馬 康，李小佳，崔萌萌，馬聯(lián)弟

（1.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京　100029；2.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京　100083；3.北京化工大學(xué)化學(xué)理學(xué)院，北京　100029）

高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中莧菜紅的不確定度評(píng)定

馬 康1，李小佳2，崔萌萌3，馬聯(lián)弟1

（1.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029；2.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100083；3.北京化工大學(xué)化學(xué)理學(xué)院，北京100029）

通過(guò)對(duì)高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中合成色素莧菜紅質(zhì)量濃度的全過(guò)程分析，確定了測(cè)定結(jié)果不確定度的來(lái)源。采用計(jì)量學(xué)不確定度傳遞模型，對(duì)引入的不確定度分量進(jìn)行評(píng)定，確定了葡萄酒中莧菜紅質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)不確定度由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品制備、測(cè)量重復(fù)性和回收率等6部分不確定度合成得到。2個(gè)不同質(zhì)量濃度樣品測(cè)定結(jié)果不確定度被評(píng)定，其相對(duì)擴(kuò)展不確定度分別為2.6％和2.2％（k=2），由不確定度評(píng)價(jià)結(jié)果分析得到，樣品重復(fù)性測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制是測(cè)定結(jié)果不確定度的主要來(lái)源。

計(jì)量學(xué)；莧菜紅；葡萄酒；高效液相色譜；不確定度

1　前 言

葡萄酒是由新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)發(fā)酵而成的飲料，富含有機(jī)酸、糖類、黃酮類、酚類和原花青素等功能成分，適量飲用能預(yù)防多種疾?。?，2］。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，葡萄酒的消費(fèi)量呈現(xiàn)了快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。為了保障葡萄酒的飲用安全，相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)葡萄酒中允許添加的食品添加劑種類和濃度作了明確規(guī)定，其中規(guī)定不允許添加合成著色劑［3～5］，但一些不法生產(chǎn)者向葡萄酒中添加合成著色劑（莧菜紅、胭脂紅、檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)）的情況卻時(shí)有發(fā)生。其中莧菜紅是非法添加頻率較高的合成著色劑［6］。為了保證葡萄酒的產(chǎn)品質(zhì)量，防止假冒偽劣產(chǎn)品以次充好和保護(hù)大眾健康，需要對(duì)葡萄酒中莧菜紅等著色劑進(jìn)行測(cè)量，為了保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠和可信，需要對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理地賦予被測(cè)量的分散性［7］。它是考察一種測(cè)量方法能力優(yōu)劣的指征，是對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行客觀真實(shí)的表述。近年來(lái)檢驗(yàn)分析工作對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)定工作越來(lái)越重視，不確定度評(píng)價(jià)結(jié)果的可信性、可比性和可接受性的主要指標(biāo)，同時(shí)各實(shí)驗(yàn)室及時(shí)總結(jié)與評(píng)定分析結(jié)果的不確定度，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分析數(shù)據(jù)的匯總整合具有科學(xué)的評(píng)價(jià)意義［8，9］。本文針對(duì)高效液相色譜法測(cè)量其他著色劑組分可依此方法進(jìn)行類似計(jì)算。

2　實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

UFLC-20A液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器（UFLC-PDA，日本島津公司）。莧菜紅溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；甲醇（色譜純）、乙酸銨（優(yōu)級(jí)純）、檸檬酸（優(yōu)級(jí)純）購(gòu)自百靈威公司；氨水和聚酰胺粉購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

2.2試驗(yàn)條件

色譜柱：ODS-C18，4.6 mm×250 mm×5 μm（日本GL Science公司）；柱溫：35℃；流量：1.0mL/ min；進(jìn)樣量：20 μL。

流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲醇；流動(dòng)相B為0.10 mol/L乙酸銨水溶液。

梯度程序：0～6 min，90％A；6～12 min，（90％ ～55％）A；12～13 min，（55％～90％）A；13～15 min，90％A。

檢測(cè)器：二極管陣列波長(zhǎng)190～700nm，莧菜紅波長(zhǎng)521nm。

2.3分析流程

準(zhǔn)確稱取葡萄酒5.0 g，檸檬酸水溶液補(bǔ)足約20mL，60℃聚酰胺粉吸附約1 h，然后用pH=4的檸檬酸水溶液、60∶40的甲醇-甲酸溶液、純凈水各洗3次，最后用乙醇-氨水-水溶液（7∶2∶1）洗脫目的物，旋蒸近干，純水定容25mL，經(jīng)0.45 μm的濾膜。葡萄酒中莧菜紅組分測(cè)試流程見(jiàn)圖1。

