宋超蔣麗王景偉，3李曉芳李耕張曉慧王書劉哲李恒德

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心，北京 100141；3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福州 350002；4.中捷羅非魚養(yǎng)殖有限公司，黃驊 061108；5.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院營口增殖試驗站，營口 115000；6. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，資源與環(huán)境研究中心，北京 100141）

半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的遺傳特性研究

宋超1，2蔣麗2王景偉2，3李曉芳4李耕5張曉慧6王書2劉哲1李恒德2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心，北京 100141；3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福州 350002；4.中捷羅非魚養(yǎng)殖有限公司，黃驊 061108；5.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院營口增殖試驗站，營口 115000；6. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，資源與環(huán)境研究中心，北京 100141）

半滑舌鰨雌雄個體生長差異懸殊，由于性逆轉(zhuǎn)而造成的其群體中雌性比例過低大大制約了養(yǎng)殖效率。性逆轉(zhuǎn)是魚類及兩棲類生物性別決定事件中有趣的生物學(xué)問題，其發(fā)生的遺傳機(jī)制鮮有研究。在該研究中，分別利用雄魚和偽雄魚組建10個半同胞家系，對這10個半同胞家系中的子代雌雄比進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個偽雄魚的家系，其后代個體中遺傳雌性魚全部逆轉(zhuǎn)為生理雄魚；在另外8個雄魚家系中其性逆轉(zhuǎn)比呈連續(xù)分布，表現(xiàn)為典型的數(shù)量性狀特征；半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的遺傳力較低，僅為0.058。以上結(jié)果表明，偽雄魚作為父本的遺傳可能為完全的父本效應(yīng)遺傳，性逆轉(zhuǎn)由于其較低的遺傳力不適合于做家系選育而適合于做家系內(nèi)的選育或結(jié)合分子標(biāo)記的遺傳評估，以提高雌性比的遺傳進(jìn)展，半滑舌鰨逆轉(zhuǎn)比的數(shù)量遺傳特征說明其性別決定是多基因作用的結(jié)果。

半滑舌鰨；性別決定；性逆轉(zhuǎn)

半滑舌鰨隸屬于鰈形目（Pleuronectiformes）、舌鰨科（Cynoglossidae）、舌鰨屬（Cynoglossus），主要分布于我國黃、渤海近海區(qū)域。半滑舌鰨由于具有強(qiáng)適應(yīng)性、高營養(yǎng)價值、味道鮮美等特點(diǎn)，成為當(dāng)前海水養(yǎng)殖的重要品種之一［1］。半滑舌鰨雌、雄魚生長速度差異比較大，雌魚的生長速度是雄魚的2-4倍，雄魚經(jīng)過兩年培育尚不能達(dá)到商品規(guī)格，并且在苗種期存在著遺傳雌魚向表型雄魚單向性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象［2，3］。在實際大生產(chǎn)的群體中，由于沒有對雌雄親本進(jìn)行遺傳鑒定，最終的雌雄比例往往不能確定，一般養(yǎng)殖場購買的苗種其雌性比例都在25%以下，最低的時候甚至連20%都難以保證，嚴(yán)重制約了生產(chǎn)效益的提高。盡管近些年半滑舌鰨的苗種繁育、健康養(yǎng)殖都得到了良好的發(fā)展，但其穩(wěn)定、高比例的雌性苗種率及其穩(wěn)步提高的問題一直是半滑舌鰨養(yǎng)殖中急需要解決的問題。

