陳軍，樊繼鵬，2，謝鑫陟，2

（1.蘇州出人境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，江蘇蘇州215104；2.蘇州世標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，江蘇蘇州215104）

液質(zhì)聯(lián)用法測定葡萄酒中多菌靈、甲霜靈的殘留

陳軍1，樊繼鵬1，2，謝鑫陟1，2

（1.蘇州出人境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，江蘇蘇州215104；2.蘇州世標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，江蘇蘇州215104）

建立葡萄酒樣品中多菌靈和甲霜靈殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。調(diào)節(jié)樣品pH，用乙腈提取，經(jīng)氨基固相萃取柱凈化后，以多離子反應(yīng)檢測模式（MRM）進(jìn)行測定。多菌靈及甲霜靈最低檢出限為0.05 μg/L，在0.0 μg/L～5.0μg/L的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.999。多菌靈在葡萄酒中加標(biāo)回收率為60%～90%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）2.2%～12.6%；甲霜靈加標(biāo)回收率為80%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）2.0%～8.2%。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；甲霜靈；多菌靈；葡萄酒

近兩年，國內(nèi)外多次在葡萄酒中檢測出甲霜靈、多菌靈殘留，其中，甲霜靈（metalaxyl）屬苯基酰胺類高效低毒內(nèi)吸性殺菌劑［1-2］，主要應(yīng)用于葡萄酒霜霉病的防治［3］；多菌靈（Carbe-ndazim，MBC），是一種廣譜、內(nèi)吸附性殺菌劑，可有效預(yù)防葡萄白腐病、炭疽病、黑痘病、霜霉病、炭疽病等［4-9］。這兩類農(nóng)藥對人體存有致癌或致遺傳性疾病的風(fēng)險(xiǎn)［10］。因此，適時(shí)研究葡萄酒中甲霜靈、多菌靈檢測方法，對維護(hù)國內(nèi)外葡萄酒行業(yè)規(guī)范及健康發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的葡萄酒中農(nóng)藥殘留的檢測方法有液相色譜法［11］、氣相色譜法［12-13］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［14］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等［15］。但對于葡萄酒中同時(shí)檢測甲霜靈、多菌靈的檢測方法研究較少［3，7］。本研究通過固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄酒中甲霜靈殘留，能夠克服葡萄酒中基質(zhì)干擾大等因素，可以滿足葡萄酒中甲霜靈、多菌靈殘留的痕量檢測需求。

1　材料與方法

1.1儀器和設(shè)備

APITripleQuad4500超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：ABSCIEX公司；XS105天平：Mettler Toledo；NH2固相萃取柱：1 g/6mL，美國waters公司。

1.2試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

多菌靈（Carbendazim，標(biāo)準(zhǔn)品），甲霜靈（Metalaxyl，標(biāo)準(zhǔn)品），氯化鈉（Sodiumchloride，GR級），甲苯（Methylbenzene，HPLC級）皆購于百靈威科技有限公司；乙腈（Acetonitrile，HPLC級）購于上海安譜科學(xué)儀器有限公司；蒸餾水（蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心食品理化實(shí)驗(yàn)室制，符合GB/T 6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格）。

1.3樣品預(yù)處理

1.3.1樣品提取

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g樣品（精確至1 mg）于10 mL具塞比色管中，用0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)待測樣品pH至7.5，加入8 mL乙腈漩渦1 min混勻，加3.0 g氯化鈉，漩渦1 min混勻，于4 500 r/min，離心5 min，分層后，吸取上清液4 mL待凈化。

1.3.2樣品凈化

加入2.5 g無水硫酸鈉于NH2固相萃取柱中，先用5 mL甲苯+乙腈（3+1）進(jìn)行預(yù)洗柱，當(dāng)液面達(dá)到硫酸鈉頂部時(shí)，將1.3.1中待凈化液進(jìn)行固相萃取，并用15 mL具塞管接收，然后用5 mL甲苯+乙腈（3+1）洗滌樣瓶3次，再將洗滌液移入固相萃取柱中，合并具塞管中樣液，并于45℃水浴條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約0.5 mL。將濃縮液置于氮吹儀上，45℃水浴條件下氮吹至近干，迅速加入80%乙腈水溶液回溶，超聲混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4高效液相色譜條件

