張修景

（菏澤學(xué)院化學(xué)與化工系，山東菏澤274015）

CdTe為熒光探針測定羅漢參中的混合氨基酸

張修景

（菏澤學(xué)院化學(xué)與化工系，山東菏澤274015）

制備一種新型量子點(diǎn)CdTe，建立一種以CdTe為熒光探針測定羅漢參中混合氨基酸的方法。向熒光量子點(diǎn)CdTe溶液中加入Co2+后其熒光強(qiáng)度降低，降低的程度在一定范圍內(nèi)與Co2+濃度成線性關(guān)系；加入氨基酸后，熒光強(qiáng)度又得到恢復(fù)，而量子點(diǎn)熒光的恢復(fù)強(qiáng)度與加入氨基酸的濃度呈線性關(guān)系。在混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0×10-8～5.5×10-7mol/L線性范圍內(nèi)，量子點(diǎn)熒光的恢復(fù)強(qiáng)度與混合氨基酸濃度的線性方程為y=1.04×106x+1.013，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995?？疾炝瞬煌彌_溶液、pH、Co2+濃度等因素對體系造成的影響。結(jié)果表明，在pH=9.5的硼砂緩沖溶液中，2.0×10-5mol/L的Co2+能很好的猝滅CdTe熒光。應(yīng)用于實(shí)際樣品測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）為3.0%，加標(biāo)回收率在98.3%～104.4%范圍內(nèi)，檢出限為1.1×10-8mol/L。該方法簡單、快速，實(shí)用性強(qiáng)。

熒光量子點(diǎn)，CdTe，羅漢參，氨基酸

量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs），又稱為納米晶，其粒徑一般介于1～10nm之間［1］。由于電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成具有分子特性的分立能級結(jié)構(gòu)，受激發(fā)后可以發(fā)射熒光［2］?；诹孔有?yīng)，量子點(diǎn)在太陽能電池、發(fā)光器件、光學(xué)生物標(biāo)記、生物檢測和生物成像等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景［3］。

羅漢參（香芋）產(chǎn)于山東單縣。山東大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室對羅漢參的營養(yǎng)分析表明，羅漢參干物質(zhì)中富含特殊功能因子抗性淀粉［4］38.2%、粗蛋白17.3%、還原性糖4.2%。且含有較多的纖維素、氨基酸和硒［5］等。通過動物和人體實(shí)驗(yàn)羅漢參食后具有降膽固醇，降甘油脂，降血糖［6］；潤腸通便，預(yù)防便秘［7］；促進(jìn)腸道毒素的分解和排出，預(yù)防胃腸癌的發(fā)生等作用。食用則清香甘甜，風(fēng)味獨(dú)特。近年來，人們把羅漢參作為保健食品。

氨基酸是“生命的基石”，缺少它會導(dǎo)致夸希奧素病，其表現(xiàn)為貧血、浮腫、胃潰瘍、生長停止和大腦活動功能減退等癥狀［8］。目前，測定氨基酸的方法有分光光度法［9］、分子熒光法［10］、液相色譜法［11］、氨基酸自動檢測儀等方法。后兩種方法費(fèi)用相對較高。且氨基酸自動檢測儀結(jié)構(gòu)復(fù)雜，測定結(jié)果受pH影響較大。分光光度法，操作方便，靈敏度有限，檢出限不夠理想。本文研究了一種熒光猝滅恢復(fù)法，先制備量子點(diǎn)CdTe，然后以CdTe為熒光探針測定羅漢參中混合氨基酸的含量。方法準(zhǔn)確，檢出限低，可以適用于羅漢參等食品中微量氨基酸的檢測。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅漢參山東單縣天祥羅漢參專業(yè)合作社生產(chǎn)的華福牌；硝酸鈷、氫氧化鈉、硼砂、巰基乙酸、Te粉、氯化鎘分析純；L-酪氨酸、L-脯氨酰胺、甘氨酸、L-賴氨酸堿、D-天門冬氨酸、L-天冬酰胺、L-纈氨酸、L-色氨酸、L-白氨酸、L-胱氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸鹽酸鹽、DL-絲氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-異亮氨酸、D-谷氨酸、D-脯氨酸、D-焦谷氨酸生化試劑；實(shí)驗(yàn)用水三重蒸餾水。

