李斌 許曉亞 楊剛剛 崔晴晴 楊亞娟 徐存拴

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院　河南省一科技部共建細(xì)胞分化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地和河南省生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)　453007）

重組人白細(xì)胞介素-1α在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性檢測(cè)

李斌 許曉亞 楊剛剛 崔晴晴 楊亞娟 徐存拴

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院河南省一科技部共建細(xì)胞分化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地和河南省生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)453007）

在畢赤酵母中分泌表達(dá)重組人白細(xì)胞介素-1α（rhIL-1α），優(yōu)化rhIL-1α的發(fā)酵工藝及純化方法，以獲得高表達(dá)、高純度具有生物學(xué)活性的rhIL-1α。通過PCR擴(kuò)增獲得hIL-1α基因，構(gòu)建其真核表達(dá)載體pPICZαA/hIL-1α，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33，用PCR和SDS-PAGE方法篩選高效表達(dá)rhIL-1α的工程菌株并進(jìn)行Western blot鑒定，DEAE 弱陰離子離子交換層析一步純化表達(dá)產(chǎn)物，并用MTT法初步檢測(cè)其對(duì)人肝癌細(xì)胞7402的生物學(xué)作用。rhIL-1α在搖瓶規(guī)模下，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)4 d后表達(dá)量約為30 mg/L。Western blot檢測(cè)rhIL-1α的特異性結(jié)合，獲得純度約95%，收率40%左右的rhIL-1α，并證明rhIL-1α能夠抑制人肝癌細(xì)胞7402的增殖。構(gòu)建了重組hIL-1α的基因工程菌，并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性和功能奠定了基礎(chǔ)。

重組人白細(xì)胞介素-1α；畢赤酵母；表達(dá)；純化；人肝癌細(xì)胞

1972年，Gery等從人白細(xì)胞的培養(yǎng)上清中提取得到一種可溶性物質(zhì)，起初被命名為淋巴細(xì)胞激活因子或內(nèi)源性熱原質(zhì)、破骨細(xì)胞刺激因子、黑素瘤細(xì)胞生長抑制因子等，在1979年被統(tǒng)一命名為白細(xì)胞介素-1（IL-1）［1］。IL-1按其結(jié)構(gòu)不同分為IL-1α和IL-1β。IL-1α基因定位于2號(hào)染色體，含7個(gè)外顯子，IL-1α的前體是由IL-1α基因合成的、無信號(hào)肽的31 kD分子。IL-1α前體被Ca2+依賴的鈣蛋白激酶降解為17 kD的成熟體，等電點(diǎn)為5.3，IL-1β是由153個(gè)氨基酸以β-折疊的形式組成位于2號(hào)染色體，分子量約為17.5 kD，等電點(diǎn)為7.2。IL-1α和β在同一種屬中兩者的同源性只有20%-30%，但在不同種屬間具有較高同源性，分別為60%-70%和75%-78%［2，3］。IL-1α具有很重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值，文獻(xiàn)報(bào)道IL-1α在白血病、肝癌、黑色素瘤、胃癌等在內(nèi)的多種腫瘤中均有表達(dá)［4-6］，而其表達(dá)機(jī)制尚不清楚。臨床試驗(yàn)表明，50 ng/kg IL-1α可治療骨髓或干細(xì)胞移植期間早期血小板的減少［7，8］。頭頸部臨床試驗(yàn)III期發(fā)現(xiàn)，IL-1α具有重要的免疫治療作用（Cel-Sci Corp）。

