邸娜，韓海軍，鄭喜清，王靖，李亞珍，*，張瑞萍

（1.河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000；2.巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000）

番茄植株總黃酮提取工藝優(yōu)化

邸娜1，韓海軍2，鄭喜清1，王靖1，李亞珍1，*，張瑞萍1

（1.河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000；2.巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000）

以番茄植株為植物材料，研究乙醇浸提法提取其總黃酮的最佳工藝條件。以番茄植株總黃酮的提取量為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究乙醇濃度、浸提時(shí)間、料液比和浸提溫度對(duì)番茄植株總黃酮提取量的影響程度及最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，上述四因素對(duì)番茄植株總黃酮提取量影響的大小順序依次為乙醇濃度＞浸提溫度＞料液比＞浸提時(shí)間；最佳提取工藝條件為：60%乙醇，料液比30 mL/g，70℃條件下，浸提1.5 h；最高提取量為0.408 mg/g。

番茄植株；黃酮；乙醇浸提

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)低分子量的天然物質(zhì)，是植物體內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛的分布于多種植物體內(nèi)［1］。研究表明黃酮類(lèi)化合物具有清除生物體內(nèi)的自由基、抗腫瘤、抗衰老、抗心血管疾病等作用，且無(wú)毒無(wú)害［2-3］，在食品、藥品、保健品等方面得到廣泛應(yīng)用。因此，從植物體內(nèi)，提取天然的高純度黃酮類(lèi)化合物受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，但目前尚未見(jiàn)番茄植株中黃酮類(lèi)化合物提取工藝的相關(guān)報(bào)道。本文以番茄植株為植物材料，采取傳統(tǒng)的乙醇浸提法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化提取工藝，以其為工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類(lèi)化合物提供適宜的工藝參數(shù)，同時(shí)也為番茄植株的再利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

番茄植株：巴彥淖爾市臨河區(qū)氣象局試驗(yàn)田；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為生物級(jí)；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑為分析純，水為超純水。

分光光度計(jì)（723型）鳳凰；分析天平（BSA323SCW）賽多利斯；水浴鍋（HH-4）常州博遠(yuǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1番茄植株預(yù)處理方法

選擇結(jié)果期的番茄植株自來(lái)水清洗干凈后剪成5 cm左右的小段，于50℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，粉碎后過(guò)60目篩，所得樣品儲(chǔ)存于干燥避光處備用。

1.2.2番茄植株總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g備用的番茄植株粉，乙醇浸提，4 000 r/min離心2 min，收集三次濾液于50 mL容量瓶中，乙醇定容，作為樣品浸提液。

1.2.3蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，60%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，得0.4 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5 mL分別置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液至12.5 mL，混勻；分別加5%的NaNO20.75mL，搖勻靜置6min；再各加10%Al（NO3）30.75 mL，搖勻靜置6 min；再分別加入4%NaOH 10 mL，搖勻；最后用60%乙醇溶液定容至25mL，靜置10min，510 nm處測(cè)其吸光度值。

1.2.4樣品浸提液總黃酮的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取樣品浸提液10 mL于25 mL容量瓶中，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法使其顯色，于510 nm處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總黃酮的提取量。

1.2.5單因素試驗(yàn)

選取乙醇濃度、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間4個(gè)因素，以浸提液的總黃酮含量為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定各因素的適宜范圍，具體因素組合見(jiàn)表1。

表1　單因素試驗(yàn)因素水平Table 1Factors and levels of single factor experiment

1.2.6正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間為主要因素，按照表2進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)番茄植株中的總黃酮進(jìn)行提取，以總黃酮的含量為判斷依據(jù)，確定以上四因素的優(yōu)化組合。

表2　正交試驗(yàn)因素水平Table 2Factors and levels of orthogonal experiment

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及回歸方程

按照1.2.3的方法，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其回歸方程為：y=11.863x+ 0.003 3，R=0.999 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1Standard curve of rutin

實(shí)驗(yàn)表明在0.00 mg/mL～0.08 mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度值呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.2番茄植株浸提液與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜比較

番茄植株浸提液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法顯色后，在400 nm～650 nm下掃描二者的吸收光譜，掃描結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　蘆丁與樣品NaNO2-Al（NO3）3顯色后的吸收光譜Fig.2Absorption spectrum of rutin and sample with NaNO2-Al（NO3）3

結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和番茄植株浸提液分別在508 nm和510 nm處有最大吸收峰，且二者的吸收光譜特征相似，說(shuō)明番茄植株總黃酮的提取和定量方案合理可行。

2.3單因素試驗(yàn)

