王鳳梅馬利兵

（1.　包頭輕工職業(yè)技術(shù)學院，包頭　014030；2. 內(nèi)蒙古科技大學　數(shù)理與生物工程學院，包頭014010）

內(nèi)蒙古西部地區(qū)本土葡萄酒釀酒酵母發(fā)酵特性研究

王鳳梅1馬利兵2

（1.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學院，包頭014030；2. 內(nèi)蒙古科技大學數(shù)理與生物工程學院，包頭014010）

對內(nèi)蒙古西部地區(qū)分離得到的6株釀酒酵母進行了發(fā)酵特性的比較。首先對酵母進行了耐酒精、耐SO2、耐低溫、耐低pH、耐高糖和耐高鹽的測試，隨后進一步通過葡萄汁的發(fā)酵實驗，分析比較了菌株的發(fā)酵力、酒精度、殘?zhí)橇?、總酸和揮發(fā)酸含量等理化指標，最終篩選出兩株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，有望應用于內(nèi)蒙古西部地區(qū)特色葡萄酒的生產(chǎn)。

葡萄酒；釀酒酵母；發(fā)酵特性

酵母菌普遍存在于葡萄園葡萄葉片、果實、根際以及土壤團粒中，尤其是葉片和果實表面是各種酵母的天然棲息地。在傳統(tǒng)的葡萄和葡萄酒產(chǎn)區(qū)，酵母菌已逐漸適應了當?shù)氐臍夂驐l件、土壤條件和葡萄品種，再加上自然選擇的作用而形成適應于不同類型葡萄酒的菌系［1-3］。釀酒酵母菌的發(fā)酵特性因菌株的不同而存在明顯差異，菌株的不同導致利用的底物不同、生成的化學物質(zhì)不同，從而使葡萄酒的呈味物質(zhì)存在差異，賦予產(chǎn)品獨特的風味［4，5］。從釀造學的觀點來看，用本土菌種接種發(fā)酵或者與其他菌種相混合進行發(fā)酵，可以生產(chǎn)出具有地區(qū)特色的葡萄酒［6］。當?shù)貎?yōu)選的菌種由于適宜當?shù)氐娘L土環(huán)境，因而具有更強的發(fā)酵競爭力。

內(nèi)蒙古西部地區(qū)，屬中溫帶半干旱大陸性氣候，日照充足，干旱少雨，晝夜溫差大，有效積溫高，是我國的優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)。從當?shù)氐尼劸破咸鸦刂蟹蛛x具有優(yōu)良特性的葡萄酒酵母，對釀造具有地域特色和獨特風格的產(chǎn)地葡萄酒具有重要的價值。

本研究對分離自內(nèi)蒙古西部幾個葡萄酒產(chǎn)區(qū)的6株酵母菌進行耐受性實驗和發(fā)酵實驗，篩選適于工業(yè)生產(chǎn)應用的優(yōu)良酵母菌株，有望供地方特色葡萄酒生產(chǎn)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）［7］：酵母浸粉1%（W/V），蛋白胨2%（W/V），葡萄糖2%（W/V）。

1.1.2 實驗菌株 供試菌株為內(nèi)蒙古西部釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)通過分離鑒定得到6株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和1株商業(yè)酵母D254。

1.1.3 菌種活化和擴大培養(yǎng) 將保藏的釀酒酵母菌株分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃下培養(yǎng)48 h。隨后，將活化后的菌種按5%的接種量接種于已裝有100 mL YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃、轉(zhuǎn)速72 r/min搖床中培養(yǎng)。

1.1.4 葡萄汁 將新鮮、成熟的赤霞珠葡萄經(jīng)破碎壓榨，過濾取汁，葡萄汁含糖量228.1 g/L，總酸8.5 g/L，pH值3.3，添加總SO2約60 mg /L。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母耐受性分析 將滅菌的YEPD液體培養(yǎng)基10 mL加入帶有杜氏發(fā)酵管的試管中，分別在采用不同溫度（9℃、12℃、15℃、18℃）、不同pH值（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0），不同濃度的乙醇（10%vol、12%vol、16%vol、18%vol）、SO2（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L）、糖（30%、40%、50%、60%）、鹽（8%、10%、12%、14%、16%）條件下，按酵母終濃度106個/mL的量接種，做3個平行重復，25℃下培養(yǎng)3 d，觀察酵母菌的生長情況［8］。

1.2.2 發(fā)酵試驗 以赤霞珠為原料釀造葡萄酒，將原料破碎取汁。然后將活化的菌株以終濃度106個/mL的量接種于1 L的葡萄汁中，28℃靜置發(fā)酵。設置3個平行重復，每隔24 h，搖動瓶子，以驅(qū)除CO2，稱重。當失重量為24 h之前總重量的0.2%時，視為發(fā)酵終止。根據(jù)CO2失重量繪制發(fā)酵曲線，并測定各菌株發(fā)酵液的酒精度、總酸、揮發(fā)酸、殘?zhí)堑戎笜恕?/p>