目前，IL-1α主要通過原核表達(dá)系統(tǒng)［9］制備，而真核表達(dá)系統(tǒng)尚未見報(bào)道。由于原核表達(dá)體系存在產(chǎn)量低，操作復(fù)雜，后期復(fù)性困難等問題。為得到表達(dá)量高、活性高的IL-1α，更好地研究IL-1α的特性和功能，本研究利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)hIL-1α，在1 L搖瓶規(guī)模下對(duì)其進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化和分離純化方法探索，同時(shí)，對(duì)hIL-1α的活性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coli DH5α購自武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司，畢赤酵母X-33菌株和pPICZαA分泌型酵母表達(dá)載體購自Invitrogen公司，重組人白細(xì)胞介素-1α基因委托上海生工生物工程有限公司合成，兔多抗人IL-1α抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自Invitrogen公司，人肝癌細(xì)胞（Bel-7402）購自中科院上海細(xì)胞庫，RPIM1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司，胎牛血清購自杭州天杭生物科技有限公司，MTT、DMSO購自Geneview公司，限制性內(nèi)切酶Sac I、Bam H I和Eco R I等購自MBI公司，Protein Ladder購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，考馬斯亮藍(lán)G-250（分析純）購自中國醫(yī)藥公司，牛血清白蛋白（生化試劑）購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 人白介素-1α基因（hIL-1α）的設(shè)計(jì)及載體的構(gòu)建 在GenBank上搜索得到IL-1α基因的全序列（NM_000575），通過查閱文獻(xiàn)確定IL-1α蛋白的成熟序列，利用在線序列優(yōu)化工具對(duì)IL-1α核苷酸序列進(jìn)行人工優(yōu)化（http：//www.evolvingcode.net），在不改變氨基酸序列的情況下，密碼子替換為高頻使用或次高頻使用的密碼子［10］。人工合成優(yōu)化（終止序列調(diào)整、密碼子優(yōu)化并提高GC含量）后的IL-1α基因序列連接至T載體，進(jìn)行測(cè)序，用Eco RⅠ/ NotⅠ雙酶切IL-1α/pUC-T及質(zhì)粒pPICZαA，回收目的基因片段和載體片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆、提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果正確后進(jìn)行測(cè)序。以上操作由上海生工生物有限公司完成。

1.2.2 酵母分泌型表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/hIL-1α以Sac I線性化，按畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)中電轉(zhuǎn)化方法，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的X-33涂于含100 μg/mL博來霉素（Zeocin）的YPD平板上，28℃培養(yǎng)3 d至長出菌落，在YPD平板上隨機(jī)挑取8個(gè)克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取酵母基因組DNA，以之為模板，PCR鑒定目的基因是否整合到酵母染色體。

1.2.3 rhIL-1α 搖瓶規(guī)模表達(dá) 隨機(jī)挑取1個(gè)鑒定正確的菌種接種到10 mL YPG培養(yǎng)基/50 mL三角瓶中，于28℃、250 r/min搖床培養(yǎng)18-24 h，當(dāng)OD值達(dá)到10時(shí)，取1 mL菌液，接種到100 mL BMGY培養(yǎng)基/1 L三角瓶中，于28℃、280 r/min繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為1%（V/V）的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)條件調(diào)整為28℃、200 r/min。每12 h補(bǔ)加一次甲醇，補(bǔ)加量為發(fā)酵液體積的1%（V/V）。分別取誘導(dǎo)24、48、72、96、120、144、168h的發(fā)酵液于12 000 r/min離心15 min，取1 mL上清進(jìn)行三氯乙酸（TCA）后，進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。

