蘇子敬 李巧玲 黃程 謝成建 楊星勇

（重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶　4013321）

RNAi技術(shù)及其在真菌基因功能研究中的應(yīng)用

蘇子敬 李巧玲 黃程 謝成建 楊星勇

（重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶4013321）

RNA干擾是指在進(jìn)化過程中由高度保守的外源或內(nèi)源雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默的現(xiàn)象。RNAi技術(shù)作為一種高效、特異的基因阻斷技術(shù)，已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域，成為2l世紀(jì)的研究熱點(diǎn)之一。簡要綜述了RNAi的發(fā)現(xiàn)過程，作用機(jī)制，作用特點(diǎn)及其在真菌基因功能研究中的應(yīng)用前景，為相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。

RNA干擾；基因沉默；真菌；基因功能

RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)作為分子生物學(xué)研究中發(fā)展迅速的一種新興基因阻斷技術(shù)，目前已成為生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。它是一種進(jìn)化上保守的作用機(jī)制，廣泛存在于動物、植物和微生物中，包括真菌中的基因壓制（Gene quelling）現(xiàn)象、植物中的共抑制（Co-suppression）現(xiàn)象和動物中的基因干擾現(xiàn)象［1］。這些現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是通過反義RNA與正義RNA形成的dsRNA（Double-stranded RNA，dsRNA）分子，在細(xì)胞內(nèi)被切割成21-23 bp大小的siRNA（Small interference RNA），特異性降解與之同源的單個內(nèi)源靶基因的mRNA，從而阻斷基因表達(dá)，產(chǎn)生基因沉默［2，3］。近幾年發(fā)展的RNAi技術(shù)能夠高效特異的沉默功能基因，使生物體產(chǎn)生相應(yīng)的功能缺陷表型，以此確定基因的功能。隨著多種真菌如構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）和稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）等基因組測序計(jì)劃的完成，真菌基因功能的鑒定迫在眉睫［4］。RNAi技術(shù)以其特異、高效、廣泛性優(yōu)勢，被迅速應(yīng)用到真菌基因功能的研究領(lǐng)域中，逐漸成為一種具有潛力的基因功能研究技術(shù)。

1 RNAi的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)90年代初，Jorgensen研究組將一個強(qiáng)啟動子控制的色素合成相關(guān)基因——查耳酮合成酶基因（chs）轉(zhuǎn)入牽牛花中，試圖用轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段使紫色矮牽?；ǖ幕ǘ涓悠G麗，結(jié)果并未獲得預(yù)期的深紫色花朵，反而得到了斑駁狀花朵及白色的花。深入的研究證明，被轉(zhuǎn)入該植物中的chs基因與牽?；ㄖ信c該基因同源的色素基因的表達(dá)均受到了抑制，這種外源基因和自身同源基因均受到抑制的現(xiàn)象被命名為共抑制（co-suppression）現(xiàn)象［5，6］。

該現(xiàn)象同樣出現(xiàn)于真菌轉(zhuǎn)基因研究中。1994年，當(dāng)Cogoni等［7］把外源同源基因轉(zhuǎn)入脈孢菌（Neurospora）時，該基因及Neurospora自身的同源基因的表達(dá)均顯著性的下降，當(dāng)時把這種在真菌中發(fā)現(xiàn)的類似于共抑制的現(xiàn)象稱為“基因壓制”（Gene quelling）現(xiàn)象，但當(dāng)時并未明確其機(jī)制。

1995年，美國康乃爾大學(xué)的Guo和Kemphues博士等［8］發(fā)現(xiàn)由正義RNA和反義RNA形成的dsRNA均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中par-l基因的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)有力地沖擊了只有反義RNA形成的dsRNA才能有效地干擾具有同源序列的內(nèi)源基因的表達(dá)這一傳統(tǒng)觀念。然而由于當(dāng)時理論水平和實(shí)驗(yàn)依據(jù)的限制，這一現(xiàn)象并沒有得到合理的解釋。

1996年，Cogoni等［9］經(jīng)過深入的研究證實(shí)真菌中的gene quelling與植物中的基因沉默機(jī)理基本相同。

1998年，華盛頓卡耐基研究院的科學(xué)家Fire［10］和麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家Mello首次證實(shí)了Guo等發(fā)現(xiàn)的由正義RNA抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于在體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染了dsRNA而引發(fā)，并將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾（RNAi）。由于RNAi的作用，功能基因無法表達(dá)而使其相對應(yīng)的表型不能顯現(xiàn)，導(dǎo)致基因功能的缺失或減弱，因此又將此作用機(jī)制稱之為基因沉默（Gene silencing）。Fire和Mello的研究首次證明RNAi作用存在于生物界中，并因此獲得2006年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎［11］。

目前研究發(fā)現(xiàn)，很早以前RNAi就普遍存在于小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥和真菌等生物之中。在整個生物界進(jìn)化過程中，它既是一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象，又是一種保守的自我保護(hù)機(jī)制，因此又被稱為“基因組的免疫系統(tǒng)”。這種免疫機(jī)制的存在不僅能避免生物體的基因組受到諸如病毒基因的外源基因分子的干擾和襲擊，而且，也能通過實(shí)時定量地調(diào)控各階段基因的表達(dá)來控制和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化［12，13］。

