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（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院　亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧　530005；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心　廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所　農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室　廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，南寧　530007）

甘蔗工藝成熟期SS和SPS酶活性與糖分積累的相關(guān)性研究

牛俊奇1黃靜麗1趙文慧1楊麗濤1，2李楊瑞1，2

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧530005；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，南寧530007）

以工藝成熟期甘蔗品種GT28（早熟）和ROC22（早中熟）+1葉和不同節(jié)間為材料，分析SPS、SS合成和SS分解方向酶活性與節(jié)間糖分積累的相關(guān)性。結(jié)果表明，+1葉中SPS、SS合成和分解方向的酶活性比蔗莖中高，說明+1葉代謝活躍，是蔗莖糖分不斷積累的物質(zhì)基礎(chǔ)。節(jié)間SPS酶活性與節(jié)間錘度、可溶性總糖和蔗糖含量都正相關(guān)，GT28節(jié)間SPS酶活性比ROC22中高。節(jié)間SS合成方向酶活性與錘度和蔗糖含量都負相關(guān)，GT28中SS合成方向酶活性比ROC22中低。而SS分解方向酶活性與ROC22節(jié)間錘度、可溶性糖和蔗糖含量都呈負相關(guān)，與GT28中呈正相關(guān)，未達到顯著水平。說明成熟期節(jié)間SPS和SS合成方向酶活性提高有利于蔗糖的積累，而隨著節(jié)間成熟，蔗糖含量可能是促使SS酶活性由合成方向向分解方向轉(zhuǎn)化的一個重要調(diào)節(jié)因子。

甘蔗；蔗糖磷酸合成酶；蔗糖合成酶；蔗糖含量；相關(guān)性分析

甘蔗是重要的糖料和能源作物，我國甘蔗糖產(chǎn)量占全國食糖總產(chǎn)量的比例高達90%以上，在國民經(jīng)濟中占有重要地位［1］。甘蔗成熟莖以積累高濃度蔗糖為主，涉及到蔗糖的合成、分解和運輸?shù)壬磉^程，而調(diào)控蔗莖中蔗糖積累的關(guān)鍵性因素是存在于快速發(fā)育的莖細胞中蔗糖的跨膜運輸能力和蔗糖糖代謝相關(guān)酶的活性［2］。植物中與蔗糖代謝密切相關(guān)的酶主要有3類：蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）和轉(zhuǎn)化酶（Invertase，INV）。其中合成蔗糖酶類主要是SS合成方向和SPS，而分解蔗糖酶類主要是可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（Soluble acid invertase，SAI）、細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶（Cell wall invertase，CIN）、中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（Neutral/alkaline invertase，NI）和SS分解方向［3］。葡萄糖、果糖和蔗糖是糖積累的主要產(chǎn)物，而蔗糖代謝相關(guān)酶活力水平高低不僅影響含糖量，而且還決定“庫”器官中積累糖的成分。

SS是促使蔗糖進入各種代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。它是一種可逆酶，既能催化蔗糖合成，又可以催化蔗糖分解，其催化的反應(yīng)是：蔗糖+UDP ←→果糖+UDPG。在植物體中SS有3種存在方式，即存在于細胞質(zhì)中的可溶性SS、結(jié)合與細胞膜上的不溶性SS和結(jié)合于肌動蛋白細胞骨架上的不溶性SS。其中胞質(zhì)中的SS是蔗糖代謝途徑中的一個重要控制點，它的活性反映了植物體內(nèi)蔗糖積累的能力［4］。此外，SS還參與細胞分化與纖維細胞壁合成、調(diào)節(jié)淀粉合成以及提高植物抗逆性等各種生理活動［5］。

SPS是一個多基因家族，可以分為5大類，共4個家族：SPSⅠ（C家族）、SPSⅡ（A家族）、SPSⅢ（D家族）、SPSⅣ（D家族）和 SPSⅤ（B家族），由于SPSⅢ和SPSⅣ進化關(guān)系較近，而歸為同一家族［6］。SPS是植物體內(nèi)光合產(chǎn)物向蔗糖和淀粉分配的關(guān)鍵調(diào)控點，與蔗糖的積累呈正相關(guān)［7］。它與植物的株高和產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀密切相關(guān)［8］，并在植物抗逆，如抗寒、抗旱和耐鹽過程中起重要作用［9］。