1.2.4 rhIL-1α搖瓶發(fā)酵規(guī)模條件優(yōu)化

1.2.4.1 最佳體積和轉(zhuǎn)速試驗(yàn) 畢赤酵母是好氧微生物，溶解氧濃度對(duì)菌體的生長和產(chǎn)物的表達(dá)有很大的影響，溶氧過低會(huì)抑制菌體生長，過高則會(huì)促進(jìn)菌體的新陳代謝加快，加速菌體死亡，造成蛋白過早降解，不利于目的蛋白積累。轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)是改變發(fā)酵過程中溶解氧的重要方式，較高的轉(zhuǎn)速會(huì)提高氧的體積系數(shù)，增加發(fā)酵液中氧的供給，但同時(shí)會(huì)加劇細(xì)胞的死亡速率，降低產(chǎn)物的表達(dá)量［11］。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下正交實(shí)驗(yàn)研究在1 L搖瓶條件下rhIL-1α誘導(dǎo)表達(dá)的最佳裝液量和轉(zhuǎn)速，參數(shù)設(shè)置如下：體積設(shè)置：100 mL、200 mL、300 mL；轉(zhuǎn)速設(shè)置：100 r/min、200 r/min、300 r/min。以上實(shí)驗(yàn)每組設(shè)定3次重復(fù)，在誘導(dǎo)最佳時(shí)間進(jìn)行取樣，SDSPAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，確定誘導(dǎo)表達(dá)的最佳體積和轉(zhuǎn)速。

1.2.4.2 最佳pH試驗(yàn) 酵母菌生長最適pH范圍為3.0-7.0，pH過低會(huì)影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，過高則會(huì)抑制菌體中某些酶的活性［12］，通過調(diào)節(jié)初始pH值來考察pH對(duì)rhIL-1α表達(dá)的影響。本研究設(shè)定pH梯度為：4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。每組設(shè)定3次重復(fù)。

1.2.4.3 最佳溫度試驗(yàn) 一般而言，畢赤酵母的最佳生長溫度為28-30℃，當(dāng)溫度升高到32℃時(shí)畢赤酵母菌株不能正常生長，溫度對(duì)畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物的活性、發(fā)酵液的物理性質(zhì)及合成方向等有重要的影響。研究表明，在發(fā)酵過程中，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)的溫度低于菌體生長時(shí)的溫度更加有利于蛋白的表達(dá)［13］。為此本實(shí)驗(yàn)對(duì)rh IL-1α溫度優(yōu)化為20℃、23℃、26℃、29℃。

1.2.4.4 最佳甲醇濃度試驗(yàn) 在畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)過程中，甲醇作為誘導(dǎo)劑和碳源雙重身份影響目的蛋白的表達(dá)，過低或者過高均影響目的蛋白的表達(dá)，因此合適的甲醇濃度是提高外源蛋白表達(dá)量的又一個(gè)關(guān)鍵因素。文獻(xiàn)報(bào)道［14，15］，甲醇添加量一般為0.5%-1%。為了研究在1 L搖瓶條件下誘導(dǎo)表達(dá)的最佳甲醇濃度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了0.25%、0.5%、0.75%、1%四個(gè)梯度。

1.2.5 rhIL-1α的分離純化 取誘導(dǎo)4 d的發(fā)酵液于4℃，4 000 ×g離心30 min，收集上清進(jìn)行10 kD超濾濃縮。取蛋白濃縮液進(jìn)行DEAE弱陰離子交換層析柱進(jìn)行純化。用buffer A（10 mmol/L Na2HPO4pH8.0）平衡柱子，樣品以1 mL/min的流速流穿離子交換樹脂，然后用buffer B（buffer A中含有0-500 mmol/L NaCl pH8.0）進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測(cè)儀監(jiān)控，收集各洗脫峰，SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 rhIL-1α蛋白免疫印跡檢測(cè) 蛋白免疫印跡按Towbin等方法［16］進(jìn)行。rhIL-1α進(jìn)行SDS-PAGE后，將rhIL-1α轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用IL-1α兔多抗一抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，再與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，超敏ECL底物發(fā)光顯色，用Typhoon 7500掃描儀和圖像定量軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.7 考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）測(cè)定蛋白濃度 以純的牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL試管中，加水至1 mL，然后加入4 mL的G-250溶液，混勻，靜止10 min，在595 nm處測(cè)其吸光值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線［17］。取樣品溶液0.2 mL，做3個(gè)重復(fù)，以水作空白對(duì)照，測(cè)其吸光值，并計(jì)算蛋白濃度。