1.2.3 檢測方法 參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》［9］，酒精度（20℃條件下）采用酒精計法、殘?zhí)橇坎捎觅M林試劑直接滴定法、總酸（以酒石酸計）采用指示劑法、揮發(fā)酸（以乙酸計）采用蒸餾法測定。

1.2.4 統(tǒng)計方法 各生化指標數(shù)據(jù)采用SPASS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。差異顯著性設為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 釀酒酵母耐受性試驗

2.1.1 酵母對低溫耐受性測試結(jié)果 菌株對低溫耐受性測試結(jié)果見表 1。由表 1可知，所有供試菌株均不能耐受 9℃以下的低溫，12℃時生長明顯受到抑制，各菌株對低溫的耐受性無明顯差異。

表1 菌株對低溫耐受性測試結(jié)果

2.1.2 酵母對低pH耐受性測試結(jié)果 由表 2可知，在pH為3.0-4.0時，所有供試菌株均能旺盛生長；而在pH為2.5時，則生長受到抑制，大部分菌株均能耐受pH2.0的酸度。菌株M59最低只能耐受pH2.5的環(huán)境，pH2.0時不能生長，耐受能力最弱。

表2 菌株對低pH耐受性測試結(jié)果

2.1.3 菌株對酒精耐受性測試結(jié)果 菌株對酒精耐受性測試結(jié)果見表 3。隨著酒精含量的增高，酵母菌的生長逐漸減弱。菌株在酒精含量為10%和14%時，均能正常生長。菌株M33和菌株M59不能耐受16%的酒精。菌株E42和E51的耐酒精能力最強。

表3 菌株對酒精耐受性測試結(jié)果

2.1.4 菌株對SO2耐受性測試結(jié)果 在生產(chǎn)葡萄酒過程中，葡萄原料較好的情況下，SO2使用量在30-100 mg/L；在葡萄原料相對較差的情況下，使用量不超過80-150 mg/L［10］。葡萄酒釀造中酵母菌株要求有較高的耐SO2能力。菌株對SO2耐受性測試結(jié)果見表 4，除M40外，所有供試菌株均能耐受200 mg/L的SO2。菌株M33、E51和D254的耐SO2能力最強。

表4 菌株對SO2耐受性測試結(jié)果

2.1.5 酵母對高糖耐受性測試結(jié)果 由表 5可知，所有供試菌株均可耐受50%的糖，糖濃度達到60%時不能生長，各菌株對高糖的耐受性無明顯差異。

表5 菌株對高糖耐受性測試結(jié)果

2.1.6 酵母對高鹽耐受性測試結(jié)果 由表 6可知，NaCl濃度在8%-10%時，所有供試菌株生長狀態(tài)良好；當濃度達到14%時，大部分的供試菌株不能生長，菌株M40能耐受14%的NaCl，耐受能力最強。

表6 菌株對高鹽耐受性測試結(jié)果

2.2 發(fā)酵試驗

2.2.1 發(fā)酵速率 不同酵母發(fā)酵速率變化曲線見圖1。從圖 1中可以看出，菌株E67、M40起酵遲緩，其余菌株起酵較快且起酵時間相差不大；發(fā)酵進行到48 h時，所有菌株的CO2失重量達到高峰，此時發(fā)酵速率最高，其后速率逐漸降低。

圖1 不同酵母發(fā)酵速率變化曲線

2.2.2 其他釀酒特性指標的測定 不同酵母發(fā)酵的葡萄酒的理化指標見表 7。據(jù)表 7可知，所有菌株發(fā)酵的葡萄酒的酒精度、殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸等指標均符合國家標準［11］，即葡萄酒的酒精度≥7%（vol），干葡萄酒殘?zhí)呛俊? g/L，揮發(fā)酸含量≤1.2 g/L。商業(yè)菌株D254與菌株E42和E51總CO2失重量、酒精度差異不顯著，但與其他菌株差異顯著。由此可知，6株本土酵母菌中E42和E51的總CO2失重量最高、產(chǎn)酒精能力比較強，雖然E51酒樣揮發(fā)酸比商業(yè)菌株D254高，但揮發(fā)酸含量均符合國家標準理化指標要求。