2 RNAi的分子機(jī)制

RNAi一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便引起了研究者們的高度重視，如今已成為一種高效的“基因沉默”技術(shù)，并在此技術(shù)基礎(chǔ)之上衍生出了TALAN技術(shù)和CRISPR技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物的基因功能鑒定和功能基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域的研究，并且對dsRNA介導(dǎo)的基因沉默的分子機(jī)制的研究一直是生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。經(jīng)研究證明，RNAi的分子作用機(jī)制在包括動植物的高等真核生物細(xì)胞中與真菌細(xì)胞中不盡相同。在動植物細(xì)胞中，依據(jù)dsRNA分子的來源，存在兩種不同但又相關(guān)的RNAi途徑：siRNA途徑和miRNA（microRNA）途徑。siRNA是由外源RNA或外源載體等導(dǎo)入細(xì)胞后產(chǎn)生的一系列小RNA，它能與靶mRNA完全互補(bǔ)并使其降解［14，15］；miRNA是一類由含頸環(huán)結(jié)構(gòu)的前體RNA經(jīng)過Dicer酶酶切而形成的非編碼小RNA，它與靶mRNA的3'-非編碼區(qū)結(jié)合，抑制靶mRNA降解和翻譯表達(dá)，從而導(dǎo)致特定基因的沉默，而且大多數(shù)miRNA參與了生長與發(fā)育，生理代謝或壓力應(yīng)激過程［4，16，17］。在真菌細(xì)胞中，gene quelling屬于進(jìn)化上保守的siRNA途徑，即典型的RNAi途徑，而miRNA途徑尚未被發(fā)現(xiàn)［1，18］。另外，在粗糙脈胞菌中發(fā)現(xiàn)了第二種真菌基因沉默現(xiàn)象即減數(shù)分裂沉默（Meiotic silencing by unpaired DNA，MSUD），在第一次減數(shù)分裂前期，一段DNA在親本一方正常，另一方不存在，或在親本雙方不同從而產(chǎn)生了未配對的DNA，使同源染色體不能正常配對，導(dǎo)致減數(shù)分裂異常，未配對的DNA就發(fā)生了沉默。這種現(xiàn)象發(fā)生在染色體配對到子囊孢子形成時期，MSUD參與了生長發(fā)育周期，因此，可能與miRNA起源于同一種古老的沉默機(jī)制［4，15］。典型RNAi的分子機(jī)制作用途徑大致可分為起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段3個階段。

2.1 起始階段

dsRNA分為分子間雙鏈和分子內(nèi)雙鏈。分子間雙鏈?zhǔn)怯煞珠_的兩個獨(dú)立RNA分子互補(bǔ)形成，而分子內(nèi)雙鏈?zhǔn)怯梢粋€RNA分子回折，自身互補(bǔ)而形成。當(dāng)細(xì)胞中的dsRNA擴(kuò)增達(dá)到一定量時，外源或內(nèi)源性的dsRNA被一種dsRNA特異的核酸酶RnaseIII家族中的Dicer酶特異識別，并將其逐步切割成長約21-23 nt的dsRNA片段（siRNA）。siRNA是RNAi作用賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子，具有獨(dú)特的特征性結(jié)構(gòu)，其兩條單鏈末端分別為5'-PO3和3'-OH，該siRNA與所作用的靶mRNA具有高度的核苷酸序列同源性。此外，由于每條siRNA單鏈的3'末端均有2-3個突出的非配對的堿基殘基（圖1）［19-21］，所以其化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，無須像反義核苷酸那樣通過大量的化學(xué)修飾來提高半衰期，這也是細(xì)胞賴以區(qū)分真正的siRNA和其他小dsRNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖1 siRNA的結(jié)構(gòu)［19-21］

2.2 效應(yīng)階段

siRNA可與細(xì)胞質(zhì)中特定的酶形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC），siRNA、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶以及解旋酶是該復(fù)合體中的必備成分［22］。在RISC的作用下，siRNA解鏈成為單鏈，由其中的反義鏈特異識別目的mRNA并與之結(jié)合。一經(jīng)結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶就在靶mRNA的近中點(diǎn)位置切割目的mRNA，被切割的mRNA片段被核酸外切酶降解后無法正常編碼成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致功能缺失［23，24］。

2.3 擴(kuò)增階段

siRNA的反義鏈與靶mRNA的上游部分序列互補(bǔ)［25］。在依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的作用下，經(jīng)初級階段產(chǎn)生的siRNA分子在細(xì)胞內(nèi)能以自身反義鏈為擴(kuò)增引物，以目標(biāo)mRNA為模板，復(fù)制出新的dsRNA，新合成的dsRNA又可被降解成若干siRNA，這種新產(chǎn)生的siRNA（次級siRNA，secondary siRNA）又可形成更多的RISC復(fù)合物并作用于mRNA，使mRNA降解。這個過程使RNAi效應(yīng)得到放大［26，27］。