1.2.8 rhIL-1α的生物學(xué)活性檢測(cè) 人肝癌細(xì)胞7402（Bel-7402）于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，于3 000個(gè)/孔接種至96孔板中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，更換含有不同濃度rhIL-1α（0、5、10、15、20 ng/mL）的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，搖動(dòng)培養(yǎng)板5 min，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶全部溶解，用Biotek reader酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)其吸收值，檢測(cè)rhIL-1α對(duì)Bel-7402細(xì)胞增殖的影響。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pPICZαA/hIL-1α的構(gòu)建和鑒定

用堿裂解法提取hIL-1α質(zhì)粒，并分別進(jìn)行單雙酶切和PCR擴(kuò)增，1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果（圖1）顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ單酶切后出現(xiàn)一條5 kb左右條帶。Bam H I和Eco RⅠ雙酶切后出現(xiàn)4 kb和500 bp左右的2條帶。用載體通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出現(xiàn)一條1 kb左右的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期片段大小一致，經(jīng)上海生工生物公司測(cè)序證明其序列正確。

圖1 rh IL-1α三種不同表達(dá)載體質(zhì)粒鑒定結(jié)果

2.2 rhIL-1α的表達(dá)與鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/hIL-1α轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌X-33后，在YPD平板上隨機(jī)挑取8個(gè)克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取基因組后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2-A），8個(gè)轉(zhuǎn)化子在1 000 bp位置均出現(xiàn)預(yù)期條帶，證明hIL-1α基因已經(jīng)整合到酵母基因組中。對(duì)鑒定正確的重組菌株進(jìn)行1L規(guī)模搖瓶篩選，取不同時(shí)間表達(dá)上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和Western blot鑒定，結(jié)果（圖2-B）顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約17 kD處出現(xiàn)考馬斯染色條帶，與hIL-1α的分子量一致，且在甲醇誘導(dǎo)第4 天表達(dá)量最高。經(jīng)Western blot鑒定（圖2-C），目的條帶均有陽性反應(yīng)，說明rhIL-1α正確表達(dá)。

圖2 rh IL-1α鑒定結(jié)果

2.3 rhIL-1α搖瓶條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基體積和轉(zhuǎn)速對(duì)rhIL-1α的影響 取X-33/pPICZαA/hIL-1α菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達(dá)到10時(shí)，將菌種分別接種于不同體積BMGY（100、200、300 mL）培養(yǎng)基中，于28℃，280 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600=2-6，分別取3瓶含100、200、300 mL培養(yǎng)基的三角瓶放于100 r/min的搖床培養(yǎng)；剩余6瓶分別放于200 r/min和300 r/min搖床培養(yǎng)（表1），每隔12 h添加甲醇至終濃度為1%，誘導(dǎo)4 d，取1 mL上清進(jìn)行TCA處理后，SDSPAGE電泳檢測(cè)（圖3）發(fā)現(xiàn)，隨著體積的增大，蛋白表達(dá)量降低，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，蛋白表達(dá)量優(yōu)于100 r/min和300 r/min。rhIL-1α發(fā)酵培養(yǎng)最佳體積和轉(zhuǎn)速為100 mL/L，200 r/min。

表1 培養(yǎng)基體積和轉(zhuǎn)速對(duì)rh IL-1α表達(dá)的影響

圖3 培養(yǎng)基體積和轉(zhuǎn)速對(duì)rh IL-1α表達(dá)的影響

2.3.2 pH對(duì)rhIL-1α表達(dá)的影響 分別取1 mL菌液，接種到pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的BMGY培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，SDS-PAGE檢測(cè)（圖4）表明，當(dāng)pH＜5.5時(shí)，隨著pH的降低，蛋白的表達(dá)量逐漸下降，當(dāng)pH＞5.5時(shí)，隨著pH的增大，蛋白的表達(dá)量顯著降低，在pH5.5時(shí)，rhIL-1α的表達(dá)量最高。