性別決定的機(jī)制可以被劃分為兩種類別：一種是遺傳性別決定（genetic sex determination，GSD）；另外一種是環(huán)境性別決定（environmental sex determination，ESD）。一種生物的最初性別是由其可遺傳的遺傳元件決定，從受精開始雌雄個體間的遺傳物質(zhì)就不同；然而環(huán)境性別決定在受精時卻沒有初始的性別，它是在生物系統(tǒng)發(fā)育過程中決定其性別的［4-6］。半滑舌鰨性染色體為ZW型，即雌性異配型（ZW）［7］。Chen等［8］利用自主開發(fā)的若干雌性特異性標(biāo)記，通過染色體核型分析發(fā)現(xiàn)了成對的大型染色體，即為性別染色體Z和W。在舌鰨的人工養(yǎng)殖群體中至今還沒有發(fā)現(xiàn)有WW成年個體的存在［2］，事實上利用人工雌核發(fā)育創(chuàng)制超雌WW的個體研究表明其超雌個體可能只能存活到肌節(jié)期和出膜前期［9，19］，這說明半滑舌鰨WW個體可能是由于缺乏Z染色體的功能而在出膜前期致死，而試圖利用超雌魚實現(xiàn)生產(chǎn)上的全雌化還有一定的距離，加之即使能制備超雌，超雌魚的生產(chǎn)性能如何還是未知數(shù)。

半滑舌鰨的性別決定受溫度等外界環(huán)境的影響比較大，使得其性別具有較大的可塑性［10］。在養(yǎng)殖過程中，人為地控制溫度、使用激素等可以使魚類的性別發(fā)生逆轉(zhuǎn)。如鄧思平等［11］通過控制養(yǎng)殖溫度，出現(xiàn)了由遺傳雌性向表型雄性逆轉(zhuǎn)的偽雄個體。張曉彥等［12］利用天然激素17 β-雌二醇處理半滑舌鰨幼魚得到了高達(dá)97%的雌性率。除了人工誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)之外，在自然界中也存在著性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，如黃鱔（Monopterus albus）［13］、石斑魚（Epinephelus akaara）［14］、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）［15］等雌雄同體魚類，以及青鳉（Oryzias latipes）［16］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）［3，17］等雌雄異體魚類。由于在半滑舌鰨養(yǎng)殖過程中使用激素來提高雌性率，此做法有食品安全和影響環(huán)境的弊端，不適宜生產(chǎn)性應(yīng)用；而控制溫度只能誘導(dǎo)半滑舌鰨雌魚性逆轉(zhuǎn)成雄魚，不能達(dá)到提高養(yǎng)殖群體中的雌性比例的目的。利用偽雄魚（ZW）建立的家系，其后代遺傳雌魚性逆轉(zhuǎn)成生理雄魚的比例高達(dá)91.4%［10，23］。研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖過程中不同家系之間的生理雌雄比例存在著差異［18］，但是目前還未見對性逆轉(zhuǎn)進(jìn)行遺傳特性分析的報道。因此從群體的角度來研究不同家系間半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的遺傳特性，對利用性別遺傳特性進(jìn)行遺傳選育研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年4月在河北中捷養(yǎng)殖廠進(jìn)行半滑舌鰨親魚選育，輕壓半滑舌鰨親魚的腹部采集精、卵建立10個家系，各家系在工廠化養(yǎng)殖模式下同池養(yǎng)殖，在這10個家系中以不同的雌性親魚（雌性親魚都為2齡）分為5組；第1組為1、2家系；第2組為12、14家系；第3組為16、17家系；第4組為19家系；第5組為38、39、40家系。第1、2組中的雄性親魚為3齡；第3、4組中的雄性親魚為4齡；第5組中的雄性親魚為2齡。在建立家系的同時，采集少量親魚鰭條以備后用。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2013年9月采集樣品。隨機(jī)撈取300尾F1代樣本（理論上每家系撈取30尾），從魚的腹部用強(qiáng)光照射，根據(jù)陳松林等［18］的方法用強(qiáng)光從魚背面的性腺位置照射，在腹面用肉眼觀察性腺的顏色和形狀，并做雌雄記錄。再解剖鏡下取魚的性腺放入Bouin氏液中（苦味酸飽和液∶甲醛∶冰醋酸=15∶5∶1），24 h之后將樣品轉(zhuǎn)移至70%酒精常溫下可長期保存，并做好對應(yīng)的標(biāo)記。剪取適量的組織樣品放入離心管中4℃保存以備用，并做好相應(yīng)標(biāo)記。