圖1　葡萄酒樣品中莧菜紅組分液相色譜測(cè)試流程

2.4測(cè)定結(jié)果的數(shù)學(xué)模型

本文研究的基質(zhì)為葡萄酒，采用高效液相色譜法測(cè)量葡萄酒中4種著色劑組分的質(zhì)量濃度，計(jì)算式為

式中，X為樣品中著色劑的質(zhì)量濃度，mg/L；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得樣液中著色劑的質(zhì)量濃度，mg/L；V為樣品最終定容體積，mL；m為最終定容體積所代表的樣品量，g；R為方法的回收率，％。

3　測(cè)定不確定度來(lái)源

莧菜紅組分質(zhì)量濃度測(cè)量結(jié)果的不確定度由二部分組成：第一部分是通過(guò)測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)方法直接求得（A類不確定度）；第二部分是通過(guò)對(duì)測(cè)量影響參數(shù)和影響函數(shù)的分析，估計(jì)出其大小，同時(shí)考慮樣品不均勻性和有效期內(nèi)的變動(dòng)性等其它因素所引起的不確定度（B類不確定度）。對(duì)式（1）做全微分并除以X，則得

因此，不確定度的來(lái)源因素包括：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、工作標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率、樣品制備（天平、容量和溫度），分析過(guò)程引入的不確定度通過(guò)加標(biāo)回收率估計(jì)，見(jiàn)圖2。

圖2　葡萄酒中莧菜紅測(cè)定不確定度的來(lái)源

4　結(jié)果與討論

4.1不確定度分量評(píng)定

4.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

莧菜紅溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）100 002 a，特性量值500 μg/mL，相對(duì)擴(kuò)展不確定度1％（k=2），則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度為

4.1.2工作標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

工作標(biāo)準(zhǔn)溶液至少需要配制5個(gè)質(zhì)量濃度，用上述的莧菜紅溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行逐級(jí)得到，質(zhì)量濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 和100 μg/mL的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。稀釋過(guò)程的數(shù)學(xué)模型為

其引入的不確定度的計(jì)算式為

式中，Ci為稀釋得到莧菜紅工作標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；C0為莧菜紅溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/mL；V0為移取標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；Vi為莧菜紅工作標(biāo)準(zhǔn)溶液定容體積，mL。

以50 μg/mL的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液為例說(shuō)明。移取體積V0引入的不確定度主要由移液器的重復(fù)性、校準(zhǔn)規(guī)范［12］中的最大允差和移取溶液的溫度差引入的。采用1mL 3次水充滿移液器，用0.1mg的天平連續(xù)稱量6次（1.0001g；1.0015g；1.0010g；0.9997 g；1.0008 g；0.9995 g），稱量結(jié)果的6次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為移液器的重復(fù)性0.00079mL；根據(jù)JJG646—2006中1mL移液器的最大允差為0.008mL，取三角分布，此項(xiàng)引入的不確定度為0.008/=0.0033mL；工作標(biāo)準(zhǔn)溶液配制溫度與校準(zhǔn)時(shí)溫度不同，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的溫度設(shè)置要求，溫差不超過(guò)4℃，水體積膨脹系數(shù)為0.000 21 L/℃，溫度引入體積變化為0.00021×0.001×4×1 000mL=0.000 84mL，假定溫度變化為矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.000 84mL/=0.00049mL。

容量瓶定容體積Vi不確定度來(lái)源：（1）容量瓶校準(zhǔn)對(duì)體積影響；（2）溫度對(duì)體積影響；（3）容量瓶至刻度線重復(fù)性對(duì)體積影響。合格的10mL容量瓶（A級(jí)）最大允差為±0.02mL［13］。假定為三角形分布，由容量瓶校準(zhǔn)對(duì)體積影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.02mL/=0.008 2mL；實(shí)驗(yàn)溫控在20℃±5℃，又水膨脹系數(shù)0.00021L/℃，因此產(chǎn)生的體積變化為±（10×5×0.000 21）mL=±0.011mL，假定溫度變化為矩形分布，則由溫度對(duì)體積影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.011mL/=0.006 4mL；通過(guò)多次充滿10mL容量瓶至刻度并稱量的實(shí)驗(yàn)，得出由充滿容量瓶至刻度線重復(fù)性對(duì)體積影響引入的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02mL。