圖4 不同pH對(duì)rh IL-1α的影響

2.3.3 溫度對(duì)rhIL-1α表達(dá)的影響 rhIL-1α培養(yǎng)進(jìn)入誘導(dǎo)階段時(shí)，培養(yǎng)溫度分別更改為20、23、26、29℃，誘導(dǎo)96 h后，取發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果（圖5）表明，當(dāng)溫度為29℃時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量最低，當(dāng)溫度為26℃時(shí)，rhIL-1α表達(dá)量最高。

圖5 不同溫度對(duì)rh IL-1α的表達(dá)影響

2.3.4 甲醇濃度對(duì)rhIL-1α表達(dá)的影響 rhIL-1α進(jìn)入誘導(dǎo)期后，在26℃，200 r/min下培養(yǎng)，甲醇濃度分別設(shè)為0.25%、0.5%、0.75%、1.0%，結(jié)果如圖6所示，隨著甲醇濃度的增加，重組蛋白的表達(dá)量隨著提高，當(dāng)添加甲醇濃度為1%時(shí)，rhIL-1α的產(chǎn)量達(dá)到最高。

圖6 不同甲醇濃度對(duì)rh IL-1α的影響

2.4 rhIL-1α的分離純化

取誘導(dǎo)4 d發(fā)酵液，經(jīng)過離心→10 kD膜包濃縮→DEAE弱陰離子交換層析方法。收集各洗脫峰，SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在100 mm NaCl處可以洗脫下單一的目的蛋白（圖7）。蛋白純度為95%，經(jīng)Bradford法測(cè)定，蛋白收率為40%左右。

圖7 rh IL-1α各步分離純化SDS-PAGE分析

圖8 不同濃度rh IL-1α對(duì)Bel-7402細(xì)胞的影響

2.5 rhIL-1α抑制人肝癌細(xì)胞7402的增殖

不同濃度的rhIL-1α處理Bel-7402細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力，結(jié)果如圖8所示，10 ng/mL rhIL-1α處理細(xì)胞72 h后，與對(duì)照比有顯著的差異（P＜0.05），當(dāng)rhIL-1α的濃度為15、20 ng/mL時(shí)，與對(duì)照比有極顯著差異（P＜0.01）（圖8），表明rhIL-1α對(duì)人肝癌細(xì)胞7402具有一定的殺傷力，能抑制癌細(xì)胞的增殖生長。

