姬承東 周蕓蕓

摘要 [目的] 探討內(nèi)生真菌對鴨茅植株抗鹽性的影響。[方法]以感染內(nèi)生真菌的鴨茅為試驗材料，以無內(nèi)生菌的鴨茅植株為對照，模擬梯度濃度的鹽脅迫環(huán)境進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗，比較帶內(nèi)生真菌E+與不帶內(nèi)生真菌E的鴨茅在相同環(huán)境下不同濃度NaCl脅迫下的生長與生理指標(biāo)變化。[結(jié)果] 隨鹽脅迫濃度的增加， 感染和未感染內(nèi)生真菌鴨茅植株脯氨酸含量和過氧化物酶活性均顯著升高（P<0.05），單株生物量的干、鮮重均顯著降低（P<0.05）。與未感染內(nèi)生菌的鴨茅植株相比，感染內(nèi)生真菌可使植株的地上生物量和葉片可溶性糖含量顯著增加（P<0.05），并使過氧化物酶活性顯著降低（P<0.05）。在鹽脅迫環(huán)境下內(nèi)生菌對鴨茅葉片中葉綠素和丙二醛的含量無顯著影響。[結(jié)論]感染內(nèi)生真菌的鴨茅植株能夠增強其對鹽脅迫的生理生化適應(yīng)能力。

關(guān)鍵詞 鴨茅；內(nèi)生真菌；鹽脅迫；抗鹽性

中圖分類號 S432.3+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）05-109-04

Effects of Interaction between Endophytic Fungi and Dactylis glomerata on the Salt Resistance of Host Plants

JI Chengdong1，2， ZHOU Yunyun1 （1. Hunan Golf and Tourism College， Changde， Hunan 415900； 2. Changsha Hawaii Grass Industry Co. Ltd.， Changsha， Hunan 410200）

Abstract [Objective] The research aimed to discuss the effects of endophytic fungi on the salt resistance of Dactylis glomerata plants. [Method] Taking D. glomerata infected with endophytic fungi as test materials and D. glomerata plants without endophytic fungi as control， the salt stress environment was simulated with different concentration gradients to carry out the indoor pot experiment. The changes of the growth and physiological indices of D. glomerata plants with and without endophytic fungi under the same environment with salt stress with different concentrations of NaCl were compared. [Result] With the increasing of salt concentration， the proline content and peroxidase activity in D. glomerata plants with and without endophytic fungi were significantly increased（P<0.05）， and the dry weight and wet weight of single plant biomass were all significantly decreased（P<0.05）. Compared with D. glomerata plants without endophytic fungi， the aboveground biomass and soluble sugar content in the leaves of D. glomerata plants with endophytic fungi were significantly increased（P<0.05）and their peroxidase activity in D. glomerata plants was significantly decreased（P<0.05）. Under the salt stress environment， the endophytic fungi had no significant effect on the contents of chlorophyll and malondialdehyde in the leaves of D. glomerata. [Conclusion] The physiological and biochemical adaptability of D. glomerata plants infected with endophytic fungi to salt stress was significantly enhanced.

Key words Dactylis glomerata；Endophytic fungi； Salt stress；Salt resistance

基金項目 公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（20120304205）。

作者簡介 姬承東（1979- ），男，甘肅金昌人，講師，碩士，從事高爾夫球場草坪養(yǎng)護管理。

收稿日期 20141219

土壤鹽漬化是嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的問題，在鹽脅迫條件下植物的生長緩慢，代謝受到抑制，鹽脅迫嚴(yán)重時出現(xiàn)鹽斑、葉子萎蔫，甚至死亡[1]。鹽漬土在我國有著廣泛分布和較大的面積。尤其在新疆地區(qū)，鹽漬土分布范圍廣，改良和發(fā)展?jié)摿Υ?，但大多?shù)還未得到合理有效地開發(fā)和利用[2-3]。目前，鹽漬土的綜合利用是旱區(qū)和荒漠區(qū)農(nóng)業(yè)研究的熱點問題，而鹽生植物的抗鹽性則成為其中的重點之一[2]，對于加快鹽漬土的開發(fā)利用、促進(jìn)區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展和鹽漬土壤的生態(tài)恢復(fù)具有重要意義。鴨茅（Dactylis glomerata）又稱雞腳草、果園草，競爭適應(yīng)能力較強，可與部分豆科草和禾本科草形成穩(wěn)定、高產(chǎn)的混生群落，適宜放牧、刈割，且通過人工摘頂可以提高人工草地中鴨茅種群的適應(yīng)性。近20年來，通過抗性選育、組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等方法已經(jīng)獲得大量優(yōu)良的品種[3-4]，但不同產(chǎn)地的鴨茅品種其耐鹽性和耐寒性因原產(chǎn)地不同存在顯著差異。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌對牧草的耐鹽性具有明顯的促進(jìn)作用。內(nèi)生真菌是一類在植物體內(nèi)渡過大部分或全部生命周期，而寄主植物不表現(xiàn)出外部癥狀的一類真菌，菌絲生長于植物組織的細(xì)胞間，其中葉鞘和種子中菌絲含量最多[5-6]。迄今為止，已在許多高等植物中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的存在，但以禾本科植物尤為常見[6]。由于內(nèi)生真菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，并與宿主協(xié)同進(jìn)化，在長期進(jìn)化過程中能與宿主植物形成互惠關(guān)系[7]。大量研究表明，內(nèi)生真菌能夠能提高宿主植物對干旱[8]、高溫[9]、低溫[10]、鋅的毒害[11]和鹽堿[12]等非生物脅迫的抗性。