4.1.3擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

為了校準(zhǔn)液相色譜儀，配制莧菜紅系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行HPLC-DAD測(cè)定，以建立莧菜紅組分校正曲線，經(jīng)線性回歸得到各自的線性方程，見(jiàn)表1。表中，A為峰面積；X為樣品的質(zhì)量濃度；R為線性相關(guān)系數(shù)；s為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Sxx為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的殘差的平方和；Sa斜率標(biāo)準(zhǔn)偏差；Sb為截距標(biāo)準(zhǔn)偏差。

配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液涉及移取1mL、2mL和10mL的容量瓶的莧菜紅溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用三次蒸餾水分別定容至10mL中，分別得到5mg/L、10mg/L、20mg/L、50 mg/L和100mg/L的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。計(jì)算5個(gè)工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的引入的總不確定度為

表1　莧菜紅組分的標(biāo)準(zhǔn)系列線性方程

葡萄酒的某個(gè)待測(cè)樣品定容溶液進(jìn)行了3次測(cè)定，由直線方程求得平均濃度，則X的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

由上述所得各參數(shù)，待測(cè)樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，計(jì)算2個(gè)不同質(zhì)量濃度樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度具體見(jiàn)表1，分別為0.24％和0.13％。

4.1.4樣品制備過(guò)程引入的不確定度

樣品制備的不確定度來(lái)源：（1）天平稱量引入的不確定度；（2）樣品定容體積引入的不確定度。

天平稱量不確定度來(lái)源包括：天平稱量最大允許誤差；天平稱量變動(dòng)性；浮力影響。葡萄酒樣品稱量使用0.01 mg分度的分析天平，天平的變動(dòng)性、檢定誤差等估計(jì)為0.05 mg，天平稱量變動(dòng)性及浮力影響（在常規(guī)狀態(tài)下稱重，此項(xiàng)可忽略）。純品稱重約5g，按矩形分布相對(duì)不確定度=（Δm/m）/= （0.05 mg/5 000 mg）/=0.002 9％。

定容體積不確定度來(lái)源包括：容量瓶校準(zhǔn)對(duì)體積影響；溫度對(duì)體積影響；容量瓶至刻度線重復(fù)性對(duì)體積影響。溶液配制定容體積為50mL，檢定合格的50mL容量瓶最大允差為±0.02mL［13，14］。假定為三角形分布，此項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.02mL/=0.008 2mL；本方法根據(jù)加入的3次水質(zhì)量計(jì)算溶液體積，所以需要考慮溫度對(duì)3次水體積的影響而引入的不確定度。實(shí)驗(yàn)溫度控制在（25±5）℃，純水膨脹系數(shù)為0.000 21 L/℃，因此產(chǎn)生的體積變化為（0.05 L×±5×0.000 21 L）× 1 000=±0.053mL，假定溫度變化為矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.053mL/=0.031mL；通過(guò)多次充滿50mL容量瓶至刻度并稱量的實(shí)驗(yàn)，得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02mL。綜上所述，定容體積引入的相對(duì)合成不確定度為0.080％。

4.1.5樣品測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度

在不確定度評(píng)定過(guò)程中，A類不確定度主要體現(xiàn)為樣品的測(cè)量重復(fù)性，對(duì)樣品進(jìn)行7次重復(fù)試驗(yàn)，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示樣品測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度。葡萄酒中莧菜紅質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

4.1.6回收率引入的不確定度

前處理過(guò)程對(duì)樣品回收率的影響所產(chǎn)生的不確定度，具體表現(xiàn)為7次測(cè)量樣品回收率平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差S（ρRec）［15］，基體加標(biāo)回收試驗(yàn)中樣品溶液各組分濃度均低于方法的報(bào)出限，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

當(dāng)t值大于或等于雙邊臨界值t（95％，6）=2.45時(shí)，則與1有顯著性差異，說(shuō)明fR需要被使用以修正結(jié)果；若t值小于t（95％，6），則fR不需要使用。葡萄酒樣品中莧菜紅組分顯著性差異結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)t值得到莧菜紅組分均無(wú)顯著性差異，不需要修正測(cè)試結(jié)果。

表2　葡萄酒中莧菜紅質(zhì)量濃度與回收率測(cè)定結(jié)果

4.2合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

葡萄酒中莧菜紅測(cè)量結(jié)果的不確定度來(lái)源很多，除了上述提及的不確定度分量，還有溫度效應(yīng)、玻璃膨脹系數(shù)等因素。由于這些分量引入的不確定度相對(duì)較小，本文中忽略不計(jì)。