F-280熒光分光光度計(jì)天津港東科技發(fā)展股份有限公司；303型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司；DHT型攪拌調(diào)溫電熱套山東鄆城光明儀器中心；分析天平沈陽龍騰電子有限公司；S-4800型高分辨場發(fā)射掃描電鏡日本日立公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CdTe水溶性量子點(diǎn)的合成制備Te前軀體的制備：在20m L的小燒杯內(nèi)，加入0.3060g的Te粉，量取6m L水倒入燒杯內(nèi)，開動磁力攪拌；另取一個20m L小燒杯，稱量0.1903g NaBH4放入燒杯內(nèi)，加入6m L水用玻璃棒攪拌至NaBH4溶解為無色溶液，并將其倒入溶有Te粉的燒杯，并在保持磁力攪拌60℃的條件下反應(yīng)20m in，得到淡紫色透明的NaHTe溶液，備用。

Cd前軀體的制備：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向250m L三口燒瓶中，加入100m L水，在磁力攪拌下將1.142g的CdCl2·2H2O溶于水中，然后將0.84m L巰基乙酸加入CdCl2水溶液中，再用1mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為10.00。

CdTe合成：在氮?dú)獗Ｗo(hù)和適當(dāng)攪拌下將NaHTe水溶液加入Cd前軀體的三口燒瓶中，加熱至沸騰后，回流2h。獲得棕黃色的CdTe量子點(diǎn)。

1.2.2pH=9.5的硼砂緩沖溶液的配制準(zhǔn)確取1.7657g硼砂溶解后，轉(zhuǎn)入100m L容量瓶得0.045mol/L硼砂儲備溶液，稱取0.8000gNaOH，攪拌溶解后轉(zhuǎn)入100m L容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得到0.2000mol/L NaOH溶液，取25.00m L硼砂儲備液和8.80m L NaOH溶液于100m L容量瓶，搖勻，定容得pH=9.5的硼砂緩沖溶液。

1.2.3鈷離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取0.2910g硝酸鈷（分析純）放入100m L容量瓶稀釋至刻度，得0.01000mol/L的鈷離子儲備液，再分別取一定體積的儲備液逐級稀釋得到0、2.0×10-6、6.0×10-6、1.0×10-5、2.0×10-5、3.0×10-5mol/L的系列鈷離子標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取0.01098g L-酪氨酸、0.006979g L-脯氨酰胺、0.01759g甘氨酸、0.00886g L-賴氨酸堿、0.008067g D-天門冬氨酸、0.009099g L-天冬酰胺、0.007029g L-纈氨酸、0.01238g L-色氨酸、0.008010g L-白氨酸、0.01456g L-胱氨酸、0.009043g L-蛋氨酸、0.01056 L-精氨酸鹽酸鹽、0.009642 DL-絲氨酸、0.01001g DL-苯丙氨酸、0.007950g DL-異亮氨酸、0.008909g D-谷氨酸、0.006979g D-脯氨酸、0.007825g D-焦谷氨酸置于100m L燒杯中，加適量水，適當(dāng)加熱，攪拌使之完全溶解，冷卻后，溶液轉(zhuǎn)入500m L容量瓶中定容，搖勻，得1.20×10-4mol/L混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取上述溶液3.34m L于100m L容量瓶中，稀釋定容后得到4.00× 10-6mol/L混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。分別取不同量的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液（0、1.00、3.00、5.00、7.50、11.00、15.00m L）于7個100m L的容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得到0、4.0×10-8、1.2×10-7、2.0×10-7、3.0×10-7、4.4×10-7、6.0×10-7mol/L的系列混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.5樣品制備取羅漢參兩個，用蒸餾水洗凈，于30℃干燥箱內(nèi)烘5h后，取出，在分析天平上稱量得其質(zhì)量為29.3600g，用不銹鋼刀切碎之后，再用150m L的10%CH3COOH研磨成勻漿，提取氨基酸，由于鮮羅漢參中的蛋白質(zhì)酶能水解蛋白質(zhì)，造成游離的氨基酸含量升高，故研磨要在冰水浴中進(jìn)行，又因?yàn)榱_漢參果肉中的脂類、蛋白質(zhì)、糖類等易析出，需要加入100m L 95%的乙醇試劑放置一夜除去沉淀，然后抽濾以除去蛋白質(zhì)，最后用乙酸乙酯萃取除去脂類，轉(zhuǎn)移至250m L容量瓶，定容即可獲得含有混合氨基酸的試液。

