張志紅，于一尊，黃江麗，張國華，譚胤靜，鄭國華，涂祖新，陳宇煒

1.江西省科學院生物資源研究所，江西 南昌 330096；2.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330096；3.中國科學院南京地理與湖泊研究所，江蘇 南京 210008

隨著社會和經濟的發(fā)展，人類活動導致湖泊污染己成為嚴重的環(huán)境問題，其中湖泊富營養(yǎng)化是最主要表現(xiàn)（王國惠，1998）。據(jù)報道，我國有63.3%的湖泊已經達到富營養(yǎng)化水平，氮、磷是公認的重要影響因子。在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，氨化細菌（Ammonifying bacteria）將水中的有機氮轉化為無機氮，其中大部分轉化為氣態(tài)的氨氣直接進入大氣，反硝化細菌（Denitrifying bacteria）將無機氮鹽（NO3--N及NO2--N）還原為N2O及N2，釋放到大氣中，降低了水體中的氮負荷，對于富營養(yǎng)化湖泊的凈化具有重要意義（GILLIAM，1994）。大腸桿菌（Escherichia coli）是評價水質好壞的一個重要衛(wèi)生指標，是反映水體被生活污水污染重要的監(jiān)測項目。

鄱陽湖是我國最大的淡水湖，擁有豐富的水資源和生物資源，具有蓄洪、航運、灌溉、水產養(yǎng)殖和旅游等多方面功能。鄱陽湖區(qū)社會經濟與環(huán)境保護相互協(xié)調、共同發(fā)展，是湖區(qū)發(fā)展戰(zhàn)略的重要內容，水環(huán)境保護則是鄱陽湖區(qū)環(huán)境保護的基本內容和主要目標。近年來，環(huán)鄱陽湖地區(qū)大規(guī)模發(fā)展?jié)O業(yè)養(yǎng)殖，圍湖區(qū)域水產養(yǎng)殖面積超過 18.67×104hm2，水產養(yǎng)殖總產量達 5.8×104t，水產養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展加速了湖泊水體的富營養(yǎng)化。另外，農村面源污染也十分嚴重，2012年時，全流域化肥施肥量4.27×107t，農藥施用量為1×106t，大量未被利用的化肥和農藥殘留物直接或者間接進入鄱陽湖水體，導致鄱陽湖水質下降（王圣瑞等，2013）。鄱陽湖污染物來源以及污染變化與洞庭湖有許多相似之處，但是鄱陽湖也有自己獨特性（李有志等，2011）。鄱陽湖是一個季節(jié)性漲水湖泊，具有“高水是湖，低水似河”獨特的自然地理景觀。每年汛期，五河洪水入湖，湖水漫灘，洪水一片；冬春季節(jié)，湖水落槽，灘地顯露，水面縮小，洪、枯水位面積相差10多倍，水量變化也將對湖區(qū)微生物生理群和環(huán)境因子產生巨大影響。本文以氮循環(huán)微生物和大腸桿菌群等生理菌群為研究對象，分析這些菌群時空分布特征以及與氮、磷等富營養(yǎng)化指標的相關關系，以期為環(huán)境監(jiān)測和保護鄱陽湖水質提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集時間選擇鄱陽湖豐水期和枯水期兩個時間段，豐水期采樣時間為2012年7月份，枯水期采樣時間為2013年1月份，樣品采集點分布見圖 1。水樣基礎數(shù)據(jù)由中國科學院鄱陽湖湖泊濕地觀測研究站提供。

1.2 培養(yǎng)基

蛋白胨培養(yǎng)基（檢測氨化細菌）：蛋白胨5.0 g，磷酸氫二鉀0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.2。

改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基 A（檢測亞硝化細菌）：硫酸銨2.0 g，磷酸氫二鉀0.75 g，磷酸二氫鈉0.25 g，硫酸錳0.01 g，硫酸鎂0.03 g，碳酸鈣5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.2。

改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基B（檢測硝化細菌）：亞硝酸鈉1.0g，磷酸氫二鉀0.75 g，磷酸二氫鈉0.25 g，硫酸錳0.01 g，硫酸鎂0.03 g，碳酸鈉1.0 g，碳酸鈣1.0 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.2。

反硝化細菌培養(yǎng)基：硝酸鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀1.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，檸檬酸鈉5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.2。

乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（檢測大腸桿菌）：蛋白胨0 g，豬膽鹽5.0 g，乳糖10 g，溴甲酚紫0.01 g，pH（7.4±0.2）。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（檢測異養(yǎng)細菌）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.5。

解磷細菌培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，碳酸鈣5.0 g，卵磷脂0.5 g，磷酸三鈣2.0 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.5。

1.3 試驗方法

大腸桿菌、氮循環(huán)微生物（氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌和反硝化細菌）采用 MPN方法，大腸桿菌測定1、10、100 mL 3個濃度水平，氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌測定0.1、1、10 mL 3個濃度水平，每個濃度重復3次，五種生理菌群陽性檢測和觀察參考相關文獻（陳紹銘和鄭福壽，1985）。

異養(yǎng)細菌和解磷細菌計數(shù)采用稀釋平板涂布法，水樣連續(xù)稀釋100倍后取0.1 mL涂平板；底泥樣品稱取10 g，加入裝有90 mL無菌水錐形瓶中，充分震蕩5 min稍靜置后取上清液連續(xù)稀釋100倍取0.1 mL涂平板。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003和SASV 8.0統(tǒng)計軟件分析。

2 結果與討論

2.1 豐水期水體中主要生理菌群數(shù)量和分布

2012年7 月份鄱陽湖豐水期水樣結果見表1。大腸桿菌平均數(shù)量為109.82 MPN·100mL-1，其中有33個樣品中大腸桿菌小于20 MPN·100 mL-1，達到國家一類水標準，占總樣品數(shù)44.0%。水質最差、大腸桿菌為300 MPN·100mL-1有23個，占總樣品數(shù)30.67%，具體分析這些采樣點分布區(qū)域，多是距離居民生活區(qū)較近，與人類生活、漁業(yè)和畜禽養(yǎng)殖等密切相關。測定氮循環(huán)微生物，硝化細菌數(shù)量最高，所有樣品在檢測濃度內全部變色，數(shù)量超過3000 MPN·100mL-1。氨化細菌平均為 975.11 MPN·100mL-1，亞硝化細菌（Nitrosobacteria）和反硝化細菌數(shù)量相對較低，平均為 45.68和 127.51 MPN·100 mL-1。不同湖泊流域中氮循環(huán)生理菌群數(shù)量不同，閆韞（2008）研究布吉河發(fā)現(xiàn)氨化菌數(shù)量最多，高達 8～12個數(shù)量級，亞硝化細菌和硝化細菌數(shù)量極少，認為氮循環(huán)菌群存在嚴重的數(shù)量不均衡現(xiàn)象。綜合分析不同采樣點氮循環(huán)菌群和大腸桿菌數(shù)量，再結合總氮、總磷測定結果，認為都昌周溪鎮(zhèn)、西源鄉(xiāng)、夢溪鄉(xiāng)獅山鄉(xiāng)等一帶水域以及鄱陽湖湖區(qū)中心是微生物數(shù)量最少的區(qū)域，同時氮、磷等也較低，水質好，屬于輕度富營養(yǎng)化；五河入湖口以及臨近居民生活區(qū)域的采樣點，微生物數(shù)量和氮、磷含量最高，出現(xiàn)不同程度的富營養(yǎng)化。鄱陽湖營養(yǎng)鹽濃度較高，2009─2011年年均總氮濃度為1.719 mg·L-1，總磷濃度為 0.090 mg·L-1，且有逐年增加的趨勢，按照營養(yǎng)狀態(tài)劃分標準，鄱陽湖某些區(qū)域處于明顯富營養(yǎng)化狀態(tài)（WU等，2013）。分析水體中異養(yǎng)細菌，平均數(shù)值為 149.48×103CFU·mL-1，樣品之間差異較大。測定水體中解磷細菌和有機磷農藥降解菌，少數(shù)樣品數(shù)量在20～80·mL-1，多數(shù)樣品中沒有檢測到解磷細菌，水體中也沒有富集到降解甲胺磷等農藥的微生物。觀察分離所得異養(yǎng)細菌，發(fā)現(xiàn)水體中以革蘭氏陰性為主，產色素菌數(shù)量較高，占總異養(yǎng)細菌數(shù)量10%左右。初步鑒定，細菌中假單胞菌（Pseudomonas）較多，其次為芽孢桿菌（Bacillus）和腸桿菌（Enterobacteriaceae），還有微球菌屬（Micrococcus）、色桿菌屬（Chromobacterium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）和黃單孢菌屬（Xanthomonas）等細菌，分析結果與多數(shù)湖泊異養(yǎng)細菌類型相似（吳根福等，1999）。