目前對SPS和SS與甘蔗蔗糖積累的相關(guān)性研究的比較多，但大部分對SS酶活性研究僅限于合成方向，而對分解方面的酶活性研究的相對較少。本研究在前期分析SAI、CIN、NI和轉(zhuǎn)化酶抑制子與節(jié)間蔗糖積累相關(guān)性的基礎(chǔ)上，繼續(xù)以工藝成熟期甘蔗品種ROC22和GT28的+1葉和不同節(jié)間為材料，分析SPS、SS合成和SS分解方向酶活性與蔗糖積累相關(guān)性。本研究旨在探明工藝成熟期甘蔗糖代謝的關(guān)鍵酶SS和SPS活性，以及主要產(chǎn)物的變化規(guī)律，為進一步了解甘蔗SPS和SS酶活性變化與蔗莖中蔗糖積累之間的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 以甘蔗早熟高產(chǎn)高糖品種桂糖28（GT28）和早中熟高產(chǎn)高糖品種ROC22為材料。取材于2012年春種植于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院甘蔗資源圃的新植蔗，取材時間為2012年12月22日。采樣時以頂端第一片完全展開葉為+1葉，+1葉包裹的節(jié)為+1節(jié)，由+1節(jié)向下節(jié)間數(shù)逐漸增加［10］，分別取+1葉（L1）、+1節(jié)（I1）、+6節(jié)（I2）、+11節(jié)（I3）、+16節(jié)（I4）、+21節(jié)（I5）、+26節(jié)（I6）和+31節(jié)（I7）。每個小區(qū)取12株，把節(jié)間數(shù)相同節(jié)去皮，切碎混勻后取樣。重復(fù)3次。

1.1.2 儀器和試劑 節(jié)間錘度測定采用日本愛拓迷你數(shù)顯折射計PAL-1；酶活性和還原糖含量的測定采用美國伯騰Synergy H1全功能酶標(biāo)儀；蔗糖含量的測定采用美國Water公司Alliance2695高效液相色譜儀。乙腈、蔗糖均為色譜純，實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗糖分的測定

1.2.1.1 節(jié)間錘度 去掉甘蔗節(jié)間葉片和葉鞘，取節(jié)間少許莖汁滴于PAL-1數(shù)顯手持糖度計上，測定蔗汁錘度。測定時溫度為16-17.5℃。

1.2.1.2 蔗糖含量測定 將甘蔗節(jié)間去皮并切成小塊，用液氮研磨成均勻的粉末狀。稱取2.5 g粉末置于50 mL離心管，加入10 mL 80%乙醇。80℃水浴提取30 min，每隔5 min搖勻一次。12 000 r/min離心15 min，取上清。沉淀用10 mL 80%乙醇重復(fù)抽提2次。合并上清液于50 mL離心管中。將其置于90℃水浴鍋中水浴3 h（大約），揮發(fā)上清液至大約2 mL。吸取上清液定容到10 mL。用0.22 μm過濾除去雜質(zhì)，得到糖分提取液。采用HPLC法測定樣品中的蔗糖含量。色譜分析條件為：分析柱為YMC-Pack NH2carbohydrate column（250×4.6 mm，5 μm）、株溫40℃和流速1 mL/min，進樣量為20 μL。乙腈∶水為80∶20，時間20 min。

將上述糖分提取液進行適度稀釋后，采用硫酸蒽酮法測定樣品中的可溶性總糖含量。

1.2.2 酶的提取和測定 準(zhǔn)確稱取用液氮研磨的2 g粉末放入10 mL離心管中，加8 mL酶提取液，在冰上震蕩提取30 min。于4℃，15 000 r/min離心10 min，取上清液4 mL放入2 mL離心管中。SPS酶活性測定參照Gutiérrez-Miceli［11］，而SS分解方向和合成方向酶活性測定參照Sch?fer等［12］的方法，并略做改動。

1.2.3 統(tǒng)計分析 采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 15.0進行顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 甘蔗節(jié)間錘度分析

隨著節(jié)間數(shù)的增加，GT28和ROC22的節(jié)間錘度整體上都呈逐漸增加的趨勢（圖1）。在相同節(jié)間，GT28節(jié)間錘度都高于ROC22中，且達到顯著差異水平。GT28和ROC22上部節(jié)間（+6-+16）平均錘度/下部節(jié)間（+21-+31）平均錘度比值分別為0.94和0.95，說明兩個品種都已達到工藝成熟期。

