寧鴻珍，關(guān)維俊，劉英莉，李清釗，劉海燕，唐永梅，周瑞華

（河北聯(lián)合大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院河北省職業(yè)安全衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山063000）

紅三葉草異黃酮對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)脂肪肝大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化及肝功能的影響

寧鴻珍，關(guān)維俊，劉英莉，李清釗，劉海燕，唐永梅，周瑞華

（河北聯(lián)合大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院河北省職業(yè)安全衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山063000）

觀(guān)察紅三葉草異黃酮對(duì)高糖高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化及肝功能的影響。雄性SD大鼠54只，飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)抽取12只大鼠為對(duì)照組，喂普通飼料。其余為造模組，脂肪乳灌胃，同時(shí)給予18%的蔗糖溶液。連續(xù)4周后，隨機(jī)處死2只對(duì)照組大鼠和2只造模組大鼠，做肝臟病理切片，鏡下見(jiàn)脂肪變，表明造模成功。然后將造模組大鼠按體重隨機(jī)分為4組（每組10只）：分別為模型組、紅三葉草異黃酮低、中、高劑量組（75、150、300 mg/kg灌胃），共計(jì)12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠，收集血清和肝組織，檢測(cè)血清及肝組織中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、游離脂肪酸（FFA）、超氧化物歧化酶活性（SOD）、丙二醛（MDA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性或含量。與模型組比較，紅三葉草異黃酮中、高劑量組能明顯降低血清及肝臟中TC、TG、LDL-C及FFA的含量，升高血清及肝臟中HDL-C的含量，血清及肝組織SOD酶活性升高，MDA含量降低（P＜0.05）；肝功能指標(biāo)血清ALT及AST（145.88±34.28）的含量明顯低于模型組（P＜0.05）。一定劑量的紅三葉草異黃酮具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及減少高糖高脂膳食導(dǎo)致的氧化損傷作用，肝細(xì)胞損傷減輕，肝功能改善，對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝功能具有一定的保護(hù)作用。

紅三葉草異黃酮；非酒精性脂肪肝；肝功能；脂質(zhì)過(guò)氧化

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確的肝損傷因素所導(dǎo)致的脂肪肝，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪病變?yōu)橹饕±硖卣鞯募膊　Ｆ浼膊∽V隨病程的進(jìn)展而表現(xiàn)不一，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepalitis，NASH）、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌［1］。紅三葉草為豆科三葉草屬多年生牧草，自上世紀(jì)40年代以來(lái)，對(duì)于紅三葉草的營(yíng)養(yǎng)和保健作用日益受到重視。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用高糖高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD大鼠動(dòng)物模型，從脂質(zhì)代謝、氧化代謝方面探討紅三葉草異黃酮對(duì)非酒精性脂肪性肝抗氧化能力和肝功能的影響，為紅三葉草的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一些理論參考。

1　材料與方法

1.1主要儀器與受試物

紅三葉草異黃酮為棕黃色粉末，純度80%（西安小草植物科技有限公司）。日立7600-020型全自動(dòng)生化分析儀（日本Roche公司）；VERSAmax酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）。脂肪乳制劑及18%蔗糖溶液自制（河北省職業(yè)安全衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠54只，體重200g～220g（天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司），合格證號(hào)：SCXK（津）2009-0001，基礎(chǔ)飼料（河北聯(lián)合大學(xué)動(dòng)物中心）。

1.3分組與處理

雄性SD大鼠，飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組（n= 12）和造膜組（n=42），對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，造膜組給予脂肪乳灌胃，同時(shí)給予18%的蔗糖溶液，4周后，從造膜組和對(duì)照組隨機(jī)抽取2只大鼠做肝臟病理切片，鏡下見(jiàn)脂肪變，表明造模成功。然后將40只造膜組大鼠按體重隨機(jī)分為4組，模型組、紅三葉草低、中、高劑量組。對(duì)照組與模型組給予生理鹽水；紅三葉草低、中、高劑量組分別灌胃給予75、150和300 mg/kg紅三葉草異黃酮。于末次給受試物后，禁食不禁水12 h，心臟采血，離心分離血清，處死大鼠，立即取大鼠肝臟制勻漿用EP管封存置于-80℃保存，用于肝臟指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4指標(biāo)與方法