3 RNAi的特點(diǎn)

3.1 RNAi的高度特異性

siRNA與靶基因的mRNA在序列上嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對原則，研究發(fā)現(xiàn)，即使發(fā)生一個堿基的錯配，目的mRNA的沉默效率也會大大降低［28］。這種高精確度的序列特異性的識別能使dsRNA專一地降解與之同源的mRNA，從而精確沉默目的基因。

3.2 RNAi的高效性

細(xì)胞內(nèi)的RNAi途徑存在級聯(lián)放大效應(yīng)，極少量的dsRNA經(jīng)起始階段——效應(yīng)階段——擴(kuò)增階段的循環(huán)就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)。靶mRNA被降解之后，細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸聚合酶繼續(xù)催促dsRNA的合成并反復(fù)利用該dsRNA進(jìn)行基因沉默，以維持高效、特異靶向的干擾作用。RNAi對基因表達(dá)的抑制率可達(dá)90%以上，這種高效的抑制效率是傳統(tǒng)基因沉默實(shí)驗(yàn)技術(shù)所欠缺的［29，30］。

3.3 RNAi的遺傳性和傳播性

目前已有大量的資料證實(shí)，在低等生物中RNAi可以傳代，例如，在秀麗線蟲（C. elegans）中通過生殖細(xì)胞可以傳遞好幾代。另外，RNAi效應(yīng)可以在細(xì)胞和組織間擴(kuò)散，dsRNA可在生物體的不同組織間傳遞和維持［26，31］。

3.4 RNAi的不完全性

RNAi對基因表達(dá)水平的抑制是不完全的，只是引起了部分下調(diào)，利用基因表達(dá)水平減弱這種不完全的沉默效應(yīng)，可以對關(guān)鍵基因或致死基因的功能進(jìn)行詳細(xì)分析［32，33］。同時，可根據(jù)基因沉默效率的不同程度來研究不同基因表達(dá)水平所引起的表型變化等更為詳細(xì)的信息。且對于不同的基因其最低抑制率是不同的，例如根據(jù)抑制效率的多少，結(jié)合具體表型的變化來分析研究藥物靶標(biāo)［1，34］。

3.5 RNAi的可調(diào)控性

RNAi是可以在不同組織和不同階段進(jìn)行實(shí)時調(diào)控的。已有研究報道稱以可誘導(dǎo)型啟動子或組織特異型啟動子為骨架構(gòu)建RNAi載體，可以實(shí)現(xiàn)時間特異性和組織特異性的基因沉默，從而調(diào)控RNAi作用的產(chǎn)生［35］。例如，Carneiro 等［36］利用可誘導(dǎo)乙醇脫氫酶alc A啟動子調(diào)控報告基因多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶基因epg1的RNA沉默，由于選擇的碳源的差異，EPG的表達(dá)能被不同程度的上調(diào)或下調(diào)。

3.6 RNAi的序列專一性

RNAi具有序列專一性的特點(diǎn)，而不具有基因座專一性特點(diǎn)［31，37］，該序列專一性可應(yīng)用于基因家族的沉默表達(dá)。當(dāng)靶基因所在的基因家族中存在一個或幾個保守區(qū)域時，針對該保守區(qū)域設(shè)計(jì)的RNAi載體便可誘導(dǎo)整個基因家族的沉默。尤其是當(dāng)存在基因冗余現(xiàn)象而掩蓋了基因缺失突變體的表型時，采用RNAi技術(shù)可以避免基因互補(bǔ)［32］。

4 RNAi在真菌基因功能研究中的應(yīng)用

在生物體生長發(fā)育過程中，抑制或沉默特定基因的表達(dá)技術(shù)通常用來研究該基因在該生理過程中的作用。目前，基因敲除和反義RNA技術(shù)已成為基因功能研究中最常用且很成熟的基因阻斷技術(shù)。然而基因敲除技術(shù)，如通過同源重組進(jìn)行敲除，操作復(fù)雜，一次只能完成一個基因的敲除，若靶基因是生長必需基因，則對該基因的敲除會導(dǎo)致個體的早期死亡而無法進(jìn)行相關(guān)研究。同時，反義RNA技術(shù)抑制基因表達(dá)的效率較低，不利于目標(biāo)基因的研究。與基因敲除和反義RNA技術(shù)相比，RNAi作為一種高效、特異的基因阻斷技術(shù)，具有特異性、高效性、作用迅速性、高穩(wěn)定性、操作相對簡便、一次可研究多個基因等多方面的優(yōu)勢。目前RNAi正廣泛地應(yīng)用于功能基因組研究［38，39］，并顯示出非常廣闊的應(yīng)用前景。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，鐮刀菌（F. oxysporum）、稻瘟病菌及大麗輪枝菌等40多種真菌的基因組測序工作已完成，GenBank中積累了大量功能未知的真菌DNA序列［31，34］。鑒定與明確這些基因的功能及生物學(xué)特性已成為當(dāng)前研究中的熱點(diǎn)問題和前進(jìn)方向［40］。而功能基因的分析迫切需要一種高效、高通量技術(shù)來鑒定基因功能。RNAi技術(shù)可特異性地使特定基因沉默，其表現(xiàn)性狀類似于基因功能缺失產(chǎn)生的表型［41］，從而產(chǎn)生定向突變［42］。因此，RNAi技術(shù)以其快速、有效、能批量分析等優(yōu)勢，成為研究真菌基因功能的有效工具，在研究真菌的致病性及其營養(yǎng)生長方面尤為普遍［43］，如對炭疽桿菌（Colletotrichum graminicola）［44］、柄銹菌（Puccinia triticina）［45］、綠僵菌（Metarhizium anisopliae）［46］和擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）［47］等致病性的研究，以及對深綠木霉（Trichoderma atroviride）［48］菌絲生長的研究。