色譜柱：InertsilC8，5μm，150mm×2.1 mm（內(nèi)徑）；柱溫：30℃；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；流動相：2.5 mmol/L 0.3%乙酸水溶液和0.3%乙酸的乙腈溶液梯度洗脫；具體洗脫條件如下：

表1　色譜梯度洗脫條件Table 1Chromatography gradient elution conditions

1.5質(zhì)譜條件

離子源：ESI源；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測；優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能量參數(shù)如下表2所示。

表2　質(zhì)譜采集參數(shù)Table 2Mass spectrum acquisition parameters

1.6實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.6.1待測樣品pH條件的優(yōu)化

分別考察了pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0不同梯度對葡萄酒中多菌靈、甲霜靈提取率的影響，樣品經(jīng)處理，進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測分析。

1.6.2萃取劑的優(yōu)化

選定好待測樣品的pH考察不同萃取劑正己烷、乙酸乙酯、乙腈對葡萄酒中多菌靈、甲霜靈提取率的影響，樣品經(jīng)處理，進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀分析檢測。

1.6.3固相萃取柱的選擇

考察了氨基固相萃取柱與石墨化碳/氨基復(fù)合固相萃取柱兩種固相萃取柱對多菌靈、甲霜靈萃取效果的影響，樣品進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀分析檢測。

1.6.4條件的優(yōu)化

參照1.3樣品處理方法及1.4和1.5的色譜條件，樣品經(jīng)加標(biāo)后采用3水平6平行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行檢測分析，以驗(yàn)證檢測方法可行性。

1.7數(shù)據(jù)處理

各指標(biāo)值測定均重復(fù)6次（n=6），用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用SAS 9.0軟件進(jìn)行Duncan新復(fù)極差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

稱取標(biāo)準(zhǔn)品多菌靈和甲霜靈，用乙腈稀釋溶解定容，配制成10 μg/L混標(biāo)，再分取一定體積用80%乙腈稀釋溶解定容。分別配制成濃度為0.00、0.05、0.10、0.50、1.0、2.0、5.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，上機(jī)測定。以峰面積為y，濃度μg/L為x，計(jì)算出：甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)曲線（y= 2.05×106x+1.77×105，γ=0.99 92），詳見圖1（a）；多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=2.68×106x+6.56×104，γ=0.9993），詳見圖1（b）。

2.2待測液總離子流圖

圖2為甲霜靈、多菌靈待測液總離子流圖。

2.3待測樣品pH條件的選擇

考察了不同pH條件對多菌靈、甲霜靈的萃取效果，其測定結(jié)果如表3所示。

圖1　（a）甲霜靈線性回歸曲線Fig.1（a）The linear regression curve of the metalaxyl

圖1?。╞）多菌靈線性回歸曲線Fig.1（b）The linear regression curve of the carbendazim

圖2　甲霜靈、多菌靈待測液總離子流圖Fig.2Total ion chromatogram of the metalaxyl and carbendazim’s fluid under test

由表3可以看出，在pH=8.0時(shí)，所測樣品中多菌靈、甲霜靈的回收率較好。這由于多菌靈屬于一種兩性化合物，在中性或偏堿性水溶液中溶解度低，通過調(diào)節(jié)溶液的堿性條件可增強(qiáng)多菌靈在有機(jī)溶劑中的溶解度［16］，但隨著堿性條件的增強(qiáng)，多菌靈會發(fā)生緩慢分解，伴隨pH升高分解加快，同時(shí)，甲霜靈在中性及弱酸性條件下較穩(wěn)定，遇堿也易分解。所以，選定pH= 8.0作為待測樣品的pH條件。

表3　干紅葡萄酒中不同pH條件下多菌靈、甲霜靈空白加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 3The recovery of metalaxyl and carbendazim of under the condition of different pH

2.4萃取劑的選擇

調(diào)節(jié)酒樣條件為pH=8.0，分別考察了正己烷、乙酸乙酯、乙腈作為萃取溶劑對葡萄酒中多菌靈、甲霜靈的萃取效率的影響，檢測結(jié)果如表4所示。

表4　不同固相萃取劑的測試結(jié)果Table 4The testing results of different solid phase extracting agent