國內(nèi)外有關(guān)內(nèi)生真菌對禾草耐鹽性的研究已有報道，但主要介紹禾本科植物內(nèi)生真菌抗鹽脅迫方面的研究，集中于研究事例、問題以及研究前沿等[13-14]。李倍金等分析了內(nèi)生真菌對宿主野大麥耐鹽性的影響，指出內(nèi)生真菌能提高野生大麥在田間環(huán)境下的耐鹽性。彭清青和南志標(biāo)等指出在不同酸堿脅迫環(huán)境下內(nèi)生真菌能顯著促進(jìn)3種禾草種子的胚芽生長。在黑麥草種子萌發(fā)的過程中，內(nèi)生真菌也產(chǎn)生了相似的效果[15-17]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗所用的鴨茅材料品種為楷模（Dactylis glomerata. Cambria），種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)曹致中教授提供。種子凈度為98%，發(fā)芽率為89%。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子發(fā)芽率的測定。

在每個培養(yǎng)皿中放入圓形濾紙及均勻分開的50粒鴨茅種子，澆水至濾紙濕潤，每天澆水，將內(nèi)生菌株制成濃度為109cfu/ml的菌懸液，用該菌液浸泡種子30 min ，置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。于恒溫箱內(nèi)28 ℃遮光培養(yǎng)，7 d后觀察種子的發(fā)芽情況，以無菌水浸種作為對照，每個處理重復(fù)4次。按照以下公式計算種子發(fā)芽率：發(fā)芽率=發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%

1.2.2 鴨茅幼苗植株的獲得。

在直徑14 cm的圓形育苗盤內(nèi)加入5 cm厚的營養(yǎng)土壓平備用，并以6×12的排列種植鴨茅種子，每穴播3粒種子。每3 d澆水1次，出苗后在光照培養(yǎng)室內(nèi)栽培，光照時間12 h，20 ℃；黑暗條件下12 h，15 ℃，連續(xù)培養(yǎng)4～6周，待分蘗期時進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離和檢測。

1.2.3 分蘗期內(nèi)生真菌的檢測。

鴨茅幼苗生長到分蘗期時，植物材料經(jīng)75%乙醇表面消毒后，用鑷子取葉鞘表皮細(xì)胞置于載玻片上，參照文獻(xiàn)[18]的方法以0.8%的乳酸苯胺藍(lán)染色，并在尼康D40顯微鏡下以40倍目鏡觀察，根據(jù)菌絲體的有無判斷是否存在內(nèi)生真菌。對攜帶內(nèi)生真菌的植株具體位置予以標(biāo)記。例如，第1盆的第2列第3顆有內(nèi)生真菌則記錄為1-B3E+。

1.2.4 無內(nèi)生真菌植株的獲得。

取苗盆植株，由葉片至根系用50 ml 噴瓶霧狀噴灑1∶300濃度的甲基托布津，連續(xù)噴灑7 d，每次1 ml，培養(yǎng)7 d后檢測是否全部殺死內(nèi)生真菌。檢測結(jié)果為100%殺死植株內(nèi)生真菌。

1.2.5 鴨茅分類移栽。

將帶菌和不帶菌的鴨茅植株均勻移栽于高9 cm、直徑14 cm、盛有蛭石粉（蛭石材料由石河子市農(nóng)貿(mào)市場購得）的花盆內(nèi)。帶菌植株每盆移栽5株，每4盆為1個處理，每組4次重復(fù)，各處理分別編號為E+—1、E+—2、E+—3和E+—4；不帶菌的也同樣移栽4組，共計16個花盆，各組編號為E-—1、E-—2、E-—3、E-—4組，以Hoagland營養(yǎng)液補充養(yǎng)分，在光照12 h、20 ℃，黑暗12 h、15 ℃的光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)并進(jìn)行脅迫試驗。