4.1 RNAi發(fā)夾結(jié)構(gòu)表達(dá)載體在真菌基因功能研究中的應(yīng)用

目前廣泛應(yīng)用于真菌基因功能研究的一種RNAi的方法是根據(jù)目的基因的反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)構(gòu)建可以誘發(fā)RNAi的發(fā)夾結(jié)構(gòu)載體，即hpRNA（Hairpin RNA）表達(dá)載體。該表達(dá)載體導(dǎo)入真菌細(xì)胞后，在通用啟動子Ptrpc作用下，反向重復(fù)序列會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩臂，兩臂之間由間隔序列相連，轉(zhuǎn)錄形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA，dsRNA被Dicer酶識別與加工后誘發(fā)目的基因沉默［15］。hpRNA表達(dá)載體于2002年首次應(yīng)用于新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）的RNAi研究中，以GFP作為間隔構(gòu)建RNAi發(fā)夾結(jié)構(gòu)表達(dá)載體，結(jié)果顯示表現(xiàn)完全突變表型的轉(zhuǎn)化子占總轉(zhuǎn)化子的7%-10%［49］。

為了更為高效地利用hpRNA表達(dá)載體研究真菌基因功能，發(fā)展了兩臂之間由真菌的內(nèi)含子相連以載體pSilent-1（圖2）為基礎(chǔ)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)表達(dá)載體，即ihpRNA表達(dá)載體。pSilent-1載體自身含有潮霉素抗性基因（Hygromycin resistant cassette）、多克隆位點(diǎn)和內(nèi)含子間隔區(qū)，從而大大簡化了載體構(gòu)建程序，成為發(fā)夾結(jié)構(gòu)表達(dá)載體構(gòu)建的有效骨架。Nakayashiki等［34］用ihpRNA表達(dá)載體研究絲狀真菌稻瘟病菌MPG1基因的功能，較普通的基因沉默技術(shù)，該沉默效率明顯提高，高達(dá)70%-90%，完全突變表型占10%-50%。2007年，Krajaejun等［50］發(fā)展了以pFANTAi4載體為骨架的ihpRNA表達(dá)載體，載體構(gòu)建利用Gateway技術(shù)，簡便、快捷、成功率高、對原始載體和目的片段的限制少，避免了困難和繁瑣的“酶切-連接”步驟，簡化了克隆步驟，而且沉默效率同樣很高。目前，ihpRNA表達(dá)載體在真菌基因功能研究中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，并且技術(shù)已經(jīng)成熟。如在莢膜組織胞漿菌（Histoplasma capsulatum）［51］、白腐真菌黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）［32］、亞麻銹菌（Melampsora lini）［52］、產(chǎn)黃青 霉（Penicillium chrysogenum）［53］和長孢黃萎病菌（Verticillium longisporum）［54］等許多真菌中都進(jìn)行了基因功能的研究。

圖2 沉默載體pSilent-1圖譜

4.2 反向雙啟動子系統(tǒng)RNAi載體在真菌基因功能研究中的應(yīng)用

針對大量單個基因或家族基因的基因功能的研究，若要構(gòu)建hpRNA表達(dá)載體，需要確定目的基因的方向，工作量大又耗時，而反向雙啟動子系統(tǒng)RNAi載體的構(gòu)建只需將目的基因非定性插入兩個啟動子之間，載體導(dǎo)入細(xì)胞后，靶基因就會在兩個反向雙啟動子的作用下分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄形成正義RNA鏈和反義RNA鏈，然后形成dsRNA，從而引起靶基因的沉默。這種載體非常適用于家族基因的沉默。