3 討論

IL-1α作為重要的促炎性細(xì)胞因子參與多種生理活動(dòng)，如修復(fù)、增殖、凋亡、細(xì)胞遷移、分化、細(xì)胞壞死等，在角膜受損研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1α參與到NF-κB信號(hào)通路調(diào)控受損角膜的修復(fù)［18］。在非小細(xì)胞肺癌的胸腔積液中IL-1α處于一個(gè)高表達(dá)水平，它可作為潛在診斷非小細(xì)胞肺癌的生物標(biāo)志物［19，20］。研究表明，當(dāng)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）受中波紫外線（UVB）照射時(shí)，細(xì)胞分泌大量的IL-1α，IL-1α下調(diào)HaCaT細(xì)胞水通道蛋白3（AQP3）的表達(dá)，這一作用可能和皮膚光老化的發(fā)生有關(guān)［21］。李樹等［22］的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮膚受損修復(fù)過程中，IL-1α在受損早期有一次表達(dá)高峰，IL-1α可作為損傷早期時(shí)間推斷的一個(gè)指標(biāo)。因此，IL-1α在組織受損、腫瘤、自身免疫性疾病等方面具有重要的潛在臨床研究價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)選用畢赤酵母野生型X-33菌株，它具有生命力強(qiáng)、無回復(fù)突變、分泌能力強(qiáng)、能在YPD和最小規(guī)模培養(yǎng)基中生長等優(yōu)點(diǎn)［23］。根據(jù)酵母在密碼子上使用偏愛性，在不改變氨基酸序列的情況下，通過調(diào)整終止序列、提高GC含量對(duì)hIL-1α序列進(jìn)行優(yōu)化，把hIL-1α的成熟肽連在α-交配因子信號(hào)肽的C端，AOX1啟動(dòng)子誘導(dǎo)hIL-1α在畢赤酵母中分泌表達(dá)。蛋白產(chǎn)量與發(fā)酵條件密切相關(guān)，為此，本實(shí)驗(yàn)分別從裝液量、轉(zhuǎn)速、溫度、pH、甲醇濃度5個(gè)方面對(duì)rhIL-1α的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。研究表明，裝液量和轉(zhuǎn)速直接影響培養(yǎng)基中溶解氧的濃度，在發(fā)酵過程中，溶解氧濃度對(duì)外源蛋白的表達(dá)具有十分重要的影響，過高或過低都不利于蛋白的表達(dá)［24，25］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在裝液量為100 mL/1 L，轉(zhuǎn)速200 r/min時(shí)，蛋白表達(dá)量最高，過多的裝液量和過高的轉(zhuǎn)速均不利于蛋白的表達(dá)。也有研究表明，適當(dāng)?shù)纳邷囟龋欣诩?xì)胞的生長代謝和蛋白的表達(dá)，但溫度過高會(huì)使菌體提早衰老，降低蛋白的表達(dá)量［26］。本實(shí)驗(yàn)從20-29℃對(duì)rhIL-1α的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，蛋白產(chǎn)量增加，當(dāng)溫度＞26℃時(shí)，蛋白產(chǎn)量隨著下降。因此，在誘導(dǎo)階段適當(dāng)?shù)慕档蜏囟瓤梢詼p少菌體的死亡，同時(shí)也可保護(hù)蛋白不被降解［27］。pH是影響蛋白表達(dá)的又一關(guān)鍵參數(shù)，適宜的pH不僅有利于蛋白的表達(dá)，同時(shí)也可防止蛋白酶降解，易于后續(xù)的純化工作。結(jié)果表明，pH為5.5時(shí)，最有利于rhIL-1α的表達(dá)。在發(fā)酵過程中，定時(shí)定量地補(bǔ)加甲醇對(duì)蛋白的表達(dá)具有至關(guān)重要的影響［14，25］。過低不夠蛋白的表達(dá)，過高則會(huì)導(dǎo)致菌體死亡，降低蛋白產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇濃度的升高，蛋白產(chǎn)量隨著增加，在1%時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最多。

本研究用畢赤酵母表達(dá)hIL-1α，僅用一步層析純化，獲得純度高達(dá)95%以上的重組蛋白。與原核表達(dá)體系相比，減少了破壁、復(fù)性等復(fù)雜的純化步驟，提高蛋白的收率，降低了生產(chǎn)成本。對(duì)純化后的rhIL-1α進(jìn)行活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rh IL-1α能抑制Bel-7402細(xì)胞的增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［21，28，29］。本研究為深入探討IL-1α功能機(jī)理提供了良好的條件，同時(shí)也為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了rhIL-1α的畢赤酵母表達(dá)體系，對(duì)其搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，最適的發(fā)酵條件為裝液量為100 mL/1 L搖瓶、初始pH為5.5、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速200 r/min，誘導(dǎo)溫度為26℃，甲醇添加量為1%，每12 h補(bǔ)加一次，誘導(dǎo)4 d，最終獲得rhIL-1α的最高產(chǎn)量約30 mg/L，較優(yōu)化前提高了47.9%。用DEAE弱陰離子交換層析一步法對(duì)其進(jìn)行純化，得到純度高達(dá)95%，得率約40%，能抑制Bel-7402細(xì)胞增殖的rh IL-1α。

［1］ Dinarello CA. IL-1：disoveries， controversies and future directions［J］. Eur J Immunol， 2010， 40（3）：599-606.