1.2.6 鹽分脅迫處理。

同時對E+和E-盆移栽苗設(shè)置0.3%、0.6%和0.9%共3個鹽脅迫處理組，以僅澆Hoagland營養(yǎng)液的處理作為對照，根據(jù)各處理的設(shè)置要求每隔12 h以含不同濃度NaCl的1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行處理，對照用普通1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行處理。脅迫過程中每天采用稱量差量法用蒸餾水及時補充蒸騰損失水分并維持脅迫濃度。每天觀察鴨茅植株的長勢，拍照并記錄數(shù)據(jù)。脅迫1周后測定植株的耐鹽生理指標(biāo)，處理60 d后用自來水無損洗下植株，使用直尺測定株高，150 ℃下殺青10 min ，105 ℃條件下烘干至恒重后稱量測定地上生物量、地下生物量鮮重和干重。

1.2.7 生理指標(biāo)的測定。葉綠素a、b含量的測定采用丙酮法；可溶性糖的測定參照李合生[19]以蒽酮比色法測定；脯氨酸含量參照張殿忠等[20]、李樹偉等[21]和肖雯等[22]以磺基水楊酸法測定；丙二醛含量參照李樹偉等[21]采用以硫代巴比妥酸（TBA）法測定；過氧化物酶（POD）活性測定參照李合生[19]采用愈創(chuàng)木酚法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，采用DPS 3.0數(shù)據(jù)處理軟件中的新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物量分配的變化

在顯微鏡下對無內(nèi)生真菌的鴨茅盆栽植株進(jìn)行復(fù)檢，存在內(nèi)生真菌菌絲的為帶菌植株（圖1），在殺菌劑處理后處理植株均已無內(nèi)生菌存在，保證了試驗結(jié)果的可靠性。在鹽脅迫條件下，攜帶內(nèi)生真菌與無內(nèi)生真菌的鴨茅植株的實際生長狀況。感染內(nèi)生真菌的植株高度高于相同鹽濃度下的未感染內(nèi)生真菌的植株（圖2），其生物量干鮮重也顯著高于未感染內(nèi)生真菌的植株（P<0.05），而植株地下部分的生物量干重及鮮重卻均顯著低于無內(nèi)生真菌的植株（圖3～4）。

2.2 葉綠素a、b含量的變化 從圖5～6可以看出，

脅迫條件下感染內(nèi)生真菌與未感染內(nèi)生真菌的植株葉綠素含量均無明顯的變化規(guī)律且無顯著差異（P>0.05）。當(dāng)鹽濃度為0.3%時，未感染內(nèi)生真菌的植株葉綠素a、b含量都達(dá)到最高，但處理間差異并不顯著（P>0.05）。

2.3 可溶性糖含量的變化 從圖7可以看出，

隨著鹽濃度的升高，未感染植株可溶性糖含量降低；感染內(nèi)生真菌植株的可溶性糖含量先升高再降低，在0.6%的鹽處理濃度下達(dá)到最高，其中0.6%和0.9%NaCl感染植株的可溶糖含量高于未感染植株，其中0.9%NaCl處理可溶性糖差異達(dá)顯著水平。

2.4 脯氨酸含量的變化 從圖8可以看出，隨著鹽濃度升高，感染內(nèi)生真菌與未感染的植株脯氨酸的含量均顯著升高。在對照和鹽濃度為0.3%處理中，感染內(nèi)生真菌和未感染的植株脯氨酸的含量未顯著升高，而且相同處理條件下感染植株和未感染植株脯氨酸含量無顯著差異（P>0.05），當(dāng)鹽濃度為0.9%時感染內(nèi)生真菌和未感染的植株脯氨酸含量均顯著升高（P<0.05）。

2.5 丙二醛含量的變化 從圖9可以看出，含內(nèi)生真菌與無內(nèi)生真菌的植株在不同鹽濃度脅迫處理下的丙二醛含量與對照無顯著差異（P>0.05），相同處理下感染內(nèi)生真菌與未感染植株之間丙二醛含量也無顯著差異（P>0.05）。感染內(nèi)生真菌植株脯氨酸含量越高，植物的耐鹽性也越高。

2.6 過氧化物酶的變化 從圖10可以看出，感染內(nèi)生真菌植株的過氧化物酶活性低于未感染植株。感染內(nèi)生真菌和未感染植株的過氧化物酶活性都隨著鹽濃度的增加而呈現(xiàn)出增強趨勢，鹽分脅迫促使鴨茅植株抗氧化物酶的活性升高，從而提高對逆境的抗性，相同處理下感染植株的過氧化物酶顯著低于未感染植株，差異達(dá)顯著水平，但鹽度0.9%的NaCl處理，差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