圖1 甘蔗不同節(jié)間錘度分析

2.2 甘蔗不同組織中可溶性總糖和蔗糖含量變化分析

在甘蔗工藝成熟期，GT28和ROC22從+1葉到+31節(jié)可溶性總糖含量整體上呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，其中+1葉、+1節(jié)間和+6-+31節(jié)間之間，可溶性總糖含量均達到極顯著差異水平（圖2-A）。在GT28中，從+1葉到+31節(jié)間蔗糖含量逐漸增加趨勢，蔗糖含量在+31節(jié)達到最大。而在ROC22中節(jié)間蔗糖含量整體上也呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，但在+21節(jié)和+31節(jié)蔗糖含量有所降低（圖2-B）。在2個品種的相同節(jié)間，GT28中可溶性總糖和蔗糖含量都顯著大于ROC22中的蔗糖含量，這可能與GT28比ROC22品種早熟有關(guān)，而在+1葉中可溶性總糖和蔗糖含量在兩個品種間均無明顯差異。

圖2 工藝成熟期甘蔗+1葉和不同節(jié)間可溶性糖（A）及蔗糖（B）含量變化

2.3 SS合成方向酶活性變化分析

在甘蔗工藝成熟期，ROC22中+1葉和節(jié)間SS合成方向酶活性都顯著高于GT28相同部位酶活性（圖3）。2個品種+1葉中SS合成方向酶活性都極顯著大于節(jié)間SS合成方向酶活性。從+1葉到+31節(jié)間，節(jié)間SS合成方向酶活性在兩個品種間整體上都呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。

2.4 SS分解方向酶活性變化分析

在甘蔗工藝成熟期，2個品種中SS分解方向酶活性在+1葉中的酶活性都極顯著差異于節(jié)間中的酶活性（圖4）。在ROC22中，+1葉中SS分解方向酶活性顯著大于GT28中的酶活性。從+1節(jié)間到+31節(jié)間，ROC22中SS分解方向酶活性表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢，除了+1節(jié)間SS分解方向酶活性顯著高于GT28中的酶活性外，其余節(jié)間SS分解方向酶活性均低于GT28中的酶活性。

圖3 工藝成熟期甘蔗+1葉和不同節(jié)間SS合成方向酶活性分析

圖4 工藝成熟期甘蔗+1葉和不同節(jié)間SS分解方向酶活性分析

2.5 SPS酶活性變化分析

在甘蔗工藝成熟期，GT28的+1葉和不同節(jié)間中SPS酶活性都高于ROC22相同部位的SPS酶活性，其中除了+11節(jié)間外，酶活性均達到顯著水平（圖5）。2個品種+1葉中SPS酶活性都高于節(jié)間中的酶活性。2個品種節(jié)間SPS酶活性整體上呈逐漸升高的趨勢。在GT28中，SPS酶活性逐漸升高，在+31節(jié)間達到最大，其中+1節(jié)間、+6-+11節(jié)間、+16-+21節(jié)間和+26-+31節(jié)間之間，SPS酶活性差異都達到極顯著水平，而在ROC22不同節(jié)間酶活性也表現(xiàn)出相同趨勢。這說明蔗莖從上部到下部節(jié)間SPS酶活性呈現(xiàn)梯度差異，而成熟節(jié)間SPS酶活性提高，有利于高濃度的蔗糖積累。

圖5 工藝成熟期甘蔗+1葉和不同節(jié)間SPS酶活性分析

2.6 節(jié)間蔗糖分與SS和SPS相關(guān)性分析

在蔗莖中，GT28和ROC22節(jié)間錘度、可溶性總糖和蔗糖含量之間都呈極顯著正相關(guān)（表1）。2個品種SPS酶活性與節(jié)間錘度、可溶性總糖和蔗糖含量也呈顯著正相關(guān)。ROC22中SS合成方向酶活與節(jié)間錘度、可溶性總糖和蔗糖含量呈極顯著負相關(guān)，而在GT28中除節(jié)間可溶性總糖沒有達到顯著負相關(guān)外，節(jié)間錘度和蔗糖含量均達到顯著負相關(guān)。SS分解方向酶活性，在GT28中與節(jié)間錘度、可溶性總糖和蔗糖含量呈正向關(guān)，但未達到顯著水平，而在ROC22中，SS分解方向酶活性與節(jié)間錘度、可溶性總糖和蔗糖含量均達到極顯著負相關(guān)。而節(jié)間SS合成方向和分解方向酶活性均與SPS酶活性呈顯著負相關(guān)。