表1 豐水期部分取樣點水體中五種生理菌群和異養(yǎng)細菌數(shù)量Table 1 Amount of different bacteria in Poyang lake during wet seasons

2.2 豐水期水體中主要生理菌群和水質關系

將鄱陽湖水質基礎數(shù)據(jù)與大腸桿菌和氮循環(huán)微生物進行相關性分析，結果表明（見表 2），溶氧量（DO）與亞硝化細菌成極顯著正相關，與亞硝化細菌是好氧菌有關。電導率與氨化細菌成極顯著正相關，而與亞硝化細菌則成顯著負相關，可能這兩種菌群與某類物質增加或減少密切有關?？偟浚═N）與樣品中大腸桿菌、氨化細菌和亞硝化細菌均成極顯著正相關，總氮含量高，引起大量氮循環(huán)微生物繁殖，利于污染物降解。亞硝酸鹽（NO2-）、硝酸鹽（NO3-）和銨鹽（NH4+）含量與氮循環(huán)微生物沒有顯著性相關關系，此結果在一定程度上表明，水體中氮循環(huán)微生物數(shù)量高低與氮總量有關，是不同氮的綜合效應。吳楚等（2000）研究九山湖表明，硝化細菌與銨鹽存在顯著的正相關、反硝化細菌與亞硝酸鹽存在顯著正相關，王國惠（1996）認為湖區(qū)中銨鹽（NH4+）數(shù)量與亞硝化細菌不存在相關性有3個原因：（1）藻類與亞硝化細菌對氨氮競爭；（2）硝化細菌和亞硝化細菌屬于自養(yǎng)菌，過多的有機質會阻礙它們的發(fā)育；（3）氨氮的瞬時濃度可能較高，當取樣次數(shù)有限時，存在誤差，而吳根福等（1999）研究表明自養(yǎng)型細菌（如硝化細菌）在水質較好的水體中分布廣泛，異養(yǎng)型微生物如氨化細菌等在富營養(yǎng)化嚴重的湖中密度較大。分析還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌與氨化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌均呈極顯著正相關（相關系數(shù)R分別為0.518、0.442和0.332，結果略）。不同生理菌群數(shù)量高低，除了與氮、磷等含量有關，溫度、pH、水流速度等也是不可忽視的影響因素。

表2 鄱陽湖豐水期各指標之間的相關性分析Table 2 Correlation analysis of different indexes in Poyang lake during wet seasons

表3 部分鄱陽湖底泥樣品中不同微生物數(shù)量Table 3 Amount of different bacteria in Poyang lake sediments

2.3 豐水期湖區(qū)底泥中細菌數(shù)量和分布

比較底泥中異養(yǎng)細菌、芽孢桿菌和解磷細菌（Phosphate-solubilizing bacteria）數(shù)量（見表3），芽孢桿菌占全部異養(yǎng)細菌總量的30%左右，解磷細菌數(shù)量低，僅占 5%左右。不同解磷細菌解磷效果差異較大，有些解磷細菌初次篩選效果明顯，解磷圈與菌落之比達到3.5以上，純化后多數(shù)解磷細菌的解磷圈消失，說明解磷效果容易受外界影響。將3類細菌與水體中總氮、總磷和磷酸鹽（PO43-）進行相關性統(tǒng)計分析（見表 4），底泥中的芽孢桿菌與異養(yǎng)細菌之間呈極顯著正相關關系，解磷細菌和水體中總氮和總磷之間呈顯著負相關關系，而與磷酸鹽之間卻呈極顯著正相關關系，這個結果是否表明底泥中的解磷細菌通過降解作用釋放出更多內源磷，從而提高了水體中磷酸鹽數(shù)量？蘇爭光等（2014）在研究分析云南撫仙湖內源磷來源時提出沉積物中解磷細菌數(shù)量決定撫仙湖沉積物磷釋放強度。