1.2.2 性別鑒定

1.2.2.1 遺傳性別鑒定 基因組DNA提取：采用海洋動物組織基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取DNA，溶解于50 μL TE中，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，4℃保存?zhèn)溆?。根?jù)Chen等［19］設(shè)計引物序列為：上游序列：GAGGCCGACAGGATCGTAC；下游序列：TACGACGTACTCCGGTGGTTTT 。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min，95℃（30 s），57℃（30 s），72℃（30 s），35個循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓100 V，電泳時間1 h，檢測出現(xiàn)兩條帶（218 bp，206 bp）的為雌魚（ZW），出現(xiàn)一條帶（206 bp）的為雄魚（ZZ）。

1.2.2.2 生理性別鑒定 生理性別鑒定用石蠟組織切片的方法，將固定好的性腺進(jìn)行各級脫水（70%、80%、90%、95%酒精、無水乙醇），透明，浸蠟，包埋。然后進(jìn)行切片，切片儀為SYD-S2020型，切片厚度為6 μm，然后用蒸餾水展片，展片儀為Leica，HI1220型。37℃烘干12 h后HE染色，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 親子鑒定 本試驗中的10個家系由于是同池養(yǎng)殖，所以為了統(tǒng)計每個家系中的各項試驗指標(biāo)，需要做親子鑒定。針對親子鑒定，本試驗篩選了15對引物（表1）［20］送北京閱微基因技術(shù)有限公司利用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行SSR分型檢測，測序儀為3730XL DNA analyzer（ABI公司），檢測結(jié)果用Cervus 3.0軟件根據(jù)LOD值（似然率E的自然對數(shù)值）的高低判定親子關(guān)系［21］。

表1 半滑舌鰨親子鑒定引物設(shè)計

第14、17這兩個家系中的雄性親魚為自然性逆轉(zhuǎn)的偽雄魚。

1.2.4 統(tǒng)計分析

1.2.4.1 家系間的遺傳性別比例的差異分析 該分析只對將遺傳性別作為一個性狀，0表示雄性，1表示雌性，采用logistic分析家系間是否有顯著差異。

其中，logit（xij）=log（px/（1-px）），p為遺傳雌性比例，μ為群體均值，di為第i條雌魚，sj（di）為第i條雌魚配對的第j條雄魚。

1.2.4.2 家系間的性逆轉(zhuǎn)的差異分析 該分析只對所有遺傳雌性將是否發(fā)生性逆轉(zhuǎn)作為一個性狀，0表示未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，1表示發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。采用logistic分析家系間是否有顯著差異，并剖分家系間和家系內(nèi)的方差組分。

其中，logit（yij）=log（py/（1-py）），p為性逆轉(zhuǎn)比例，μ為群體均值，di為第i 雌魚，sj（di）為第i條雌魚配對的第j條雄魚。

1.2.4.3 性逆轉(zhuǎn)的遺傳力 由于試驗設(shè)計為嵌套模型，采用logistic回歸模型估計方差組分，其遺傳力計算公式為：

2 結(jié)果

2.1 各家系偽雄魚、雄魚和雌魚所占比例

試驗發(fā)現(xiàn)（圖1），不同家系間偽雄魚、雄魚和雌魚所占比例有明顯的差異，1-8號家系為正常遺傳雄魚做父本，偽雄魚所占比例分別為1.5%，30.8%，10.0%，14.3%，17.1%，0.0%，12.5%，17.6%，其中6號家系中的遺傳雌魚不發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，1號家系性逆轉(zhuǎn)比例很低，其余6個家系存在不同程度的性逆轉(zhuǎn)；9和10號家系為偽雄魚做父本，其后代中遺傳雌魚全部逆轉(zhuǎn)為生理雄魚，考慮到在取樣時1-10號家系，可能存在偏取樣導(dǎo)致所取的樣本中雄性偏多，進(jìn)而導(dǎo)致各個家系中遺傳雄魚的比例偏高，但是這并不影響為性逆轉(zhuǎn)率高低的判定。