3 討論

在甘蔗工藝成熟期，GT28和ROC22 +1功能葉中SPS、SS合成和分解方向酶活性都高于莖中，且維持較高水平，說明此時+1葉片代謝仍然活躍，為蔗莖糖分不斷積累提供物質(zhì)基礎(chǔ)。甘蔗+1葉中可溶性總糖和蔗糖含量，都極顯著低于節(jié)間中的含量。而蔗糖由“源”葉中運輸?shù)礁收崆o中，主要是受蔗莖細胞中蔗糖代謝相關(guān)酶的活性和蔗糖的跨膜運輸能力調(diào)節(jié)，而不是作為源葉中輸出光合產(chǎn)物的能力和韌皮部運輸蔗糖的效率調(diào)節(jié)［2，13］。

表1 甘蔗節(jié)間SPS、SS合成方向和分解方向酶活性與蔗糖分的相關(guān)性分析

糖信號不僅能維持庫器官的生長，也是調(diào)節(jié)源庫代謝的信號分子。通過對庫器官蔗糖代謝相關(guān)酶活性的調(diào)節(jié)，進而影響庫器官中糖分的積累［14］。在甘蔗早熟品種GT28節(jié)間中SS合成方向酶活性都顯著低于早中熟ROC22中的酶活性，而其節(jié)間蔗糖含量高于ROC22中的蔗糖含量，說明早熟品種隨著蔗莖的成熟，節(jié)間蔗糖含量增加，從而抑制SS合成方向酶活性。而晚熟品種由于蔗糖含量低，SS合成方向酶活性仍然保持較高水平。相關(guān)性分析表明，2個甘蔗品種節(jié)間錘度、可溶性總糖和蔗糖含量都與SS合成方向酶活性呈顯著的負相關(guān)。這與Botha和Black［15］研究結(jié)果是一致的。

在甘蔗不同發(fā)育時期，4個甘蔗品種未成熟莖中SS合成方向酶活性都高于成熟莖中的酶活性，蔗糖含量是調(diào)節(jié)SS合成方向酶活性的重要因子［16］。在GT28中，+6-+31節(jié)間SS分解方向酶活性高于ROC22中的酶活性，說明隨著節(jié)間成熟蔗糖含量到達一定程度，可能會抑制SS合成方向酶活性，而SS分解方向酶活性被激活。相關(guān)性分析表明，ROC22中SS分解方向的酶活性與節(jié)間錘度、可溶性總糖和蔗糖含量都達到極顯著的負相關(guān)，而在GT28中呈正相關(guān)（未達到顯著水平），進一步說明節(jié)間SS分解方向酶活性可能受節(jié)間蔗糖含量的調(diào)節(jié)。目前已經(jīng)從甘蔗葉中分離到A、B和C三種SS酶類［17］，Sch?fer［12］研究表明甘蔗未成熟節(jié)間和成熟節(jié)間可能存在兩種不同的SS酶類，但它們?nèi)绾卧谡崆o蔗糖積累中發(fā)揮作用尚不清楚。

甘蔗莖中SPS酶活性與蔗糖的積累呈正相關(guān)［11，18］。在工藝成熟期，2個甘蔗品種SPS酶活性與節(jié)間錘度、可溶性總糖和蔗糖含量都呈正相關(guān)，且早熟高糖品種GT28中節(jié)間蔗糖含量和節(jié)間SPS酶活性都顯著高于ROC22相同節(jié)間蔗含量和SPS酶活性，這說明SPS酶活性不僅與節(jié)間蔗糖積累密切相關(guān)，而且與甘蔗的成熟度有關(guān)。陳蘭平等［19］的研究也表明，隨著蔗莖的成熟，SPS家族基因（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ）在高糖品種中的優(yōu)勢表達基因減少，而低糖品種中的優(yōu)勢表達基因增加，可能與低糖品種后期大量積累蔗糖有關(guān)。