表7 不同酵母發(fā)酵的葡萄酒的理化指標

3 討論

釀酒酵母在發(fā)酵過程中會受到各種脅迫條件的影響，當脅迫條件超過細胞的生理功能極限時便會對細胞的生存能力和發(fā)酵過程產(chǎn)生負面的影響［12］。為了避免發(fā)酵過程受到阻遏或發(fā)生遲滯現(xiàn)象，要求酵母必須具備足夠的脅迫應答能力以抵御不良條件所造成的影響［13］。掌握菌株對脅迫條件的耐受性是進行工業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，為有針對性地選育菌株提供了依據(jù)。

在葡萄酒的釀造中，具有較高酒精耐性的酵母菌株是保證較高的酒精產(chǎn)率和發(fā)酵順利進行的前提條件。酒精濃度過高會對酵母產(chǎn)生毒性，抑制細胞的生長及發(fā)酵活性。所以，酵母的發(fā)酵能力很大程度上取決于它們自身耐酒精能力的大?。?4，15］。酒精耐受性不強可能會導致發(fā)酵緩慢或終止，糖不能被完全發(fā)酵，殘?zhí)橇枯^高。酒精耐受性是各種脅迫條件中國內(nèi)外研究最多的，張穗生等［16］研究了釀酒酵母酒精耐受性機理，邢建宇等［17］采用Plackett-Burman設計方法研究了培養(yǎng)基的成分對釀酒酵母生長以及乙醇耐受能力的影響。吳華昌等［18］從白酒窖池的酒糟中篩選出一株能耐18%乙醇的酵母菌株。本試驗中，商業(yè)酵母D254不能耐受18%的酒精，但菌株E42和E51在酒精含量為18%仍能生長，優(yōu)于商業(yè)酵母D254，酒精耐受力最強。

高滲透脅迫主要發(fā)生在發(fā)酵初期，糖是酒精發(fā)酵的基質(zhì)，高濃度的葡萄糖產(chǎn)生的滲透壓會抑制酵母菌的生長，因此要求釀酒酵母菌株應具有較高的高滲透耐受性。含糖量在12%-18%的葡萄汁起酵迅速，隨著糖濃度的升高，發(fā)酵逐漸受到抑制［19，20］。楊魯君等［21］從黃酒廠的麥曲、酒藥、發(fā)酵醪中分離到具有耐高滲透壓的釀酒酵母菌株。本試驗中的所有菌株均能耐受50%以下的葡萄糖濃度，不能耐受60%葡萄糖濃度。NaCl濃度較高時，使發(fā)酵醪具有較高滲透壓，同樣會引起酵母的一些變化，抑制酵母的生長繁殖和發(fā)酵性能［22］，試驗中的菌株除M40外，所有菌株均不能耐受14%的NaCl。

在本研究的酵母耐受性試驗中，商業(yè)菌株D254與供試菌株差異不顯著，并沒有體現(xiàn)它的優(yōu)越性。在釀酒酵母的篩選和評價試驗中，小容器發(fā)酵是非常關(guān)鍵的試驗手段，它必須在相同的發(fā)酵條件下，體現(xiàn)不同酵母對葡萄酒的分析和感官質(zhì)量的影響［23］。發(fā)酵試驗中各菌株發(fā)酵后的葡萄酒的理化指標均符合國家標準，菌株E42和E51具有良好的乙醇轉(zhuǎn)化能力。短時間的試驗無法對菌株做出全面的評價，其在中試和大生產(chǎn)中的發(fā)酵性能仍需多年大量的觀察和試驗。

4 結(jié)論

本研究分離的釀酒酵母各菌株對低溫和高糖的耐受性無明顯差異；菌株E59最低只能耐受pH2.5的環(huán)境，pH2.0時不能生長，耐受低pH值能力最弱；菌株E42和E51能耐受18%的酒精，耐酒精能力最強；E51和M33能耐受250 mg/L的SO2，耐SO2能力最強；菌株M40能耐受14%的NaCl，耐受鹽能力最強。發(fā)酵實驗中，菌株E67、M40的發(fā)酵遲緩，其余菌株無差異；菌株E42和E51產(chǎn)酒精能力最強。綜合比較，菌株E42和E51由于耐性優(yōu)良，產(chǎn)酒精能力強，是具有潛在應用價值的菌株。

［1］Fleet GH. Wine［M］. ASM Press， Washington， DC， 2001， 747-772.

［2］Torija MJ， Rozes N， Poblet M， et al. Yeast population dynamics in spontaneous fermentations：comparison between two different wineproducing areas over a period of three years［J］. Antonie van Leeuwenhoek， 2001， 79（3-4）：345-52.

［3］Granchi L， Ganucci D， Messini A， Vincenzini M. Oenological properties of Hanseniaspora osmophila and Kloeckera corticis from wines produced by spontaneous fermentations of normal and dried grapes［J］. FEMS Yeast Research， 2002， 2（3）：403-407.

