段春蘭　張愛民　付桂珍

（1 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3 烏蘭察布市化德縣醫(yī)院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 013350）

中西藥聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人胃癌細胞多藥耐藥機制

段春蘭1張愛民2付桂珍3

（1 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3 烏蘭察布市化德縣醫(yī)院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 013350）

目的 探討氟尿嘧啶（5-FU）、斑貞1號和川芎嗪（TMP）聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人胃癌細胞與乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）表達的相關(guān)性。方法 通過半定量RT-PCR比較人胃癌細胞在單純5-FU和5-FU聯(lián)合TMP和斑貞1號處理組BCRPmRNA的表達情況。結(jié)果 5-FU組與對照組相比，BCRP表達P＞0.05，無差異，而5-FU聯(lián)合TMP及斑貞1號處理組BCRP表達量明顯降低P＜0.05。結(jié)論 5-FU、斑貞1號和TMP聯(lián)合逆轉(zhuǎn)人胃癌細胞SGC-7901/ADR耐藥性可能與BCRP相關(guān)。

胃癌；多藥耐藥；斑貞1號；TMP；5-FU；BCRP

胃癌在我國是最常見的惡性腫瘤之一，胃癌的治療以手術(shù)和化療為主，由于目前沒有開展胃癌篩查，患者確診時已處于晚期，失去手術(shù)機會，故化療顯得尤為重要，但目前化療結(jié)果差，造成這一結(jié)果主要原因是胃癌多藥耐藥性（MDR），近幾年發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）在胃癌多藥耐藥性方面起著重要作用，侯培珍等研究［1］已證實斑貞1號+TMP+5-FU對人胃癌SGC-7901/ADR細胞有較強的逆轉(zhuǎn)作用［1］。因此我們在此基礎(chǔ)上，旨在檢測不同藥物組BCRPmRNA的表達量，進一步探討了中西藥對人胃癌SGC-7901/ADR細胞的逆轉(zhuǎn)機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑：斑貞1號按比例加斑蝥、女貞子、露蜂房、山茱萸共42.06 g，加入2000mL三蒸水，慢火加熱，至200mL時過濾，濃度為0.2103 g/mL的斑貞1號溶液。TMP、5-FU（南通精華制藥有限公司），新生小牛血清（賽默飛世爾生物化學(xué)制造）、二甲基亞砜（大連寶生物公司）、胰蛋白酶（北京經(jīng)科宏達公司），RT-PCR試劑盒及Trizol（TakaRa公司），RPMI1640（美國GIBCO公司產(chǎn)品），PCR引物序列（上海生工生物工程有限公司），細胞系：人胃癌細胞SGC-7901/ADR細胞（西京醫(yī)院消化研究內(nèi)科實驗室所提供）。

1.2主要儀器和設(shè)備：電泳儀（DF-D，北京）、PCR擴增儀（美國AB公司）、紫外分光度計（SFZ0806011349，上海）。

1.3實驗方法

1.3.1細胞處理：常規(guī)方法培養(yǎng)人為胃癌細胞SGC-7901/ADR，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后接種于6孔板上，每孔2mL，然后培養(yǎng)24 h，每孔分別加入新的培養(yǎng)液；5-FU稀釋液；斑貞1號稀釋液；5-FU+斑貞1號；5-FU+TMP+斑貞1號（根據(jù)MTT試驗結(jié)果選藥物濃度，選IC50值）。然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用PBS緩沖液沖洗1次，提取總mRNA。

1.3.2RT-PCR檢測：采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，以mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，。

PCR每個樣品反應(yīng)體系25μL，即10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5μL，Takara Taq 1μL，dNTP Mixture 2μL，ddH2O 13.5μL，目的基因上、下游引物各0.5μL，（引物序列見表1）滅菌蒸餾水13.5μL，各樣品cDNA5μL。

BCRP擴增條件：預(yù)變性、變性、退火、分別是93 ℃ 3min→93 ℃30s→54 ℃ 30s→72 ℃30s g共40個循環(huán)，最后延伸72 ℃ 10min；擴增結(jié)束后，PCR擴增產(chǎn)物取10μL，100V條件下在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳60min。將電泳凝膠于紫外線下觀察并用凝膠成象系統(tǒng)照相分析，得到各電泳帶平均吸光度值。

1.3.3統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件作處理，采用方差分析及LSD-t檢驗，P＜0.05表示差別有統(tǒng)計學(xué)意義。計量數(shù)據(jù)描述用均數(shù)±標準差表示。

