李進(jìn)波 夏明元 戚華雄

摘要

[目的] 獲得水稻抗稻瘟病基因Pi1和Pi2聚合系，并對(duì)其進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。[方法]

以GD7為稻瘟病抗性基因供體，揚(yáng)稻6號(hào)為受體，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，選育出10個(gè)Pi1基因和Pi2基因雙基因純合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品系，在湖北省水稻品種區(qū)域試驗(yàn)的稻瘟病抗性鑒定點(diǎn)恩施和宜昌分別對(duì)這些品系的稻瘟病抗性進(jìn)行了田間鑒定。[結(jié)果]這些品系的抗性綜合指數(shù)在0.8～2.0，抗級(jí)為1，表現(xiàn)為抗，而受體親本揚(yáng)稻6號(hào)的抗性綜合指數(shù)分別為8.8和8.5，抗級(jí)為9，表現(xiàn)為高感，其中一個(gè)品系R587與不育系廣占63S配制的雜交組合的抗性綜合指數(shù)分別為2.5和3.5，抗級(jí)為3，表現(xiàn)為中抗，而對(duì)照揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)的抗性綜合指數(shù)分別為7.9和8.2，抗級(jí)為9，表現(xiàn)為高感。[結(jié)論]通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇聚合Pi1基因和Pi2基因能顯著提高聚合系及其相應(yīng)雜交組合的稻瘟病抗性。

關(guān)鍵詞 水稻；稻瘟??；分子標(biāo)記輔助選擇；抗性鑒定

中圖分類(lèi)號(hào) S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）05-012-03

Development and Evaluation of Disease Resistance of Pyramided Lines with Blast Resistance Genes Pi1 and Pi2 in Rice

LI Jinbo，XIA Mingyuan，QI Huaxiong （Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064）

Abstract [Objective] The aim was to develop and evaluate disease resistance of pyramided lines with blast resistance genes Pi1 and Pi2 in rice.[Method] Using GD7 as donors as rice blast resistance genes， and Yangdao 6 as recipient， ten new genepyramided lines with the rice blast resistance genes Pi1 and Pi2 and desirable agronomic traits were developed by bakecross breeding with molecular markerassisted selection （MAS）. The field resistance of these lines and their original parents was identified in Ensi and Yichang of Hubei. The evaluation of these lines was conducted on the resistance to blast. [Result]The results showed that the disease index of these lines were 0.8-2.0 and they were resistant. And the disease index of Yangdao 6 was 8.8 and 8.5 and it was high susceptible. The disease index of Guangzhan63S/R587 was 2.5 and 3.5 and it was moderately resistant. And the disease index of Yangliangyou 6 was 7.9 and 8.2 and it was high susceptible. [Conclusion]The conclusion was drawn that the field resistance of genepyramided lines and their hybrid was significantly increased by MAS.

Key words Rice； Blast； MAS； Evaluation of disease resistance

基金項(xiàng)目 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（2011620002001）。

作者簡(jiǎn)介 李進(jìn)波（1971- ），男，湖北天門(mén)人，副研究員，碩士，從事水稻分子育種研究。

收稿日期 20150114

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是一種世界性的稻作病害，在世界各個(gè)水稻生產(chǎn)國(guó)或地區(qū)每年都有不同程度的發(fā)生[1]。在我國(guó)每年都有幾個(gè)稻作區(qū)中等或偏重流行，且過(guò)去20年有增長(zhǎng)趨勢(shì)[2-3]。據(jù)全國(guó)農(nóng)作物重大病蟲(chóng)害預(yù)警，2012年稻瘟病在我國(guó)發(fā)病面積為533萬(wàn)hm2，較2011年增加20%[4]。實(shí)踐證明，在眾多的防治措施中抗病品種的培育和種植是控制該病害最為經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法[5]。然而，由于稻瘟病病原菌生理小種的復(fù)雜性和致病性的多樣性，使得現(xiàn)有抗病品種的抗性易被克服而很快喪失抗性。因此不斷發(fā)現(xiàn)和利用新的抗稻瘟病基因，應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇聚合多個(gè)抗性基因，是培育具有持久抗性和綜合抗性品種的有效策略。