圖1 各個家系雄魚和偽雄魚所占百分比

2.2 肉眼觀察半滑舌鰨性成熟之前的生理性別的準(zhǔn)確性

在腹面用肉眼觀察性腺的顏色和形狀，雌魚的性腺比較狹長，顏色呈淡黃色或透明狀；雄魚的性腺短而小，顏色呈黑色或深藍(lán)色，通過對肉眼觀察與石蠟切片（圖2）觀察半滑舌鰨性成熟之前的生理性別比較（表2）。

圖2 組織切片法與H.E染色法區(qū)分半環(huán)舌鰨表型性別

表2 肉眼觀察和組織切片判斷半滑舌鰨性成熟之前的生理性別的準(zhǔn)確性比較

將用肉眼判斷的樣本全部進(jìn)行組織切片和分子標(biāo)記雌雄鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過石蠟切片能夠準(zhǔn)確判斷半滑舌鰨的生理性別，準(zhǔn)確性為100%；而通過肉眼觀察判斷半滑舌鰨生理性別的準(zhǔn)確性較低，準(zhǔn)確性僅為54.70%。結(jié)果表明通過肉眼觀察判斷半滑舌鰨性成熟之前的生理性別的可靠性較低，所以在以后的試驗過程中應(yīng)采用組織切片觀察判斷生理性別。

2.3 性逆轉(zhuǎn)的遺傳力

方差組分分析的結(jié)果（表3）顯示，看出雌魚和雌魚內(nèi)雄魚之間的變異都比較大，根據(jù)公式算得的性逆轉(zhuǎn)的遺傳力為0.058，屬低遺傳力。因此在實際選育低性逆轉(zhuǎn)比例的家系時，必須同時考慮雌魚和雄魚的影響。

表3 方差組分剖分結(jié)果分析

3 討論

3.1 父本偽雄魚的遺傳規(guī)律與生產(chǎn)利用

通過試驗發(fā)現(xiàn)，偽雄魚的后代全部為生理雄性，即遺傳雌性的魚100%都發(fā)生了性逆轉(zhuǎn)，說明偽雄魚的遺傳是完全的父本效應(yīng)，與母本無關(guān)，該結(jié)果與陳松林等［22，23］通過大量家系性別比例檢測以及DNA甲基化分析所獲得的結(jié)果相一致，即偽雄魚的染色體的DNA甲基化修飾模式與其后代一致。由正常父本（ZZ）組建的群體后代中，其ZW型的遺傳雌魚能在一定的外界環(huán)境條件下逆轉(zhuǎn)為生理雄魚，而該生理雄魚再做父本組建的后代群體中，其偽雄性狀就會通過父本決定下來，這可能是一個比較典型的獲得性遺傳性狀，在理論研究中具有重要的意義。偽雄魚在配子體發(fā)生過程中如何避免發(fā)生染色質(zhì)重編程的分子機(jī)制應(yīng)該是有重要意義的研究領(lǐng)域，同時該分子機(jī)制的探索將為性狀的固定提供新的視角。該遺傳規(guī)律從親本層面解釋了在半滑舌鰨種苗大生產(chǎn)中雄性過多，雌雄比例不穩(wěn)定的現(xiàn)象，因此在生產(chǎn)實踐中，避免使用偽雄魚將是調(diào)控舌鰨雌性比例的重要手段。

3.2 選育提高雌性比例

研究發(fā)現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)的遺傳力非常低，傳統(tǒng)魚類的選育靠建立家系，以家系選育為主，一般高遺傳力的性狀適用于家系間選育，低遺傳力的性狀適用于家系內(nèi)選擇，要從選育上控制舌鰨性逆轉(zhuǎn)，必須關(guān)注家系內(nèi)的變異。傳統(tǒng)選育的經(jīng)濟(jì)性狀，如生長性狀，其遺傳力較高，往往采用家系間選育，因此以多性狀為育種目標(biāo)時，應(yīng)將家系間選擇和家系內(nèi)選擇結(jié)合起來，根據(jù)經(jīng)濟(jì)權(quán)重建立綜合選擇指數(shù)，以達(dá)到選育目標(biāo)。