2.3.1乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3　乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3The effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

結(jié)果表明乙醇濃度對(duì)番茄植株總黃酮的提取率有較大影響。當(dāng)乙醇濃度由40%增大到60%時(shí)，總黃酮提取率急劇增加，由60%增大到70%時(shí)，提取率增加幅度減緩，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最大，再增大乙醇濃度，總黃酮提取率迅速降低。這可能是由于番茄植株中黃酮類(lèi)化合物種類(lèi)較多，不同種類(lèi)的黃酮類(lèi)化合物物理性質(zhì)不同，即有些為醇溶性的，有些為水溶性的［4］，隨著乙醇濃度的增加，水溶性的黃酮類(lèi)化合物浸出率逐漸下降，醇溶性黃酮類(lèi)化合物的浸出率逐漸升高，與此同時(shí)醇溶性的其他物質(zhì)也大量溶出，當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，可明顯觀(guān)察到浸提液的顏色由棕黃色變?yōu)榫G色，而總黃酮的提取率也迅速下降，說(shuō)明葉綠素的大量溶出阻礙了黃酮類(lèi)化合物的溶出。因此只有適宜的乙醇濃度才能同時(shí)溶出醇溶性和水溶性的黃酮類(lèi)化合物，又能使其他醇溶性化合物，如葉綠色的影響降到較小的程度。

2.3.2料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

料液比對(duì)總黃酮提取率影響的結(jié)果如圖4所示。

圖4　料液比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4The effect of solid liquid ratio on extraction rate of flavonoids

在10 mL/g～40 mL/g的范圍內(nèi)，總黃酮的提取率隨料液比的增加逐漸增大，達(dá)到40 mL/g時(shí)總黃酮的提取率達(dá)到最大，以后趨于穩(wěn)定。原因在于料液比越大，溶劑與細(xì)胞間的總黃酮的濃度差越大，越有利于黃酮類(lèi)化合物的溶出。但當(dāng)溶劑用量增大到一定程度時(shí)，溶劑中與細(xì)胞間黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，即使再增大溶劑用量，總黃酮的溶出量也不會(huì)增加。2.3.3浸提溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

浸提溫度對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5　浸提溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.5The effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

50℃～70℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高總黃酮的提取率明顯提高，但是當(dāng)溫度超過(guò)70℃時(shí)，隨著溫度的升高，總黃酮的提取率迅速下降。這是由于隨著溫度的升高，溶劑的滲透能力逐漸增強(qiáng)，黃酮的浸提率有所升高，但當(dāng)溫度超過(guò)70℃時(shí)，乙醇揮發(fā)導(dǎo)致溶劑的濃度下降，浸提率相應(yīng)降低，而且部分黃酮可能隨著溫度的升高發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化，因此70℃為黃酮浸提的適宜溫度。

2.3.4浸提時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

浸提時(shí)間不同對(duì)總黃酮的提取率也有一定的影響，影響結(jié)果如圖6所示。

圖6　浸提時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.6The effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

當(dāng)浸提時(shí)間為1 h～2 h時(shí)，黃酮類(lèi)化合物的提取率明顯增加，2 h時(shí)達(dá)到最大，超過(guò)2 h后提取率下降較快，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間在高溫下浸提使黃酮類(lèi)化合物發(fā)生轉(zhuǎn)化或分解造成的。

2.4正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

測(cè)定的4個(gè)因素對(duì)番茄植株黃酮類(lèi)化合物提取率的影響由大到小順序依次為乙醇濃度＞浸提溫度＞料液比＞浸提時(shí)間。從表4的方差分析結(jié)果來(lái)看，乙醇濃度、浸提溫度、料液比對(duì)番茄植株黃酮類(lèi)化合物的提取率具有極顯著的影響，浸提時(shí)間對(duì)番茄植株黃酮類(lèi)化合物的提取率具有顯著影響。但對(duì)單因素檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇濃度為60%和70%以及料液比為30 mL/g和50 mL/g時(shí)，對(duì)番茄植株黃酮類(lèi)化合物提取率的影響差異不大，為節(jié)省提取成本，綜合考慮分析結(jié)果可確定番茄植株黃酮類(lèi)化合物的最佳提取工藝為A2B1C1D2，即乙醇濃度為60%，料液比為30 mL/g，浸提溫度為70℃，浸提時(shí)間為1.5 h。

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3The results of orthogonal experiment

表4　正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4The analysis of variance