Nguyen等［55］利用含有TrpC啟動子（The tryptophan synthetase）和gpdA啟動子（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）兩個方向相反的雙啟動子結(jié)構(gòu)的pSD1（pSilent-Daul1）載體（圖3）研究了稻瘟病菌（M. oryzae）中所有涉及鈣離子信號通路的37個相關(guān)基因，他們將編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）的基因與靶基因融合后插入兩個啟動子之間，使其形成轉(zhuǎn)錄嵌合體，并通過熒光信號的減弱程度來檢測雙干涉對突變菌株的沉默效率。另外，Nguyen等［56］采用“building blocks method”將人工合成的由GH10和GH11兩個家族10個40 bp大小的內(nèi)切木聚糖酶目的基因形成的400 bp序列插入到反向雙啟動子系統(tǒng)PSD1G（pSD1-eGFP）載體的Eco R V位點(diǎn)構(gòu)成PSD1G-SDXYL沉默載體，從而使同源內(nèi)切木聚糖酶家族基因同時發(fā)生沉默，研究結(jié)果表明內(nèi)切木聚糖酶有利于稻瘟病菌在感病葉片中縱向穿透和水平侵染，而且在致病過程中是作為一個群體來發(fā)揮作用的。同時也證明了對于多基因同時沉默這種載體比hpRNA表達(dá)載體更有效。對單基因沉默，有研究報道其效率相對低些，可能是由于dsRNA形成率較低［15］。但是，Mu 等［57］在對靈芝（Ganoderma lucidum）的URA3基因進(jìn)行研究時，證明了反向雙啟動子系統(tǒng)沉默載體的沉默效率要比發(fā)夾結(jié)構(gòu)沉默率高，可達(dá)81.9%。另外，他們通過對URA3和laccase以及一個報告基因的共沉默，說明了反向雙啟動子系統(tǒng)沉默篩選率可能更高。因此，反向雙啟動子系統(tǒng)RNAi載體更適用于高通量的真菌基因功能的研究。

圖3 沉默載體pSilent-Dual1圖譜

4.3 siRNA或dsRNA直接導(dǎo)入真菌細(xì)胞應(yīng)用于真菌基因功能的研究

人工合成siRNA介導(dǎo)的RNAi在哺乳動物中的應(yīng)用非常普遍，但是其在真菌中的應(yīng)用報道卻很少見。Khatri 等［58］在研究構(gòu)巢曲霉的鳥氨酸脫羧酶ODC基因時利用23 nt的siRNA duplex處理萌發(fā)的孢子引起孢子萌發(fā)和芽管生長明顯減少，且培養(yǎng)18 h后沉默水平最高，并持續(xù)到培養(yǎng)48 h。而在哺乳動物中，人工合成siRNA介導(dǎo)的RNAi在數(shù)小時或1-2 d內(nèi)明顯激活并且可持續(xù)好多天［1］。但不可否認(rèn)該研究為真菌細(xì)胞RNAi提供了一種簡單、快捷的方法。Moazeni 等［37］采用修改后的PEG/LiAc方法將不同濃度的19 nt siRNA導(dǎo)入白色念珠菌（Candida albicans）細(xì)胞，來抑制EFG1基因的表達(dá)，結(jié)果顯示隨著siRNA濃度的降低抑制作用也減弱，1 μmol/L的siRNA能夠有效抑制EFG1基因的表達(dá)，其菌絲形成量明顯減少，且降低了芽管的生長率，而采用100 nmol/L siRNA時得到了滿意的結(jié)果。

Whisson等［59］通過脂質(zhì)體介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將150-300 bp大小的dsRNA直接導(dǎo)入致病疫霉菌（Phytophthora infestans）細(xì)胞，一種類似真菌的卵圓菌，促使inf1、edc14基因發(fā)生沉默，結(jié)果在轉(zhuǎn)染12-15 d后，由于原來的dsRNA不再完整但在基因沉默過程中會發(fā)生級聯(lián)放大效應(yīng)，從而使mRNA表達(dá)水平明顯降低。

上述3種研究真菌基因功能的方法，前兩種方法最常用，而將人工合成的siRNA或dsRNA直接導(dǎo)入真菌細(xì)胞的RNAi方法雖然方便、快捷，但在多數(shù)真菌中不能起到有效的沉默作用［15］。

5 展望

RNA技術(shù)自1998年揭示以來，在植物、真菌、線蟲等生物領(lǐng)域中取得了巨大成功，現(xiàn)已成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。在顯示出極大潛力的同時，在研究中也發(fā)現(xiàn)一些問題：（1）RNAi機(jī)制研究中：RISC組成成分如何，RISC與siRNA具體如何結(jié)合，靶向mRNA裂解過程中，除ATPase、解旋酶外，有沒有其他大分子的參與，它們之間是如何相互作用的，與RNAi相關(guān)的基因有哪些、相關(guān)基因如何調(diào)控這一過程等問題尚需闡明。（2）siRNA表達(dá)載體的設(shè)計(jì)：由于一些mRNA序列在翻譯之前可能掩藏在高度折疊的區(qū)域，或者與蛋白結(jié)合成牢固的復(fù)合體，從而干擾siRNA的特異性識別，導(dǎo)致siRNA并不能成功接近靶mRNA，完成降解過程。（3）如何保證導(dǎo)入的siRNA的穩(wěn)定性，避免細(xì)胞內(nèi)RNase的降解，仍是一個需解決的問題。（4）RNAi只需要靶基因的一小段序列，對于序列信息了解較少的真菌來說是一個優(yōu)勢，但可能會引起部分同源的非靶基因的沉默［1，56］。沉默突變體無法通過重新導(dǎo)入靶基因形成恢復(fù)突變體。（5）RNAi載體在基因組中的隨機(jī)插入可能會引起一些關(guān)鍵基因的插入突變從而影響表型，Nakayashiki等［34］在沉默稻瘟病菌PKS-like基因時，引起黑色素合成基因PKS的插入突變，導(dǎo)致菌落顏色發(fā)生改變。因此需要篩選大量的沉默突變子才能準(zhǔn)確分析斷定靶基因的功能。（6）RNAi技術(shù)常在細(xì)胞水平進(jìn)行研究，其對整個生物體的作用效果尚不明確，并且作用于mRNA的不同靶位時，RNAi的效應(yīng)機(jī)制存在差異。因此，應(yīng)用RNAi技術(shù)需考慮其可行性，安全性和穩(wěn)定性等問題。