由于采用傳統(tǒng)的以系譜為基礎(chǔ)的BLUP遺傳評估，其準(zhǔn)確性對低遺傳力性狀來說很低，因此結(jié)合分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳評估是進(jìn)行調(diào)控雌雄比例的一個有效手段，特別是以高通量標(biāo)記為基礎(chǔ)的遺傳評估方法，更適合于低遺傳力的性狀，也是下一步的重點(diǎn)研究方向。

在性逆轉(zhuǎn)這個性狀上，雌性和雄性間的差異都比較大而其遺傳力比較低，因此雜交手段也是控制性逆轉(zhuǎn)的重要方法。對親本進(jìn)行配合力測定，充分評估各個親本對性逆轉(zhuǎn)的影響，建立相應(yīng)品系，然后通過雜交來提高雌性比例。這種方法不僅可以對一個性狀進(jìn)行，也可以進(jìn)行多性狀的選育。

4 結(jié)論

利用偽雄魚建立的家系其后代的遺傳雌魚更容易逆轉(zhuǎn)為生理雄魚，性逆轉(zhuǎn)比例高達(dá)100%；而利用正常雄魚建立的家系其后代的性逆轉(zhuǎn)的比例呈連續(xù)性分布，表現(xiàn)為典型的數(shù)量性狀特征；利用數(shù)量遺傳學(xué)分析得出半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的遺傳力較低，僅為0.058，從而表明，偽雄魚作為父本的遺傳可能為完全的父本效應(yīng)遺傳，性逆轉(zhuǎn)由于其較低的遺傳力不適合做家系間選育，而適合于做家系內(nèi)的選育或結(jié)合分子標(biāo)記的遺傳評估。此外，利用手電照射半滑舌鰨的腹部肉眼判斷其生理性別的準(zhǔn)確性僅為54.70%，可靠性比較低。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Studies on Genetic Features of Sex Reversal in Cynoglossus semilaevis

Song Chao1，2Jiang Li2Wang Jingwei2，3Li Xiaofang4Li Geng5Zhang Xiaohui6Wang Shu2Liu Zhe1Li Hengde2
（1. College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2 Biotechnology Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141；3.College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agricultural University，F(xiàn)uzhou 350002；4. Zhongjie Tilapia Aquaculture Limited Company，Huanghua，Hebei 061108；5. Yingkou Proliferation Experimental Station，Chinese Academy of Fishery Sciences，Yingkou 115000；6. Research Center of Resources and Environment，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141）

The remarkable individual size differences of half-smooth tongue（Cynoglossus semilavi.）between female and male fishes exist. However， the lower ratio of female in cultured populations arise from sex reversal of the females leads to lower production efficiency. In sex-determination of some fishes and amphibians， sex reversal is interesting biology question and its molecular genetic mechanisms are rarely explored. In this study， 10 half-sib families are set up by utilizing two types of male parents：genetically males and pseudo males which are genetically females. The results showed that the females were all reversed into physiologically male fishes in two families with pseudo male parent. In the other 8 families with normal male parent， the ratio of sex reversal in individual populations presents continuous distribution， which fits for features of QTLs（Quantitative Trait Loci）typically；the heredity of sex reversal is lower， only 0.058. All of these results showed that，the pseudo males as parents， which demonstrate full paternal-effects， the female progenies were all reversed into pseudo males；interfamily selection for improving the genetic advances of sex ratio or genetic evaluation of sex reversal by using genetic markers are advantageous over intrafamily selection for lower heredity of sex-reversal；the continuous distribution of ratio of sex reversal implies the sex-determination for halfsmooth tongue is depended on the interactions among multiple QTLs.

half-smooth tongue；sex-dertermination；sex-reversal

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.030

2014-07-18

中央公益級基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目（2013A0401，2013A0506）

宋超，碩士，研究方向：魚類生物學(xué)及水產(chǎn)養(yǎng)殖；E-mail：songchaosc168@163.com

劉哲，博士，研究方向：魚類基礎(chǔ)生物學(xué)及分子遺傳，E-mail： liuz@gsau.edu.cn； 李恒德， 博士， 研究方向：統(tǒng)計遺傳學(xué)，E-mail：hengde.li@cafs.ac.cn