。

圖6 原始菌株與突變菌株產(chǎn)1，3-PD的比較

2.4 ldhA基因的敲除對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響

原始菌株與突變菌株產(chǎn)乳酸比較的結(jié)果（圖7）顯示，改造前后乳酸的產(chǎn)量相差較大，原始菌株K. pneumonia2-1乳酸產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間增大，其最大產(chǎn)出濃度為10.16 g/L。然而，K. pneumonia2-1ΔldhA突變菌株乳酸的產(chǎn)量一直變化不太，最大濃度僅為0.49 g/L，降低了95.17%。因此ldhA基因的敲除對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響較大，也證實(shí)了ldhA基因已被完全敲除。

圖7 原始菌株與突變菌株產(chǎn)乳酸的比較

3 討論

肺炎克雷伯氏菌的甘油代謝主要有兩個(gè)代謝途徑，分為氧化途徑和還原途徑。在氧化途徑中，甘油在相關(guān)酶的作用下生成磷酸二羥丙酮，之后進(jìn)入糖酵解途徑生成丙酮酸，進(jìn)一步代謝生成乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸等大量副產(chǎn)物，其中乳酸含量最高，并且乳酸對(duì)1，3-PD的抑制最為明顯［17］，其一般形成于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在穩(wěn)定生長(zhǎng)期積累，乳酸的積累對(duì)菌體有毒害作用，不利于菌體生長(zhǎng)，此外，乳酸代謝途徑會(huì)消耗大量的還原當(dāng)量NADH［18］，對(duì)1，3-PD的代謝途徑還原當(dāng)量和碳流量起競(jìng)爭(zhēng)作用，不利于底物甘油向1，3-PD途徑轉(zhuǎn)化。因此，為了提高還原途徑中NADH的利用率，在不影響輔酶NADH再生的同時(shí)來(lái)提高1，3-PD的得率，降低分離提取成本，利用基因工程切除乳酸代謝途徑是解決此問(wèn)題的方法。

本研究通過(guò)基因工程的方法，實(shí)現(xiàn)了ldhA基因的敲除，使1，3-PD的發(fā)酵濃度由78.83 g/L增長(zhǎng)到85.76 g/L，這與蔡忠貞等［19］的研究結(jié)果1，3-PD產(chǎn)量提高11%，乳酸產(chǎn)量降低98%保持一致。Oh等［14］構(gòu)建了乳酸和2，3-丁二醇副產(chǎn)物雙缺失菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件后1，3-PD達(dá)到102.7 g/L。本研究將進(jìn)一步改造克雷伯氏菌的代謝途徑，敲除其他副產(chǎn)物相關(guān)基因，實(shí)現(xiàn)兩種甚至多種基因的共敲除，優(yōu)化發(fā)酵體系，以期提高1，3-PD的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究以ldhA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用λRed重組技術(shù)對(duì)K. pneumonia2-1 中的ldhA基因進(jìn)行敲除，通過(guò)將帶有300 bp的線性同源片段ldhA1-Cm-ldhA2導(dǎo)入宿主菌株，在λRed重組系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒的作用下，實(shí)現(xiàn)了與基因組DNA的同源重組，經(jīng)過(guò)平板抗性篩選最終獲得了ldhA基因缺失菌株K.pneumonia2-1ΔldhA。經(jīng)過(guò)初步發(fā)酵研究可知，乳酸最大產(chǎn)出濃度由原來(lái)的10.16 g/L降為0.49 g/L，降低了95.17%，1，3-PD由原來(lái)的78.83 g/L增長(zhǎng)為85.76 g/L，其質(zhì)量轉(zhuǎn)化率由60.64%增長(zhǎng)到65.97%，提高了5.33%。由此知ldhA基因的敲除不僅阻斷了乳酸的產(chǎn)生，并且提高了1，3-PD的產(chǎn)量。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction a Metabolic Engineering Strain to Produce 1，3-propanediol from Klebsiella pneumoniae by ldhA Gene Deletion Mutation

Chen Lifei Li Meng Ma Chunling Yang Jianlou
（Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering，School of Food and Bioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250353）

Production of 1， 3-propanediol from glycerol by Klebsiella pneumoniae is restrained by lactate formation. The increase of lactate in the broth can inhibit cell growth and reduce 1， 3-propanediol conversion rate. The lactate dehydrogenase gene（ldhA）of production lactate by Klebsiella pneumoniae was modified by λRed recombination system. One 300 bp homologous recombinant fragment：ldhAl-Cm-ldhA2 was constructed for the gene knockout. After resistance experiments， PCR determination， K. pneumonia2-1ΔldhA with ldhA gene knocked out obtained by λRed recombination. After 24 h fermentation， the maximum yield of lactate was reduced to 0.49 g/L from 10.16 g/L and the maximum threonine yield of 1， 3- propanediol was increased to 85.76 g/L from 78.83 g/L， comparing with that of the original strain K. pneumonia2-1. The conversation rate of glycerol was improved to 65.97% from 60.64%， increasing by 5.33%.

Klebsiella pneumonia；ldhA；λRed recombination；1， 3-propanediol

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.017

2014-08-16

濟(jì)南青年科技明星計(jì)劃（20090118）

陳利飛，男，碩士研究生，研究方向：基因工程，微生物酶技術(shù)；E-mail：chenlifei8810@126.com

馬春玲，女，副教授，研究方向：基因工程，微生物酶技術(shù)；E-mail：machunling20022@163.com