盡管對RNAi的作用機(jī)制及應(yīng)用還不是很清楚，但必須承認(rèn)RNAi作為一種高效、特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，在功能基因組學(xué)上具有無窮的魅力，現(xiàn)已證明RNAi技術(shù)是一種無價的研究工具，在后基因組時代，可以更為快捷、有效地進(jìn)行基因組功能研究，分析基因的功能。而且，這種技術(shù)將支持功能基因組學(xué)去發(fā)現(xiàn)和鑒定更多參與疾病和病害過程的新基因，為人類在基因研究領(lǐng)域開辟新路徑。植物病原菌真菌是引起農(nóng)作物病害的最大群體，是全球糧食安全的一個常見又主要的威脅，給全世界的農(nóng)作物產(chǎn)量和市場化帶來了嚴(yán)重?fù)p失［60］，研究其致病基因，RNAi技術(shù)具有其他技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢。對于GenBank中積累的大量未知的真菌基因，RNAi技術(shù)可作為鑒定其功能的一種重要方法。另外，許多真菌如粗糙脈胞菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和構(gòu)巢曲霉等可作為模式生物應(yīng)用于多種領(lǐng)域［4］。相信通過對真菌RNAi機(jī)制進(jìn)行不斷地深入研究，RNAi技術(shù)必將會更加完善和成熟，從而更好地探討真菌與宿主間的相互作用，為疾病和病害防治提供新的策略［60］，同時也會加快分子微生物學(xué)領(lǐng)域甚或整個生物學(xué)領(lǐng)域的研究步伐，顯示出其廣闊的應(yīng)用前景。

［1］Nakayashiki H， Nguyen QB. RNA interference：roles in fungal biology［J］. Curr Opin Microbiol， 2008， 11（6）：494-502.

［2］Fire A. RNA-triggered gene silencing［J］. Trends Genet， 1999， 15（9）：358-263.

［3］張旭， 張樹彪， 金梅. RNA干擾在植物中的應(yīng)用［J］. 安徽農(nóng)學(xué)通報， 2011（7）：32-38.

［4］Nakayashiki H. RNA silencing in fungi：mechanisms and applications［J］. FEBS Lett， 2005， 579（26）：5950-5957.

［5］Napoli C， Lemieux C， Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans［J］. Plant Cell， 1990， 2（4）：279-289.

［6］Jorgensen R， Cluster P， English J， et al. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers：comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences［J］. Plant Mol Biol， 1996， 31（5）：957-973.

［7］Cogoni C， Romano N， Macino G. Suppression of gene expression by homologous transgenes［J］. Antonie Van Leeuwenhoek， Leeuw Int J G， 1994， 65（3）：205-209.

［8］ Guo S， Kemphues KJ. Par-1， a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos， encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed［J］. Cell， 1995， 81（4）：611-620.

［9］Cogoni C， Irelan JT， Schumacher M， et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation［J］. Embo J， 1996， 15（12）：3153-3163.

［10］Fire A， Xu S， Montgomery MK， et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］. Nature， 1998， 391（6669）：806-811.

［11］魏敏. RNA干擾及其應(yīng)用［J］. 科技與企業(yè)， 2011（11）：129.

［12］胡大林， 莊志雄， 何云. RNA干擾與基因沉默的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué)， 2005， 32（4）：46-48.

［13］Hammond SM， Boettcher S， Caudy AA， et al. Argonaute 2， a link between genetic and biochemical analyses of RNAi［J］. Science，2001， 293（5532）：1146-1150.

［14］Dugas DV， Bartel B. MicroRNA regulation of gene expression in plants［J］. Curr Opin Plant Biol， 2004， 7（5）：512-520.

［15］Dang YK， Yang QY， Xue ZH， et al. RNA interference in fungi：pathways， functions， and applications［J］. Eukaryot Cell， 2011，10（9）：1148-1155.

［16］Cerutti H， Ma XR， Msanne J， et al. RNA-mediated silencing in algae：biological roles and tools for analysis of gene function［J］. Eukaryot Cell， 2011， 10（9）：1164-1172.