2.5提取工藝驗(yàn)證結(jié)果

為了確認(rèn)上述優(yōu)化組合條件A2B1C1D2的穩(wěn)定性和可靠性，進(jìn)行了優(yōu)化組合的驗(yàn)證試驗(yàn)，即稱(chēng)取番茄植株粉末1.0 g，用料液比為30 mL/g的60%乙醇溶液，在70℃條件下，浸提1.5 h，重復(fù)3次，測(cè)定黃酮類(lèi)化合物的含量分別為0.409、0.403、0.412 mg/g，均值為0.408 mg/g，RSD為1.12%。結(jié)果表明此工藝條件下提取的番茄植株黃酮類(lèi)化合物的含量均高于正交試驗(yàn)中任一組合的提取量，說(shuō)明提取工藝穩(wěn)定可靠。

3　討論與結(jié)論

黃酮類(lèi)化合物由于具有廣泛的生理和藥理作用，近年來(lái)被廣泛的用于食品、藥品和保健品的生產(chǎn)。本試驗(yàn)之所以采用番茄植株作為植物材料，最主要的原因在于巴彥淖爾市近年來(lái)加工型番茄的種植面積逐年擴(kuò)大，已經(jīng)成為我國(guó)繼新疆之后的第二大加工型番茄生產(chǎn)基地。每年番茄采收后，大量的番茄植株被廢棄，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。番茄植株中含有豐富的維生素C和黃酮類(lèi)化合物［5］，通過(guò)試驗(yàn)確定黃酮類(lèi)化合物的最佳提取工藝，既可以得到大量天然的黃酮類(lèi)化合物，又可以解決番茄植株的再利用問(wèn)題。

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果分析來(lái)看，采用傳統(tǒng)的乙醇浸提法提取番茄植株中的黃酮類(lèi)化合物，乙醇的濃度對(duì)提取量影響最大，其他3個(gè)因素的影響力順序依次為浸提溫度、料液比和浸提時(shí)間。通過(guò)試驗(yàn)可確定其最佳提取工藝為60%乙醇，料液比30 mL/g，70℃條件下，浸提1.5 h。在此條件下提取結(jié)果期番茄莖中的總黃酮，提取量為0.408 mg/g（40.8 mg/ 100 g），這一結(jié)果與趙海清等［5］測(cè)定的成熟期番茄莖的總黃酮含量（35.4 mg/100 g）很接近，說(shuō)明提取方法有效、可靠，這為番茄植株的再利用，變廢為寶，增加農(nóng)民收入提供了一個(gè)思路。

［1］錢(qián)俊臻.黃酮類(lèi)化合物提取方法的研究進(jìn)展［J］.化工文摘，2008（6）：35-38

［2］王慧.黃酮類(lèi)化合物生物活性的研究進(jìn)展［J］.食品與藥品，2012，12（9）：347-350

［3］張德權(quán)，臺(tái)建祥，付勤.生物類(lèi)黃酮的研究及應(yīng)用概況［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25（6）：52-57

［4］劉成梅，游海.天然產(chǎn)物有效成分的分離與應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：170-236

［5］趙海清，竇君，阿吉艾克拜爾·艾薩.番茄有效成分含量測(cè)定及其綜合利用產(chǎn)業(yè)化構(gòu)想［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（29）：16186-16187

Optimizing Extraction Technology of Total Flavones from Tomato Plants

DI Na1，HAN Hai-jun2，ZHENG Xi-qing1，WANG Jing1，LI Ya-zhen1，*，ZHANG Rui-ping1
（1.Agriculture Department，Hetao College，Bayannaoer 015000，Inner Mongolia，China；2.Agrotechnical Promotion Center of Bayannaoer，Bayannaoer 015000，Inner Mongolia，China）

To explore the optimal condition of alcohol leaching process for total flavonoids from tomato plants. With total flavones yield as selection standard，to research the optimal extraction condition and the impact of ethanol concentration，extraction time，extraction temperature and solid/liquid on total flavonoids yield of tomato plants by single factor and orthogonal experiments.The results showed the order of the impact of above four factors on total flavones yield was ethanol concentration＞extraction temperature＞solid/liquid＞extraction time；the optimal extraction condition：ethanol concentration was 60%，solid/liquid was 30 mL/g，extraction temperature was 70℃，extraction time was 1.5 h；the highest total flavonoids yield was 0.408 mg/g.

tomato plants；flavonoid；alcohol leaching process

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.017

2014-11-18

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZC13388）

邸娜（1983—），女（漢），講師，碩士，從事植物栽培生理及天然產(chǎn)物的提取和分離方面的教學(xué)和課研工作。

李亞珍（1962—），教授，學(xué)士。