根據(jù)上述分量，計(jì)算得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

相對(duì)擴(kuò)展不確定度為

兩個(gè)樣品質(zhì)量濃度的相對(duì)擴(kuò)展不確定度分別為2.6％和2.2％（k=2）。其中樣品重復(fù)性測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制是測(cè)定結(jié)果不確定度的重要來(lái)源。

5　結(jié)論

通過(guò)對(duì)葡萄酒樣品中莧菜紅組分測(cè)定過(guò)程的分析，測(cè)定結(jié)果的不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品制備、測(cè)量重復(fù)性和回收率6部分。本文對(duì)葡萄酒樣品中莧菜紅組分測(cè)定過(guò)程各步驟引入不確定度的采集和表述，可為胭脂紅、山梨酸、安賽蜜等其它食品添加劑測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度計(jì)算提供借鑒。

［1］Souquet J M，Labarbe B，Guerneve C L，et al.Phenolic composition of grape stems［J］.J Agric Food Chem，2000，48（4）：1076-1080.

［2］Ryan J M，Revilla E.Anthocyanin composition of cabernet sauvignon and tempranillo grapes at different stages of ripening［J］.J Agric Food Chem，2003，51 （11）：3372-3378.

［3］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB 15037—2006，葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［4］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 2760—2011，食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［5］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 2758—2012，發(fā)酵酒及其配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［6］謝婭黎，陳欣欣，馮勇，等.市售紅葡萄酒中甜味劑以及人工合成色素使用情況分析［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，35（12）：1482.

［7］Ma K，Wang H F，Zhao M，et al.Purity determination and uncertaintyevaluationoftheophyllinebymass balance method，high performance liquid chromatography and differential scanning calorimetry［J］.Analytica Chimica Acta，2009，650（2）：227-233.

［8］馬康，趙敏，王海峰，等.茶堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制與定值［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2011，30（4）：418-424.

［9］馮靜，王海嬌，何超君，等.高效液相色譜法測(cè)定地下水中苯并（a）芘的不確定度評(píng)定［J］.巖礦測(cè)試，2011，30（5）：617-622.

［10］國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJG10 59.1—2011，測(cè)量不確定度評(píng)定與表示［S］.

［11］ISO Guide35 2006Reference Materials-general and Statistical Principles for Certification［S］.

［12］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJG 646—2006，移液器檢定規(guī)程［S］.

［13］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJG 196—2006，常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］.

［14］馬康，楊亞楠，刑金京，等.誘惑紅溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制及不確定度評(píng)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012，31 （3）：296-301.

［15］李松，饒竹.氣相色譜法測(cè)定地下水中六六六結(jié)果的不確定度評(píng)定［J］.巖礦測(cè)試，2008，27（4）：295-298.

Uncertainty Evaluation for the Determination of Amaranthus Red in Wine Samples by High Performance Liquid Chromatography

MA Kang1，LI Xiao-Jia2，CUI Meng-meng3，MA Lian-di1
（1.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China；2.School of Chemistry and Biological，Beijing University of Science and Technology，Beijing 100083，China；3.College of Chemistry，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China）

Sources of measurement for amaranthus red in wine samples by high performance liquid chromatography are determined through studying the whole process of analytical results.The uncertainties of analytical result are evaluated by a metrological model of uncertainty.The standard uncertainty for analytical results for amaranthus red in wine samples is mainly consisted of uncertainty of solution reference material of amaranthus red，preparation of work standard solution，calibration curve using the least squares method，preparation for real wine sample，measured repeatability，method recovery and so on.Relative expanded uncertainties for two real wine sample with different content are evaluated and they are 2.6％ and 2.2％（k=2）.Evaluation of analytical results of two samples with different content indicated that main resource of uncertainty are measured repeatability and calibration curve.

Metrology；Amaranthus red；Wine；HPLC；Uncertainty

TB99

A

1000-1158（2015）01-0102-05

10.3969/j.issn.1000-1158.2015.01.22

2013-05-04；

2014-10-28

科技部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（2012104001）；科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2008FY130200）；中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院基礎(chǔ)科研業(yè)務(wù)費(fèi)（21-AKY1216）

馬康（1973-），男，陜西寶雞人，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院副研究員，研究方向?yàn)槭称诽砑觿┑臋z測(cè)。makang@nim.ac.cn