1.2.6分析方法取6支5m L的比色管，分別加入0.50m L的CdTe，再分別加入0.50m L不同濃度的Co2+溶液，用pH=9.5的硼砂緩沖溶液定容，放置5.00m in，于λex=400nm處測定熒光強(qiáng)度IF。分析求得合適的Co2+濃度，用來猝滅CdTe量子點(diǎn)的熒光。

于7支5m L的比色管中分別加入0.50m L的CdTe，0.50m L上述求出的合適濃度的Co2+溶液，分別加入1.00m L不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，用pH=9.5的硼砂緩沖溶液定容，放置5.00m in，于λex=400nm處測定熒光強(qiáng)度IF，制得氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

于6支5m L的比色管中分別加入0.50m L的CdTe，0.50m L上述求出的合適濃度的Co2+溶液，各自加入1.00m L稀釋的樣品溶液，用pH=9.5的硼砂緩沖溶液定容，放置5.00m in，于λex=400nm處測定熒光強(qiáng)度IF，按照氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程，計(jì)算樣品中氨基酸的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1CdTe量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)分析

對合成的CdTe量子點(diǎn)的形貌通過S-4800型高分辨場發(fā)射掃描電鏡（FESEM）在20KV電壓下觀測照片如圖1。CdTe量子點(diǎn)的顆粒直徑為3～7nm，平均尺寸為5nm，尺寸分布較為均一。

對CdTe量子點(diǎn)從200～760nm做光譜掃描，得最大的吸收峰位于533nm處；并做分子熒光發(fā)射光譜得在400nm激發(fā)波長下，熒光的最大發(fā)射波長為545nm。

圖1　CdTe量子點(diǎn)的電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.1　Electronmicrographs of CdTe quantum dots

2.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1體系pH的選擇采用pH=9.5的硼砂緩沖溶液可以較好控制酸度，可以使Co2+與CdTe量子點(diǎn)反應(yīng)，發(fā)生很好的猝滅效果，且用該緩沖液定容效果最佳，此時(shí)，體系在室溫下反應(yīng)5m in即完成，且至少可以穩(wěn)定1h以上。

2.2.2儀器參數(shù)的選擇通過設(shè)置不同的參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，儀器的激發(fā)狹縫為10nm，發(fā)射狹縫為10nm，靈敏度為0.5，增益為1，儀器的激發(fā)波長為400nm，發(fā)射起始波長為450nm，終止波長為750nm時(shí)對體系的熒光強(qiáng)度測量，會得到較好效果。

2.2.3共存物質(zhì)的影響氨基酸濃度為1.0×10-7mol/L時(shí)，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下對多種共存物質(zhì)進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。當(dāng)相對誤差在±5%以內(nèi)時(shí)，各共存物質(zhì)的允許量為（以10-6mol/L計(jì)）：Ca2+（125）、NO2-（200）、NH4+（100）、Hg2+（60）、Cu2+（50）、Mg2+（100）、Fe3+（30）、L-葡萄糖（100）、檸檬酸（100）、D-果糖（120）、淀粉（120）、L-鼠李糖（120）等。