由表4可以看出，三種溶劑，萃取效果差異顯著（P＜0.05），采用乙腈萃取，目標(biāo)物的綜合回收率均較好。因此，本研究選用乙腈作為萃取溶劑。

2.5固相萃取柱的選擇

由于葡萄酒中基質(zhì)較為復(fù)雜，凈化不充分直接上機(jī)會對儀器測定造成干擾，文獻(xiàn)報(bào)道多采用固相萃取柱凈化的方法降低基質(zhì)干擾［17-19］，而不同類型的固相萃取柱是影響樣品凈化及方法回收率的重要因素，本研究分別考察了氨基固相萃取柱與石墨化碳/氨基復(fù)合固相萃取柱兩種固相萃取柱對多菌靈、甲霜靈的萃取效果，其檢測結(jié)果見表5。

表5　不同固相萃取柱的測試結(jié)果Table 5Test results of different solid phase extraction column

由表5可以看出，氨基固相萃取柱對待測組分的萃取效果優(yōu)于石墨化碳/氨基復(fù)合固相萃取柱。其中，石墨化碳在去除色素等雜質(zhì)上優(yōu)于氨基固相萃取柱［20］，但對目標(biāo)物有一定吸附作用。而樣品經(jīng)過乙腈萃取后，用氨基固相萃取柱足以去除待測酒樣的色素等雜質(zhì)，且回收率高于石墨化碳/氨基復(fù)合固相萃取柱萃取效果，因此，本實(shí)驗(yàn)選用氨基固相萃取柱。

2.6方法回收率及檢出限

實(shí)驗(yàn)過程中采用基質(zhì)加標(biāo)進(jìn)行配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中是否有人為或環(huán)境因素帶來的污染，并驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)過程的精密性與準(zhǔn)確性。以濃度0.2、0.4、2.0 μg/L的目標(biāo)化合物制備標(biāo)準(zhǔn)小樣，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，另以相同基質(zhì)樣品做空白實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果為：多菌靈空白加標(biāo)回收率在60%～90%，RSD為2.2%～12.6%，甲霜靈空白加標(biāo)回收率在80%～105%，RSD為2.0%～8.2%，二者方法檢出限均能達(dá)到0.05μg/L，具體結(jié)果如表6、表7所示。

表6　干紅葡萄酒中多菌靈空白加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 6The determination results of the carbendazim’s addition recovery rate

表7　干紅葡萄酒中甲霜靈空白加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 7The determination results of the metalaxyl’s addition recovery rate

3　結(jié)果討論

本研究通過調(diào)節(jié)酒樣pH，利用乙腈進(jìn)行萃取，加入氯化鈉鹽析分層后，用氨基固相萃取柱進(jìn)行凈化、富集目標(biāo)物，分析物通過乙腈水溶液回溶后由液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）進(jìn)行檢測，所測得對多菌靈（carbendazim）、甲霜靈（metalaxyl）的回收率及檢出限能滿足葡萄酒中農(nóng)藥殘留的檢測需求。

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Determination of Carbendazim and Metalaxyl in Wine by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

CHEN Jun1，F(xiàn)AN Ji-peng1，2，XIE Xin-zhi1，2
（1.Inspection and Quarantine Technical Center，Suzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Suzhou 215104，Jiangsu，China；SuzhouWorld Standard Testing Technology Co.，Ltd.，Suzhou 215104，Jiangsu，China）

An analytical method was developed for the determination of carbendazim and metalaxyl in wine by using ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry.The pH of the wine was adjusted.The pesticides were extracted by acetonitrile，and cleaned up by NH2solid phase extraction column，then quantified with multiple reactions monitoring（MRM）.The limits of detection for both pesticides were 0.05 μg/L.Calibration curves exhibited good linearity over the concentration range from 0.00 μg/L to 5.0 μg/L，with their correlation coefficients above 0.999.Average recoveries for carbendazim spiked at 3 levels ranged from 60%to90%，with a relative standard deviations（RSD）range from 2.2%to12.6%.Average recoveries for metalaxyl spiked at 3 levels ranged from 80%to 105%，with a RSD range from 2.0%to 8.2%.

ultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry；metalaxyl；carbendazim；wine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.027

2014-05-09

進(jìn)口葡萄酒鑒定技術(shù)及有毒有害物質(zhì)檢測（SYN201215）作者簡介：陳軍（1965—），男（漢），研究員，博士，研究方向：食品質(zhì)量安全。