2　結(jié) 果

2.1SGC7901/ADR細胞經(jīng)不同藥物處理后BCRP mRNA的表達：5-FU組BCRP mRNA表達量為（2.11±0.24），對照組為（2.20±0.26），二者比較P=0.23，無統(tǒng)計學(xué)意義，其他藥物組與對照組及組間比較P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義斑貞1號+TMP+FU組表達量最少。

2.2所有RT-PCR擴增產(chǎn)物均產(chǎn)生基因擴增帶，證實逆轉(zhuǎn)錄完整性和PCR反應(yīng)是成功的。BCRP和-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后分別位于346 bp和528 bp，和預(yù)期長度吻合，說明均為特異性擴增片段（圖1）。

圖1　細胞經(jīng)不同藥物處理后BCRP表達的凝膠圖像

表1　BCRP、-action基因上、下游引物。

3　討 論

在胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，它的發(fā)病率及病死率居惡性腫瘤第二位［2］，化療是綜合治療胃癌的重要方法之一，目前大多數(shù)研究認為胃癌的MDR是化療緩解率低的主要原因［3-4］，目前認為多種因素參與腫瘤的多藥耐藥，Ningetal在研究胃癌干細胞時發(fā)現(xiàn)，BCRP在胃癌MDR中起重要作用［5］，BCRP是Doyle［6］首先發(fā)現(xiàn)于乳腺細胞中，故被稱為乳腺癌耐藥蛋白，它是第一個位于細胞膜上的新ABC半轉(zhuǎn)運蛋白，相對分子質(zhì)量大小為2.4kb，基因定位于4q22.23，通過藥物溢出泵的機制導(dǎo)致耐藥，與多種瘤細胞泵的MRD相關(guān)。它與p-gp、MRP一樣，具有把化療藥物米托蒽醌、阿霉素等從腫瘤細胞里“泵出”的作用［7］。

中藥及其復(fù)方制劑由于多種活性成分并存，能通過多種途徑、多個靶點在腫瘤的治療中發(fā)揮作用［8］。本課題斑貞1號合劑主要有（露蜂房、山茱萸、女貞子、斑蝥素），主藥為斑蝥素和露蜂房，輔佐藥為山茱萸和女貞子，斑蝥素的抗腫瘤機制主要是抑制細胞的蛋白質(zhì)的合成，降低癌毒激素水平及影響癌細胞的核酸代謝，女貞子具有扶正祛邪，抑制幽門螺桿菌的作用及抑制嘌呤異常代謝并對染色體損傷和突變具保護作用，TMP是一種鈣離子通道阻滯劑，通過多種途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥。楊葉，侯培珍等［9］已證實川芎嗪能顯著增加腫瘤細胞對5-FU的敏感性；本文顯示，斑貞1號+TMP+5-FU對人胃癌SGC-7901/ ADR細胞有較強的逆轉(zhuǎn)作用，本研究表明斑貞1號+5-FU+TMP組BCRP mRNA表達量低于其他用藥組，組間比P＜0.05，有顯著性差異，證明三種藥物聯(lián)合可抑制耐藥細胞BCRP mRNA的高表達，逆轉(zhuǎn)了BCRP基因介導(dǎo)的多藥耐藥性，增強了治療效果。

［1］ 侯培珍，張娟，趙永峰.中西藥結(jié)合對胃癌細胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)和誘導(dǎo)凋亡的實驗研究［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29（13）：1181-1183.

［2］ 韓全利，張龍方，李靜，等.Ro60在耐藥胃癌細胞系SGC7901/ADR中的克隆及表達［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18（12）：41-42.

［3］ Hao SL，Liu LK，Li YF.Miultidrug resistance mechanisms and reversal agents in gastric carcinoma cells ［J］.Cancer Res Clin，2007，19（1）：68-72.

［4］ 檀碧波.胃癌多藥耐藥異質(zhì)性的臨床與基礎(chǔ)研究［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2010.

［5］ 王新；胃癌SGC7901細胞多藥耐藥相關(guān)新蛋白和基因的篩選及鑒定［D］.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)；2001.

［6］ Doyle LA，Yang W，Abruzzo LV，et al.A multidrug resistance tansproter from human MCF-7 breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（26）：15665-15670.

［7］ 張燕，金先慶，趙珍珍，等.5種耐藥基因在成人常見惡性腫瘤中的表達特點［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，32（10）：1023.

［8］ 盛桂琴.中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（5）：776-779.

［9］ 楊葉，侯培珍，張娟.川芎嗪聯(lián)合氟尿嘧啶對胃癌細胞SGC-7901/ ADR的殺傷作用［J］.腫瘤防治研究，2008，35（9）：624-626.

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1671-8194（2015）10-0074-02