［17］He L， Hannon GJ. MicroRNAs：Small RNAs with a big role in gene regulation［J］. Nat Rev Genet， 2004， 5（7）：522-531.

［18］樊榮輝， 武治印， 王永強(qiáng)， 等. RNAi技術(shù)及其在真菌基因功能研究中的應(yīng)用［J］. 菌物學(xué)報， 2010， 29（3）：315-320.

［19］Zamore PD. RNA interference：listening to the sound of silence［J］. Nat Struct Biol， 2001， 8（9）：746-750.

［20］Harborth J， Elbashir SM， Bechert K， et al. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs［J］. J Cell Sci， 2001， 114（24）：4557-4565.

［21］Nyk?nen A， Haley B， Zamore PD. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway［J］. Cell， 2001， 107（3）：309-321.

［22］Randall G， Grakoui A， Rice CM. Clearance of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003， 100（1）：235-240.

［23］Verma NK， Dey CS. RNA-mediated gene silencing：mechanisms and its therapeutic applications［J］. J Clin Pharm Ther， 2004， 29（5）：395-404.

［24］Mahmood-Ur-Rahman， Ali I， Husnain T， et al. RNA interference：The story of gene silencing in p lants and humans［J］. Biotechnology Advances， 2008， 26（3）：202-209.

［25］侯義龍. RNA干擾及其在植物上的應(yīng)用研究進(jìn)展與展望［J］.信陽師范學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版， 2010， 23（2）：316-320.

［26］Brantl S. Antisense-RNA regulation and RNA interference［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）- Gene Structure and Expression， 2002， 1575（1-3）：15-25.

［27］Lipardi C， Wei Q， Paterson BM. RNAi as random degradative PCR：siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs［J］. Cell， 2001， 107（3）：297-307.

［28］McManus MT， Sharp PA. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs［J］. Nat Rev Genet， 2002， 3（10）：737-747.

［29］Davenport RJ. A faster way to shut down genes［J］. Science，2001， 292（5521）：1469-1471.

［30］陳莉. 核酸干擾技術(shù)的應(yīng)用前景［J］. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2008， 21（10）：1009-1010.

［31］Singh N， Rajam M. RNA Interference and functional genomics in fungi［M］//Microorganisms in Sustainable Agriculture and Biotechnology. Springer Netherlands， 2012：773-792.

［32］Matityahu A， Hadar Y， Dosoretz CG， et al. Gene silencing by RNA interference in the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium［J］. Applied and Environmental Microbiology，2008， 74（17）：5359-5365.

［33］Liu H， Wang P， Gong G， et al. Morphology engineering of Penicillium chrysogenum by RNA silencing of chitin synthase gene［J］. Biotechnol Lett， 2013， 35（3）：423-429.

［34］Nakayashiki H， Hanada S， Quoc NB， et al. RNA silencing as a tool for exploring gene function in ascomycete fungi［J］. Fungal Genet Biol， 2005， 42（4）：275-283.

［35］Mouyna I， Henry C， Doering TL， et al. Gene silencing with RNA interference in the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus［J］. FEMS Microbiol Lett， 2004， 237（2）：317-324.

［36］Carneiro JS， de la Bastide PY， Hintz WE. Regulated gene silencing in the fungal pathogen Ophiostoma novo-ulmi［J］. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2013， 82：28-34.

［37］Moazeni M， Khoramizadeh MR， Kordbacheh P， et al. RNA-mediated gene silencing in Candida albicans：Inhibition of hyphae formation by use of RNAi technology［J］. Mycopathologia， 2012，174（3）：177-185.

［38］Chi JT， Chang HY， Wang NN， et al. Genomewide view of gene silencing by small interfering RNAs［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003， 100（11）：6343-6346.

［39］Thompson JD. Applications of antisense and siRNAs during preclinical drug development［J］. Drug Discov Today， 2002， 7（17）：912-917.

［40］Caracuel-Rios Z， Talbot NJ. Silencing the crowd：high-throughput functional genomics in Magnaporthe oryzae［J］. Mol Microbiol，2008， 68（6）：1341-1344.

［41］ 粟挺， 劉愛玲， 陳信波. RNA干擾載體構(gòu)建方法的研究進(jìn)展［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011（19）：1-4.

［42］Bachman J. Site-directed mutagenesis［M］// Lorsch J. Laboratory Methods in Enzymology：DNA. UD， USA：Academic Press， 2013， 529：241-248.

［43］Hofer U. Techniques and application RNAi ‘off-targets’ pathogen infection［J］. Nature Reviews Microbiology， 2014， 12（5）：314-315.

［44］ Oliveira-Garcia E， Deising HB. Infection structure-specific expression of beta-1， 3-glucan synthase is essential for pathogenicity of Colletotrichum graminicola and evasion of beta-glucan-triggered immunity in Maize［J］. Plant Cell， 2013， 25（6）：2356-2378.