［2］ Sims JE， March CJ， Cosman D， et al.cDNA expression cloning of the IL-1 receptor， a member of the immunoglobulin superfamily［J］. Science， 1988， 241（4865）：585-589.

［3］Chizzonite R， Truitt T， Kilian PL， et al. Two high-affinity interleukin 1 receptors represent separate gene products［J］. Proc Natl Acad USA， 1989， 86（20）：8029-8033.

［4］劉海燕. 抗人IL-1α單克隆抗體及其應(yīng)用：中國， 20111011425-35. 9［P］. 2011-05-30.

［5］Apte RN， Voronov E. Is interleukin-l a good or bad‘guy’in tumor immunobiology and imnmnotherapy？［J］. Immunol Rev， 2008，222：222-241.

［6］DinareUo CA. Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1 family［J］. Annu Rev Immunol， 2009， 27：519-550.

［7］Dinarello CA， In Durum SK， Oppenheim JJ， Feldmann M. Cytokine reference：a compendium of cytokines and other mediators of host defense［M］. Boston：Academic Press， 2001：307-318.

［8］ Schoch P， Pomytkin I. A pilot study on the effect of interleukin-1 alpha on collagen deposition in aging skin［D］. Presentation abstract 12th Anti-Aging Medicine World Congress， 2014.

［9］林丹丹， 劉春亮， 包光明， 等. 小鼠IL-1α多克隆抗體的制備及應(yīng)用［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2011， 27（9）：1007-8738.

［10］Ari H， Markus A. Intracellular functions of N-linked glycans［J］. Science， 2001， 291：2364- 2369.

［11］茍萬曉， 衛(wèi)紅偉， 胡元森， 等. 畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)甲醇蛋白工藝條件的優(yōu)化［J］. 中國釀造， 2014， 33（7）：0254-5071.

［12］Charoenrat T， Ketudat M， Stendahl AH . Oxygen-limited fed-batch process：an altemative control for Pichia pastoris recombinant protein processes［J］. Bioproc Biosyst Eng， 2005， 27（6）：399-406.

［13］婁瑞娟， 羅立龍， 張霞， 等. 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展和前景展望［J］. 生物學(xué)雜志， 2010， 27（5）：1008-9635.

［14］閔兆升， 郭會(huì)明， 顏旭， 等. 巴斯德畢赤酵母（P. pastoris）高密度發(fā)酵研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2014（3）：42-49.

［15］劉紅， 潘紅春， 蔡紹皙， 等. 發(fā)酵條件對(duì)畢赤酵母表達(dá)重組人干擾素糖基化的影響［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2005， 21（1）：107- 112.

［16］Ronanos MA， Clare JJ， Beesleyk KM， et al. Recombinant borde tella pertussis pertactin（p69）from the yeast Pichia pastoris：Highlevel production and immun ologica l properties［J］. Vaccine，1991， 9：901-906.

［17］孫士青， 王少杰， 李秋順， 等. 考馬斯亮藍(lán)法快速測(cè)定乳品中蛋白質(zhì)含量［J］. 山東科學(xué)， 2011， 24（6）：6-14.

［18］Ming WP， Li MY， Dan J， et al. Inhibition of RAP1 enhances corneal recovery following alkali injury［J］. iOVS， 2015， 56（2）：711-721.

［19］ Li YY， Lian HN， Jia QZ， et al. Proteome screening of pleural effusions identifies IL1A as a diagnostic biomarker for non-small cell lung cancer［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2015， 457（2）：177-182.

［20］Rider P， Carmi Y， Voronov， et al. Interleukin-1alpha［J］. Semin Immunol， 2013， 25（6）：430-438.

［21］閆學(xué)文， 單士軍. 白細(xì)胞介素1α對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞、水通道蛋白3表達(dá)的調(diào)節(jié)［J］. 中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志， 2012， 11（4）：211-214.