表4 豐水期底泥中微生物與水體中總氮、總磷和磷酸鹽相關性分析Table 4 Correlation analysis of total P, N, PO43- and bacteria in Poyang lake sediments

表5 鄱陽湖豐水期和枯水期水體中四種生理菌群數(shù)量的比較Table 5 Compare of bacteria amounts in Poyang lake between wet and dry seasons

2.4 枯水期和豐水期主要生理菌群數(shù)量比較

比較豐水期和枯水期微生物差異（見表5），大腸桿菌、氨化細菌、亞硝化細菌數(shù)量變化一致，7月份豐水期取樣明顯高于冬季枯水期，分別比冬季高出21.5、21.4和11.5倍。一方面隨著夏季的到來，不同有機物隨雨水進入湖泊，為微生物的生長和繁殖提供豐富的底物；另一方面夏季溫度升高，加速了微生物的繁衍，從而增加了微生物的生物量（WU等，2014）。說明溫度是影響大腸桿菌、氨化細菌和亞硝化細菌數(shù)量和分布的主要因素。吳根福等（1999）研究杭州西湖水體中氨化細菌在夏季較少，冬季反而較多。反硝化細菌具有還原硝酸鹽成亞硝酸鹽并進一步還原生成氮氣作用，解除亞硝酸鹽的危害，反硝化細菌數(shù)量對于降低鄱陽湖富營養(yǎng)化問題具有重要意義。本研究中反硝化細菌變化同其它3類微生物相反，冬季反比夏季高出 5.3倍。分析原因有兩個可能：（1）鄱陽湖水體中浮游植物的光合作用對于反硝化細菌生長具有抑制作用，而夏季正值鄱陽湖水體中浮游植物生長的旺盛期（WU等，2014），通過光合作用產生大量的氧，不利于反硝化細菌的生長。冬季枯水期隨著浮游植物的大量衰亡，湖中氧氣的減少，反硝化細菌的數(shù)量則呈升高的趨勢；（2）當鄱陽湖處于枯水期，硝酸鹽濃度相對提高，刺激了反硝化細菌大量繁殖。研究結果同白雪等（2012）分析黑龍江省北部五大連池反硝化細菌與溫度變化關系一致。王國惠（1996）研究認為反硝化細菌與溫度和藻類數(shù)量呈顯著的正相關，由于溫度很高時，異養(yǎng)菌大量繁殖致使有機物得以降解，無機物大量釋放，致使藻類濃度升高，但環(huán)境中氧的濃度也大幅度下降，有利于反硝化細菌的繁殖。硝化作用發(fā)生在好氧條件下，反硝化作用發(fā)生在厭氧或兼性厭氧環(huán)境，隨著研究的不斷深入，多種好氧反硝化微生物陸續(xù)從不同環(huán)境中篩選出來（楊小龍等，2011；韓永和等，2013）。出現(xiàn)不同研究結果，需要進一步分析氮循環(huán)相關微生物自身功能的多樣性，以及湖泊水域環(huán)境條件，如水生植物覆蓋對氮循環(huán)微生物影響最大（王國祥等，1998）。

3 結論

豐水期樣品中5種生理菌群數(shù)量差異較大，四種參與氮循環(huán)的微生物中，硝化細菌數(shù)量最高，氨化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌數(shù)量相對較低；有 44%水樣品中大腸桿菌數(shù)量低于 20 MPN·100mL-1，達到國家一級水標準，鄱陽湖水質總體保持良好。多數(shù)水樣品中沒有檢測到解磷細菌，底泥中存在大量解磷細菌，占異養(yǎng)細菌 5%左右。比較豐水期和枯水期樣品，大腸桿菌、氨化細菌和亞硝化細菌3種菌群由于溫度原因，冬季枯水期明顯低于夏季豐水期，反硝化細菌枯水期明顯高于豐水期，溫度和溶解氧是重要影響因素。總氮與樣品中大腸桿菌、氨化細菌和亞硝化細菌均呈現(xiàn)極顯著正相關關系，大腸桿菌與氨化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌也呈現(xiàn)極顯著正相關關系。大腸桿菌、氨化細菌和亞硝化細菌可以作為鄱陽湖夏季總氮污染的主要指標微生物。

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