［45］Panwar V， McCallum B， Bakkeren G. Host-induced gene silencing of wheat leaf rust fungus Puccinia triticina pathogenicity genes mediated by the Barley stripe mosaic virus［J］. Plant Molecular Biology， 2013， 81（6）：595-608.

［46］Wang YD， Yang PC， Cui F， et al. Altered immunity in crowded locust reduced fungal（Metarhizium anisopliae）pathogenesis［J］. PLoS Pathogens， 2013， 9（1）：e1003102.

［47］Barad S， Horowitz SB， Kobiler I， et al. Accumulation of the mycotoxin patulin in the presence of gluconic acid contributes to pathogenicity of Penicillium expansum［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2013， 27（1）：66-77.

［48］Carreras-Villasenor N， Esquivel-Naranjo EU， Manuel Villalobos-Escobedo J， et al. The RNAi machinery regulates growth and development in the filamentous fungus Trichoderma atroviride［J］. Molecular Microbiology， 2013， 89（1）：96-112.

［49］Liu H， Cottrell TR， Pierini LM， et al. RNA interference in the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans［J］. Genetics， 2002，160（2）：463-470.

［50］Krajaejun T， Gauthier GM， Rappleye CA， et al. Development and a app lication of a green fluorescent p rotein sentinel system for identification of RNA interference in Blastomyces dermatitidis illuminates the role of septin in morphogenesis and sporulation［J］. Eukaryot Cell， 2007， 6（8）：1299-1309.

［51］Rappleye CA， Engle JT， Goldman WE. RNA interference in Histoplasma capsulatum demonstrates a role for alpha-（1， 3）-glucan in virulence［J］. Mol Microbiol， 2004， 53（1）：153-165.

［52］Lawrence GJ， Dodds PN， Ellis JG. Transformation of the flax rust fungus， Melampsora lini：selection via silencing of an avirulence gene［J］. Plant J， 2010， 61（2）：364-369.

［53］Liu H， Wang P， Hu YH， et al. Construction of an RNAi expression vector and transformation into Penicillium chrysogenum［J］. Annals of Microbiology， 2014， 64（1）：113-120.

［54］Singh S， Braus-Stromeyer S， Timpner C， et al. Silencing of Vlaro2 for chorismate synthase revealed that the phytopathogen Verticillium longisporum induces the cross-pathway control in the xylem［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2010， 85（6）：1961-1976.

［55］Nguyen QB， Kadotani N， Kasahara S， et al. Systematic functional analysis of calcium-signalling proteins in the genome of the riceblast fungus， Magnaporthe oryzae， using a high-throughput RNA-silencing system［J］. Mol Microbiol， 2008， 68（6）：1348-1365.

［56］Nguyen QB， Itoh K， Van Vu B， et al. Simultaneous silencing of endo-β-1， 4 xylanase genes reveals their roles in the virulence of Magnaporthe oryzae［J］. Mol Microbiol， 2011， 81（4）：1008-1019.

［57］Mu DS， Shi L， Ren A， et al. The development and application of a multiple gene co-silencing system using endogenous URA3 as a reporter gene in Ganoderma lucidum［J］. PLoS One， 2012， 7（8）：e43737.

［58］Khatri M， Rajam MV. Targeting polyamines of Aspergillus nidulans by siRNA specific to fungal ornithine decarboxylase gene［J］. Medical Mycology， 2007， 45（3）：211-220.

［59］Whisson SC， Avrova AO， Van West P， et al. A method for doublestranded RNA-mediated transient gene silencing in Phytophthora infestans［J］. Mol Plant Pathol， 2005， 6（2）：153-163.

［60］Nunes CC， Dean RA. Host-induced gene silencing：a tool for understanding fungal host interaction and for developing novel disease control strategies［J］. Mol Plant Pathol， 2012， 13（5）：519-529.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

RNAi Technology and Its Application in Fungal Gene Functional Studies

Su Zijing Li Qiaoling Huang Cheng Xie Chengjian Yang Xingyong
（College of Life Sciences，Chongqing Normal University，Chongqing401331）

RNA interference （RNAi） is a phenomenon of post-transcriptional gene silencing triggered by highly conserved exogenous or endogenous double-strand RNA （dsRNA） during the evolution. RNAi， as an efficient and specific gene blocking technology， is widely applied to gene functional studies and the areas of treating infectious diseases and malignant tumors. RNAi has become one of the hotspots in the 21st century. This paper reviewed the several aspects of RNAi， including the history of discovering it， mechanism， characteristics， and the application prospects in fungal gene functional analysis， which may provide the theoretical basis for related researches.

RNA interference；gene silencing；fungi；gene function

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.008

2014-11-17

重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（cstc2012jjA80021），重慶市教委項(xiàng)目（KJ120604），重慶師范大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（2011XLZ09），重慶師范大學(xué)博士啟動金（12XLB002）

蘇子敬，男，碩士研究生，研究方向：植物內(nèi)生菌；E-mail：253197105@qq.com

謝成建，男，博士，副教授，研究方向：植物病理學(xué)；E-mail：xcj614@163.com