轉(zhuǎn)化酶活性的降低、SPS酶活性的增加以及蔗糖合成酶分解活性的下降和合成活性的增加，是引起甜瓜果實蔗糖積累的主要內(nèi)在因子［20］。大豆籽粒中的蔗糖含量并非受某一種酶絕對調(diào)控，SPS活性與SS+AI+NI活性總和之差與籽粒中蔗糖的積累顯著正相關(guān)［21］，說明庫器官中糖分的積累過程是蔗糖合成和分解酶類共同協(xié)作進行調(diào)節(jié)的，而不是某類酶在單獨發(fā)揮作用［22］。本課題組前期研究結(jié)果表明，在甘蔗工藝成熟期節(jié)間蔗糖含量與節(jié)間SAI酶活性呈顯著負相關(guān)，與CIN酶活性呈顯著正相關(guān)，轉(zhuǎn)化酶抑制子基因在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶活性中發(fā)揮重要作用。這也說明甘蔗節(jié)間蔗糖積累，可能是蔗糖代謝相關(guān)酶共同調(diào)節(jié)而進行蔗糖積累的。因此研究甘蔗莖中錘度、可溶性糖含量和蔗糖含量及其與相關(guān)酶活性的變化，可為進一步研究甘蔗SS、SPS表達調(diào)控機理，提高甘蔗莖的含糖量，培育品質(zhì)優(yōu)異的甘蔗新品種提供參考。

4 結(jié)論

甘蔗節(jié)間SPS酶活性與錘度、可溶性總糖和蔗糖含量呈顯著正相關(guān)，且早熟高糖品種GT28中SPS的酶活性高于早中熟品種ROC22。節(jié)間SS合成方向酶活性與節(jié)間錘度和蔗糖含量都呈顯著負相關(guān)，GT28節(jié)間酶活性比ROC22中的低。而節(jié)間錘度、可溶性糖和蔗糖含量與ROC22中SS分解方向酶活性呈顯著的負相關(guān)，而與GT28中SS分解方向酶活性呈正相關(guān)，未達到顯著水平。這說明節(jié)間SPS和SS合成方向酶活性提高有利于蔗糖積累，而隨著節(jié)間成熟，蔗糖含量可能是促使SS合成酶由合成活性向分解活性轉(zhuǎn)化的一個重要調(diào)節(jié)因子。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Correlations Between Sucrose Accumulation and Activities of SPS，SS at Processing M aturing Stage of Sugarcane

Niu Junqi1Huang Jingli1Zhao Wenhui1Yang Litao1，2Li Yangrui1，2
（1. Agricultural College，Guangxi University State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning 530005；2. Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural SciencesSugarcane Research Center，Guangxi Academy of Agricultural SciencesKey Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement（Guangxi），Ministry of AgricultureGuangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Nanning530007）

The correlations between sucrose accumulation and activities of 3 enzymes viz， sucrose phosphate synthase（SPS）， sucrose synthase in the synthesis direction（SS-s）， and sucrose synthase in the cleavage direction（SS-c）were studied using the leaf+1 and 7 internodes of early-maturing cultivar GT28 and early-intermediate-maturing cultivar ROC22 at processing maturing stage of sugarcane. The results indicated that the activities of SPS， SS-s and SS-c in the leaf+1 were higher than those in stalks of both GT28 and ROC22， suggesting that the leaf+1 was vigorous and active for physiological metabolism， which was the substantial basis for continuous sucrose accumulation in stalks. The SPS activity in internode was significantly and positively correlated with the brix， total soluble sugar and sucrose content of internode， and it was higher in GT28 than in ROC22. Meanwhile， SS-s activity was significantly and negatively correlated with the brix and sucrose content in internode， and it was lower in GT28 than in ROC22. However， SS-c was significantly and negatively correlated with brix， total soluble sugar and sucrose content in the internode of ROC22， while positively in GT28 although it was not significant statistically. This suggests that SPS and SS-s activities promote the sucrose accumulation in the immature internodes；with the internode maturing， sucrose content might be an important regulatory factor to convert the SS activity from synthesis to cleavage direction.

sugarcane；sucrose phosphate synthase；sucrose synthase；sucrose accumulation；correlation analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.014

2015-01-16

國家“863”計劃課題（2013AA102604），廣西自然科學(xué)基金項目（2011GXNSFF018002，2013NXNSFAA019073），國家國際合作項目（2009DFA30820，2013DFA31600），廣西八桂學(xué)者和特聘專家專項經(jīng)費資助（2013）

作則介紹：牛俊奇，男，博士研究生，研究方向：甘蔗生理和分子生物學(xué)；E-mail：niujunqi3218@163.com

楊麗濤，女，博士，教授，研究方向：甘蔗生理生化和病蟲害研究；E-mail：liyr@gxu.edu.cn李楊瑞，男，博士，教授，研究方向：甘蔗育種和生物固氮研究；E-mail：liyr@gxaas.net