［4］Lambrechts MG， Pretorius IS. Yeast and its importance to wine aroma-a review［J］. South -African Journal for Enology Viticulture，2000（21）：97-129.

［5］Fleet GH. Yeast interactions and wine flavor［J］. International Journal Food Microbiology， 2003， 86（1-2）：11-22.

［6］ Heard G. Novel yeasts in winemaking looking to the future［J］. Food Australia， 1999， （51）：347-352.

［7］Barnett JA， Payne RW， Yarrow D. 酵母菌的特征及鑒定手冊［M］.胡瑞卿， 譯. 青島：青島海洋大學出版社， 1984.

［8］苑偉， 王學鋒， 劉延琳. 優(yōu)選釀酒酵母菌株發(fā)酵性能研究［J］.中國釀造， 2010（9）：48-52.

［9］GB/T 15038—2006. 葡萄酒、果酒通用分析方法［S］. 北京：中國標準出版社， 2006.

［10］ Roger BB， Singleton VL， Hada FB， et al. 葡萄酒釀造學——原理及應用［M］. 趙光鰲， 譯. 北京：中國輕工業(yè)出版社， 2001：103-107.

［11］GB15037-2006. 葡萄酒［S］. 北京：中國標準出版社， 2006.

［12］Carrasco P， Querol A， del Olmo M. Analysis of the stress resistance of commercial wine yeast strains［J］. Archives of Microbiology，2001， 175（6）：450-457.

［13］ Ivorra C， Pérez-Ortín JE， del Olmo M. An inverse correlation between stress resistance and stuck fermentations in wine yeasts. A molecular study［J］. Biotechnology and Bioengineering， 1999， 64（6）：698-708.

［14］吳帥， 肖冬光， 原通磊， 等. 高耐性釀酒酵母菌種的篩選［J］.釀酒科技， 2006， 147（9）：37-40.

［15］張強， 郭元， 韓德明. 釀酒酵母乙醇耐受性的研究進展［J］.化工進展， 2014， 33（1）：187-192.

［16］ 張穗生， 黃日波， 周興. 釀酒酵母乙醇耐受性機理研究進展［J］. 微生物學通報， 2009（10）：1604-1608.

［17］ 邢建宇， 楊莉. 培養(yǎng)基中各營養(yǎng)組分對釀酒酵母發(fā)酵的影響［J］. 食品研究與開發(fā)， 2011， 30（2）：139-142.

［18］吳華昌， 肖振， 鄧靜. 一株耐高濃度乙醇酒精酵母的篩選及發(fā)酵特性的研究［J］. 中國釀造， 2012（3）：111-114.

［19］Madhavan A， Srivastava A， Kondo A， et al. Bioconversion of lignocellulose-derived sugars to ethanol by engineered Saccharomyces cerevisiae［J］. Critical Reviews in Biotechnology， 2012， 32（1）：22-48.

［20］赫爾姆特， 漢斯等， 宋爾康譯. 葡萄酒微生物學［M］. 北京：輕工業(yè)出版社， 1989：16-26.

［21］楊魯君， 蔣予箭， 李余動. 黃酒酵母優(yōu)良抗逆菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵特性研究［J］. 中國食品學報， 2013， 13（9）：71-77.

［22］Chen CS. Wateractivity-concentration models for solutions of sugars， salts and acids［J］. Journal of Food Science， 1989， 54：1318-1321.

［23］李華. 小容器釀造葡萄酒［J］. 釀酒科技， 2002， 112（4）：70-74.

（責任編輯 李楠）

Fermentative Characteristics of Indigenous W ine Saccharomyces cerevisiae Isolated from W estern Area of Inner M ongolia

Wang Fengmei1Ma Libing2
（1. Baotou Light Industry Vocational Technical College；Baotou014030；2. School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science & Technology，Baotou014010）

This study compared the fermentative characteristics of 6 strains of Saccharomyces cerevisiae isolated from western area of Inner Mongolia. Firstly， the resistances of these strains on alcohol， SO2， low temperature， low pH， glucose and salt were tested；then fermentative experiment was performed by seeding these strains respectively into grape juice， the following physical and chemical indexes were measured and compared：the fermenting power of these strains， the alcoholic strength， the residual sugar， the content of total acid and volatile acid in fermentation liquor. On the basis of above experimental results， 2 strains of S. cerevisiae with excellent fermentative characteristics were screened，and they are expected to be utilized in producing indigenous wine in the western area of Inner Mongolia.

wine；Saccharomyces cerevisiae；fermentative characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.029

2015-01-14

國家自然科學基金項目（31160245）

王鳳梅，女，碩士，副教授，研究方向：發(fā)酵工藝研究；E-mail：maywfm@126.com

馬利兵，男，博士，教授，研究方向：細胞工程及基因工程；E-mail：413683527@qq.com