［22］李樹， 王杰. 小鼠皮膚損傷修復(fù)過程中白細(xì)胞介素1α和白細(xì)胞介素1β變化與損傷時(shí)間是關(guān)系［J］. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)， 2008， 12（15）：2879-2882.

［23］Sygmund C， Gutmann A， Krondorfer I， et al. Simple and efficient expression of Agaricus meleagris pyranose dehydrogenase in Pichia pastoris［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2012， 94（3）：695-704.

［24］王治， 鄭甲， 唐詩哲， 等. 外源蛋白在巴斯德畢赤酵母中高效分泌表達(dá)的前沿技術(shù)［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2014， 33（3）：689-694.

［25］Zhu T， You L， Gong F， et al. Combinatorial strategy of sorbitol feeding and low-temperature induction leads to high-level production of alkaline β-mannanase in Pichia pastoris［J］. Enzyme and Microbial Technology， 2011， 49（4）：407-412.

［26］高敏杰， 史仲平. 甲醇營養(yǎng)型重組畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白過程的控制與優(yōu)化［J］. 中國化學(xué)工程學(xué)報(bào)， 2013， 21（2）：216-226.

［27］?elik E， ?al?k P， Oliver SG. Metabolic flux analysis for recombinant protein production by Pichia pastoris using dual carbon sources：Effects of methanol feeding rate［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2010， 105（2）：317-329.

［28］Swati A， Deepali C， Vijay C， et al. Polymorphisms in IL-1 gene cluster and its association with the risk of perinatal HIV transmission， in an Indian cohort［J］. Immunology Letters， 2013，153：1-8.

［29］Georgia P， Hilary ODC， Stephen GH， et al. IL1 A and IL4 signalling in human ovarian surface epithelial cells［J］. Journal of Endocrinology， 2011， 211：273-283.

（責(zé)任編輯 李楠）

Expression，Purification and Bioactivity of Recombinant Human Interleukin-1α Expressed in Pichia pastoris

Li Bin Xu Xiaoya Yang Ganggang Cui Qingqing Yang Yajuan Xu Cunshuan
（State Key Laboratory Cultivation Base for Cell Differentiation Regulation and Henan Bioengineering Key Laboratory，Henan Normal University，College of Life Science，Henan Normal University，Xinxiang453007）

This work is to secret and express human interleukin-1α（rhIL-1α）in Pichia pastoris and optimize the fermentation and purification process of rhIL-1α for obtaining the rhIL-1α with high-purity， high-expression and owing biological activity. The gene hIL-1α amplified by PCR was constructed into the eukaryotic expression vector pPICZαA/hIL-1α， and then it was transformed into the P. pastoris X-33 strain via electroporation.The engineering strain with high-expression of rhIL-1α was screened and assayed by the methods of PCR and SDSPAGE， further indentified by Western blot. The expressed product was purified by the DEAE Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography，and the bioactivity of it to human cancer Bel-7402 cell was initially assayed. Results showed that inducing rhIL-1α by methanol for 4 d at shaking flask level， the expression reached 30mg/L， the test by Western blot revealed that specific binding activity of rhIL-1α was detected；the purity of the rhIL-1α reached about 95% and the yield was about 40%；rhIL-1α inhibited the proliferation of Bel-7402 cells. In conclusion， recombinant engineering vector of rhIL-1α was successfully constructed， and it was highly expressed in P. pastoris， which lays groundwork for further study of its function and bioactivity.

recombinant human interleukin-1α；Pichia pastoris；expression；purification；Bel-7402 cell

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.035

2014-12-22

國家“973”前期研究專項(xiàng)（2012CB722304），河南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（142300413212，132300413208），河南省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（111100910600）

李斌，女，碩士，研究方向：微生物藥物研究與開發(fā)，E-mail：libin8806@163.com

徐存拴，男，教授，研究方向：微生物藥物研究與開發(fā)，E-mail：cellkeylab@126.com