20世紀(jì)60年代中期，日本率先開(kāi)展了水稻抗稻瘟病基因的研究工作，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鑒別體系。隨后，國(guó)際水稻研究所和我國(guó)等產(chǎn)稻國(guó)也逐漸開(kāi)展了水稻稻瘟病抗性遺傳的系統(tǒng)性研究。截至2013年8月，已至少報(bào)道了68個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)共83個(gè)主效基因，23個(gè)基因已被成功克隆[6]。其中Pi1和Pi2基因是2個(gè)顯性廣譜抗稻瘟病基因，對(duì)我國(guó)各稻區(qū)菌株表現(xiàn)廣譜抗性，在抗稻瘟病抗性育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[7-9]。

Pi1基因被定位在第11染色體長(zhǎng)臂末端，位于2個(gè)RFLP （restriction fragment length polymorphism） 標(biāo)記RZ536和NPB181之間，遺傳距離分別為7.9和3.5 cM[10-11]，陳志偉等[12]將其進(jìn)一步定位在SSR標(biāo)記MGR4766附近，距離僅1.3 cM。Pi2基因被定位在第6染色體的短臂上，位于2個(gè)RFLP標(biāo)記RG64和RZ612之間[13-14]，吳金紅等[15]將其進(jìn)一步定位在RG64和SSR標(biāo)記AP22之間，遺傳距離分別為0.9和1.2 cM。這些研究為利用分子標(biāo)記輔助選擇Pi1和Pi2基因培育抗稻瘟病水稻品種奠定了基礎(chǔ)。目前，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)聚合Pi1基因和Pi2基因已有許多成功的例子，如柳武革等[16]利用分子標(biāo)記選擇技術(shù)將Pi1基因和Pi2基因聚合到感病不育系GD7S中，獲得5個(gè)Pi1和Pi2基因純合的不育系RGD7S1、RGD7S2、RGD7S3、RGD7S4和RGD7S5，人工接種鑒定表明5個(gè)改良株系抗病頻率達(dá)94.12%～97.06%，自然病圃葉瘟和穗瘟均為0級(jí)，綜合評(píng)價(jià)達(dá)高抗水平。陳紅旗等[17]利用分子標(biāo)記選擇技術(shù)將3個(gè)抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pi33聚合到金23B中，導(dǎo)入系W1對(duì)稻瘟病的抗病頻率為96.7%，明顯高于攜帶單個(gè)基因的C104LAC（Pi1）和C101A51（Pi2）。胡杰等[18]利用分子標(biāo)記選擇技術(shù)將Pi1和Pi2基因聚合到改良的珍汕97B中，穗頸瘟田間自然發(fā)病結(jié)果表明，雙基因聚合材料的發(fā)病率僅為0.8%，穗頸瘟抗性級(jí)別為1級(jí)，聚合Pi和Pi基因的雜交稻組合穗頸瘟發(fā)病率約6%，而不帶Pi1和Pi2基因的7個(gè)雜交稻組合的發(fā)病率均較高（約90%）。

筆者利用攜帶抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的GD7為供體親本，以目前應(yīng)用面積最廣的恢復(fù)系之一揚(yáng)稻6號(hào)為受體親本，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育和MAS相結(jié)合，旨在培育綜合性狀優(yōu)良、抗稻瘟病的水稻恢復(fù)系和雜交組合。

1 材料與方法

1.1 材料 攜帶抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的供體親本GD7引自廣東農(nóng)科院水稻研究所，受體親本揚(yáng)稻6號(hào)引自江蘇里下河農(nóng)科所。