用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝組織和血清LDL-C、TC、TG、HDL-C。SOD測(cè)定用黃嘌呤氧化酶法；MDA測(cè)定用硫代巴比妥酸法。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用Microsoft Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，兩兩組間比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1紅三葉草異黃酮對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)水平的影響

紅三葉草異黃酮對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)水平的影響見(jiàn)表1、表2。

表1　各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA水平的比較（mmol/L，x±s）Table 1Comparison of level in serum of TC，TG，LDL-C，HDL-C and FFA in each group of rats（mmol/L，x±s）

表2　各組大鼠肝組織中TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較（mmol/L，x±s）Table 2Comparison of level in liver tissues of TC，TG，LDL-C，HDL-C and FFA in each group of rats（mmol/L，x±s）

由表1、2結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清及肝臟中TC、TG、LDL-C、FFA含量均升高，HDLC含量降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明大鼠患非酒精性脂肪肝后脂代謝發(fā)生紊亂；補(bǔ)充紅三葉草異黃酮后，上述情況明顯改善；與模型組比較，紅三葉草異黃酮中、高劑量組大鼠血清及肝臟中TC、TG、 LDL-C含量降低（P＜0.05），HDL-C含量升高，說(shuō)明一定劑量的紅三葉草異黃酮對(duì)脂質(zhì)水平有調(diào)節(jié)作用。2.2紅三葉草異黃酮對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠抗氧化作用的影響

紅三葉草異黃酮對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠抗氧化作用的影響見(jiàn)表3。

表3　各組大鼠肝組織及血清MDA、SOD含量比較（x±s）Table 3Comparison of level in serum and liver tissues of MDA and SOD in each group of rats（x±s）

由表3可見(jiàn)，模型組大鼠肝組織和血清SOD活性均低于對(duì)照組，MDA含量高于對(duì)照組；而給予紅三葉草異黃酮的三個(gè)劑量組，其肝組織和血清SOD活性高于模型組，MDA含量低于模型組，以中、高劑量組差異明顯（P＜0.05），說(shuō)明紅三葉草異黃酮可以提高機(jī)體SOD活性，并可以清除體內(nèi)氧自由基，降低MDA的含量。

2.3紅三葉草異黃酮對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝功能的影響

紅三葉草異黃酮對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝功能的影響見(jiàn)表4。

表4　各組大鼠血清ALT及AST水平比較（U/L，x±s）Table 4Comparison of level in serum of ALT and AST in each group of rats（U/L，x±s）

結(jié)果如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，紅三葉草各劑量組大鼠血清AST和ALT含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3　討論

非酒精性脂肪肝病為獲得性代謝應(yīng)激性肝臟損傷，系肥胖、高脂血癥及其相關(guān)代謝綜合征累計(jì)肝臟的常見(jiàn)病理表現(xiàn)［2］。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種因素與其發(fā)生發(fā)展相關(guān)，目前認(rèn)為主要有炎癥、氧自由基、脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗、腹型肥胖、脂肪細(xì)胞因子、鐵超載等因素［3-7］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，高脂、高糖誘導(dǎo)的NAFLD大鼠，其肝臟和血清TC、TG、FFA及MDA含量高于正常對(duì)照組，SOD活性低于正常對(duì)照組，說(shuō)明血脂升高時(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，過(guò)氧化產(chǎn)物增加，而抗氧化酶活性降低，給予紅三葉草異黃酮后，與模型組比較血脂水平降低、抗氧化酶活性增加，同時(shí)降低過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)物MDA的含量，血清模型組SOD活性和MDA含量分別為6.05 U/mg蛋白和10.51 nmol/mL，而紅三葉草異黃酮中高劑量組SOD活性分別為8.44 U/mg和12.97 U/mg，MDA含量分別為6.97和4.48 nmol/mL。脂質(zhì)沉積和脂質(zhì)過(guò)氧化是NAFLD的主要發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，由此可以認(rèn)為，紅三葉草異黃酮對(duì)NAFLD具有一定的防治作用。高劑量紅三葉草異黃酮還可降低肝臟和血清FFA。由此可見(jiàn)，紅三葉草異黃酮可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)、增加抗氧化能力來(lái)改善NAFLD疾病狀態(tài)。