內(nèi)生真菌能使植株地上生物量及株高增加，但降低了地下部分的生物量干鮮重，這與緱小媛[23]的研究結(jié)果相一致，內(nèi)生真菌對鹽脅迫下的鴨茅植株營養(yǎng)生長有積極作用。內(nèi)生真菌感染通常會影響宿主植株的光合性能[24]，但該研究中鹽脅迫條件下感染內(nèi)生真菌的植株葉綠素含量與未感染內(nèi)生真菌的植株無明顯變化規(guī)律，且無顯著差異。鹽濃度為0.3%時未感染內(nèi)生真菌的植株葉綠素a、b的含量都達(dá)到最高，表明0.3%的鹽濃度對鴨茅植株有促進(jìn)葉綠素合成和積累的作用。隨著鹽濃度的升高，植物逐漸表現(xiàn)出生長受到抑制，為維持滲透壓，植物體中的大分子淀粉逐漸分解為小分子糖類，導(dǎo)致植物葉片內(nèi)可溶性糖含量增加。

感染內(nèi)生真菌的植株可溶性糖含量顯著高于無內(nèi)生菌的植株。內(nèi)生真菌能促進(jìn)可溶性糖的轉(zhuǎn)化和形成，從而調(diào)節(jié)鴨茅葉片內(nèi)的滲透壓，最終增強植株的耐鹽能力。在低濃度條件下感染內(nèi)生真菌植株含糖量顯著低于不感染內(nèi)生真菌植株（P<0.05），這可能是由于內(nèi)生真菌與宿主的互惠共生關(guān)系造成的，內(nèi)生真菌會利用宿主植株作為碳源，而在高濃度的鹽分脅迫條件下內(nèi)生真菌感染會提高宿主植物的抗鹽性。這與前人的研究結(jié)果一致，植物葉片內(nèi)可溶性糖含量的增加能提高宿主植株的抗性[18]。脯氨酸的累積能有效強化植株對滲透脅迫的耐受性[25]。感染內(nèi)生真菌植株與未感染植株在高鹽濃度0.9%脅迫下脯氨酸的含量均顯著升高，說明在鹽濃度0.9%的高鹽脅迫下鴨茅植株通過大量產(chǎn)生脯氨酸來提高其耐鹽性，但感染內(nèi)生真菌植株只有在0.3%的低鹽濃度脅迫時脯氨酸含量高于無內(nèi)生真菌植株的含量，其具體機理尚不明確。

植物在逆境條件下常常發(fā)生膜脂過氧化作用，造成植物體內(nèi)的自由基代謝平衡失調(diào)，導(dǎo)致丙二醛積累，對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能造成破壞。丙二醛作為脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物。王寶山等[26]研究表明丙二醛含量可反映膜損傷程度，膜透性是直接反映出細(xì)胞膜傷害程度，而丙二醛間接反映出膜受損狀況。

作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，丙二醛含量反映膜脂過氧化的程度。遭受脅迫時植物體內(nèi)丙二醛的含量與其耐受鹽脅迫的能力呈負(fù)相關(guān)[25]。該試驗中鹽脅迫下感染內(nèi)生真菌與未感染植株間的丙二醛含量無顯著差異（P>0.05），而與無脅迫的對照相比也無顯著差異（P>0.05）。這有可能是因為鹽脅迫的濃度和時間尚未使植株葉片膜系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重傷害，因此無法反映出鴨茅的抗鹽性是否提高，需要以更高濃度鹽脅迫的試驗予以探討。

過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶能夠消除自由基，減緩膜脂過氧化、降低逆境對植物的傷害。在植株可耐受的脅迫范圍內(nèi)，過氧化物酶的活性與受到的脅迫呈正相關(guān)[22]。該研究中鴨茅植株過氧化物酶的活性隨著鹽脅迫濃度的增加而升高，但感染內(nèi)生真菌植株的過氧化物酶活性顯著低于無內(nèi)生真菌的植株。以上生理和生長指標(biāo)均指出內(nèi)生真菌對于提高植株的抗逆性有積極作用。

感染內(nèi)生真菌的植株能夠增強對鹽脅迫的生理生化適應(yīng)能力。鹽分脅迫下感染內(nèi)生真菌植株和未感染植株的脯氨酸、過氧化物酶都隨著鹽濃度的升高而升高，鹽脅迫下內(nèi)生真菌感染可導(dǎo)致鴨茅葉內(nèi)的可溶性糖含量顯著增加，地上產(chǎn)量增加。根的鮮重和干重隨著鹽濃度的升高而減少。

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責(zé)任編輯 劉月娟 責(zé)任校對 李巖