1.2 雜交和選擇程序 以揚(yáng)稻6號(hào)作母本，GD7作父本雜交獲得F1代雜交種，然后以揚(yáng)稻6號(hào)作輪回親本連續(xù)回交2次，再自交4次獲得BC3F5株系。在回交過(guò)程中從BC1F1開(kāi)始用分子標(biāo)記檢測(cè)抗稻瘟病基因Pi1和Pi2，選擇帶有目標(biāo)基因且農(nóng)藝性狀偏向揚(yáng)稻6號(hào)的單株作父本。在BC3F3中選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系檢測(cè)目標(biāo)基因，選擇Pi1和Pi2基因均純合的株系。

1.3 分子標(biāo)記檢測(cè)中使用的分子標(biāo)記 Pi1基因的檢測(cè)是利用與其緊密連鎖的SSR標(biāo)記MRG4766[9]，Pi2基因的檢測(cè)是利用與其緊密連鎖的SSR標(biāo)記AP22[12]，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系總體積為15 μl，包括1.5 μl 10×buffer， 1.2 μl dNTPs （各2.5 mmol），引物各0.3 μl（10 μmol），1 U Taq DNA聚合酶，50 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸5 min。Taq DNA聚合酶和其他相關(guān)試劑均購(gòu)自大連寶生物有限公司。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，結(jié)合銀染顯色檢測(cè)[19]。分子標(biāo)記的引物信息見(jiàn)表1。

1.4 稻瘟病抗性鑒定 在湖北省水稻品種區(qū)域試驗(yàn)的稻瘟病抗性鑒定點(diǎn)恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院和宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院對(duì)稻瘟病進(jìn)行自然誘發(fā)鑒定，2013年對(duì)10個(gè)BC3F4代株系進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性對(duì)照為供體親本GD7，陰性對(duì)照為受體親本揚(yáng)稻6號(hào)，2014年對(duì)雜交組合廣占63S/R587進(jìn)行鑒定，陰性對(duì)照為揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)（廣占63S/揚(yáng)稻6號(hào)）。每份材料種植20穴，2次重復(fù)，周?chē)N植高感品種C039誘發(fā)發(fā)病。稻瘟病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照楊仕華等[20]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記輔助選擇及Pi1和Pi2基因純合系的獲得 利用與Pi1和Pi2基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記MRG4766和AP22對(duì)抗性基因供體親本GD7和受體親本揚(yáng)稻6號(hào)進(jìn)行多態(tài)性分析。MRG4766在供體親本中擴(kuò)增產(chǎn)物片段較大，在揚(yáng)稻6號(hào)中擴(kuò)增產(chǎn)物片段較?。▓D1）；AP22在供體親本中擴(kuò)增產(chǎn)物片段較小，在揚(yáng)稻6號(hào)中擴(kuò)增產(chǎn)物片段較大（圖2），MRG4766和AP22在供體親本GD7和受體親本揚(yáng)稻6號(hào)之間都具有多態(tài)性。

回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇按以下程序進(jìn)行：供體親本GD7與輪回親本揚(yáng)稻6號(hào)雜交，在F1中去除假雜種后與揚(yáng)稻6號(hào)回交。在BC1F1群體中，經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)選擇帶有Pi1和Pi2基因的單株（圖1、2）與揚(yáng)稻6號(hào)回交得到BC2F1。在BC1F2群體中，經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)獲得帶有Pi1和Pi2基因的單株，選擇農(nóng)藝性狀偏向揚(yáng)稻6號(hào)的單株作父本，取混合花粉繼續(xù)與揚(yáng)稻6號(hào)回交得到BC3F1。在BC3F1群體中，經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)獲得帶有Pi1和Pi2基因的單株，分單株收種后種植成BC3F2株系，成熟后選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株。種植BC3F3株系后苗期取混樣檢測(cè)Pi1和Pi2基因，獲得Pi1和Pi2基因均純合的株系。再根據(jù)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，從基本整齊的株系中選擇到10個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的Pi1和Pi2基因聚合系。