ALT和AST是目前較常用的反映肝臟功能的指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，紅三葉草中、高劑量組大鼠血清中ALT（65.62、61.12 U/L）和AST（145.88、145.50 U/L）水平低于模型組（ALT為82.00 U/L、AST為187.38 U/L），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示一定劑量的紅三葉草異黃酮可以降低ALT和AST，對(duì)肝功能具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，高脂飲食可誘導(dǎo)肝臟脂肪沉積，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，造成肝細(xì)胞的損傷［8］。而紅三葉草異黃酮可降低肝臟脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解反應(yīng)和脂肪酸的氧化，進(jìn)而改善NAFLD疾病狀態(tài)。

［1］Moore J B.Non-alcoholic fatty liver disease：the hepatic consequence of obesity and the metabolic syndrome［J］.Proc Nutr Soc，2010，69（2）：211-220

［2］王晶宇，馬曉燕，夏苗，等.藏藥柳茶提取物對(duì)非酒精性脂肪肝病大鼠肝臟保護(hù)作用及其機(jī)制研究［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（3）：191-194

［3］Arrese M，Karpen S J．Nuclear receptors，inflammation，and liver disease：insights for cholestatic and fatty liver diseases［J］．Clin Pharmacol Ther，2010，87（4）：473-478

［4］Cuadrado A，Orive A，Garcia-Suarez C，et al．Non-alcoholicsteatohepatitis（NASH）and hepatocellular carcinoma［J］．ObesSurg，2005，15（3）：442-446

［5］Wieckowska A，Zein N N，Yerian L M，et al In vivo assessment of liver cell apoptosis as a novel biomarker of disease severity in non-alcoholic fatry liver disease［J］．Hepatology，2006，44（1）：27-33

［6］Adams LA，Angulo P．Treatment of non-alcoholic fatty liver disease［J］．Post grad Med J，2006，82，（967）：315-322

［7］張寶，蔣建華，肖永康，等．脂肪肝患者A-FABP與胰島素抵抗關(guān)系［J］．中國(guó)公共衛(wèi)生，2010，6（5）：566-567

［8］秦艷，張晾，潘杰．高脂飲食對(duì)非酒精性脂肪肝影響機(jī)制研究進(jìn)展［J］.實(shí)用肝臟病雜志，2010，13（1）：72-74

Effect of Red Clover Isoflavones on Liver Function and Inflammatory Response of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Rats

NING Hong-zhen，GUAN Wei-jun，LIU Ying-li，LI Qing-zhao，LIU Hai-yan，TANG Yong-mei，ZHOU Rui-hua
（School of Public Health，Hebei United University，Coal Health and Safety Lab of Hebei Province，Tangshan 063000，Hebei，China）

Observation of Red Clover Isoflavones on liver function and inflammatory response of nonalcoholic fatty liver disease in rats.After one week feeding in laboratory，12 out of 54 male SD rats were randomly chosen as the normal control group and fed with normal diet.The rest were made as modules，gavage feeding with fat emulsion and 18%sucrose solution.Two rats from normal control group and two from module were killed randomly after 4 weeks.Liver biopsy showed the module formation was successful.Then we randomly divided module into 4 groups（n=10）according to weight：Nonalcoholic fatty liver diseases（NAFLD）model control group，high-dose，medium-doseandlow-doseRedCloverIsoflavonestreatmentgroup（75，150，and300mg/kg），respectively.The experiment period lasted 12 weeks.At the end of experiment，rats were killed to collect serum and liver tissues.Then we detected the activity and content of Aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT），total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low density lipoprotein cholesterol（LDLC），high density lipoprotein cholesterol（HDL-C），malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST）and free fatty acids（FFA）.Compared with model group，the middle-dose group and the high-dose group could significantly decrease TC，TG，LDL-Cand FFA levels in serum and liver tissues and increase HDL-C levels.Compared with the model group，the middle-dose group and the high-dose group of red clover isoflavones could decrease MDA levels and improve SOD activity in serum，and the differences were statistically significant（p＜0.05）.The levels of ALT and AST（145.88±34.28）in middle and high dose group were lower than control group（p＜0.05）.Moderate dose of Red Clover soflavones could regulate lipid metabolism and reduce oxidative damage caused by high sugar and fat diet.Besides，the injury of liver cells was relieved and liver function was improved.For rats with nonalcoholic fatty liver disease，Red Clover Isoflavones had some certain protective effect on their.

Red Clover Isoflavones；non-alcoholic fatty liver f disease；liver unction；inflammatory response

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.005

2014-10-13

寧鴻珍（1959—），女（漢），教授，學(xué)士，主要從事食品衛(wèi)生及營(yíng)養(yǎng)保健品研發(fā)。