2.2 Pi1和Pi2基因聚合系和雜交組合的抗性鑒定 2013年分別在湖北省恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院和湖北省宜昌農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻瘟病抗性鑒定點(diǎn)對(duì)這10個(gè)基因聚合系進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定。鑒定結(jié)果表明10個(gè)株系的抗性綜合指數(shù)在0.8～2.0，表現(xiàn)為抗，其抗性與供體親本GD7的抗性在同一個(gè)水平，而受體親本揚(yáng)稻6號(hào)的抗性綜合指數(shù)分別為8.8和8.5，抗級(jí)為9，表現(xiàn)為高感（表2、3）。說(shuō)明通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)導(dǎo)入Pi1和Pi2基因能顯著提高受體親本的稻瘟病抗性。

根據(jù)BC3F4株系田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，綜合性狀優(yōu)良的株系13C587入選，暫定名為R587。2014年春季在海南利用不育系廣占63S與R587配制雜交組合，同年正季分別在恩施和宜昌進(jìn)行抗性鑒定，鑒定結(jié)果表明廣占63S/R587的抗性綜合指數(shù)分別為2.5和3.5，抗級(jí)為3，表現(xiàn)為中抗，而對(duì)照品種揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)的抗性綜合指數(shù)為7.9和8.2，抗級(jí)為9，表現(xiàn)為高感。說(shuō)明Pi1和Pi2基因聚合系與不育系配制的雜交組合的稻瘟病抗性也明顯增強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

目前生產(chǎn)上應(yīng)用的骨干不育系和恢復(fù)系及其配制的組合稻瘟病抗性不強(qiáng)，限制了其推廣應(yīng)用。筆者對(duì)參加2013年湖北省中稻區(qū)試和2014年湖北省中稻區(qū)試的組合進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，在2013年湖北省中稻區(qū)試中可以確定以廣占63S為母本配制的雜交組合13個(gè)（包括對(duì)照品種揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)），區(qū)試稻瘟病抗性鑒定結(jié)果2個(gè)組合的抗級(jí)為3級(jí)，2個(gè)組合的抗級(jí)為5級(jí)，1個(gè)組合的抗級(jí)為7級(jí)，其余8個(gè)組合的抗級(jí)為9級(jí)，少數(shù)組合的稻瘟病抗性較好，很可能是其恢復(fù)系的稻瘟病抗性得到了改良。在2014年湖北省中稻區(qū)試中可以確定以廣占63S為母本配制的雜交組合18個(gè)，區(qū)試稻瘟病抗性鑒定結(jié)果除1個(gè)組合抗級(jí)為3級(jí)外，其余17個(gè)組合（包括對(duì)照品種揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)）的抗級(jí)都為9級(jí)，其中有13個(gè)組合的抗性綜合指數(shù)在7.0以上，未達(dá)到湖北省水稻品種審定委員會(huì)規(guī)定的稻瘟病抗性綜合指數(shù)≤7.0的標(biāo)準(zhǔn)，也就意味著在湖北省中稻區(qū)試中，以廣占63S為母本配制的雜交組合大多數(shù)會(huì)因其稻瘟病抗性差而不能通過(guò)品種審定。在該研究中以廣占63S為母本與Pi1和Pi2基因聚合系R587配制的雜交組合，在湖北省水稻品種區(qū)試稻瘟病抗性鑒定點(diǎn)抗級(jí)能達(dá)到3級(jí)，抗性綜合指數(shù)在3.5以下，與對(duì)照品種揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)相比其稻瘟病抗性得到了明顯的改良。目前正在安排廣占63S/ R587的試制種和品種比較試驗(yàn)，如果廣占63S/ R587能保持揚(yáng)兩優(yōu)6號(hào)的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)和品質(zhì)性狀，在湖北省水稻生產(chǎn)中將具有廣闊的應(yīng)用前景。

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責(zé)任編輯 喬利利 責(zé)任校對(duì) 李巖