2.2.4Co2+作為猝滅劑其濃度的選擇室溫下，在CdTe體系中加入等量的由1.2.3配制的系列Co2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)1.2.6的實(shí)驗(yàn)方法來測定，以發(fā)射波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度IF為縱坐標(biāo)得到的熒光譜圖見圖2，由圖2可以看出：隨著加入Co2+濃度的不斷增加，CdTe的熒光發(fā)生不同程度猝滅，其熒光強(qiáng)度逐漸下降。由于CdTe表面大量的羧基和巰基官能團(tuán)，與Co2+形成復(fù)合物，Co2+與巰基乙酸形成的復(fù)合物覆蓋在CdTe的表面，并與CdTe發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生了更多的非輻射中心，導(dǎo)致CdTe熒光猝滅，且其猝滅程度與猝滅劑濃度間呈線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)選用2.0×10-5mol/L Co2+猝滅量子點(diǎn)的熒光。

圖2　Co2+猝滅CdTe的熒光光譜圖Fig.2　The fluores spectra of CdTe quenched by Co2+

2.3混合氨基酸對體系中已猝滅的CdTe熒光的恢復(fù)

2.3.1加入系列混合氨基酸的恢復(fù)現(xiàn)象按照1.2所示的實(shí)驗(yàn)方法，在2.2所示的實(shí)驗(yàn)條件下，在加入2.0× 10-5mol/L Co2+的CdTe體系中，加入1.2.4配制的一系列氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定體系的熒光強(qiáng)度，隨著加入氨基酸濃度的增大，體系的熒光強(qiáng)度也相應(yīng)的增大，以發(fā)射波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，得到圖3。

圖3　氨基酸對CdTe熒光的恢復(fù)圖Fig.3　The recovery of amino acino on CdTe

2.3.2恢復(fù)機(jī)理探討因?yàn)镃o2+可與氨基酸分子中α位羰基氧和氨基氮的配位，形成1∶2的配合物，可將Co2+從量子點(diǎn)表面競爭下來，使得CdTe熒光強(qiáng)度得以恢復(fù)。

2.3.3氨基酸的工作曲線按照1.2所示的實(shí)驗(yàn)方法，在2.2所示的實(shí)驗(yàn)條件下，于加入2.0×10-5mol/L Co2+的CdTe體系中，加入1.2.4配制的一系列氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定體系的熒光強(qiáng)度，見表1。IF為加入系列標(biāo)準(zhǔn)氨基酸后體系的熒光強(qiáng)度，IF0為空白溶液時(shí)體系的熒光強(qiáng)度。

表1　氨基酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測定數(shù)據(jù)Table 1　The determination data of a series of amino acid standard solution

根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，以IF/IF0為縱坐標(biāo)，氨基酸的濃度為橫坐標(biāo)繪圖得工作曲線，混合氨基酸濃度在2.0×10-8～5.5×10-7mol/L范圍內(nèi)與體系的熒光恢復(fù)強(qiáng)度呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=1.04×106x+ 1.013，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。

2.4樣品分析、精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取1.2.5試液各1m L分別放入5個100m L容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。按照1.2.6中的實(shí)驗(yàn)方法，分別測量體系熒光強(qiáng)度IF，其值分別為945.0、950.0、957.9、940.0、927.9；IF0=713.2。則其IF/IF0分別為1.325、1.332、1.343、1.318、1.301。代入曲線方程計(jì)算其濃度分別為3.000×10-7、3.067×10-7、3.173×10-7、2.933×10-7、2.856×10-7mol/L，其平均值是3.006×10-7mol/L，羅漢參中含混合氨基酸總量718.3mg/kg，18種氨基酸的平均含量是39.91mg/kg。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）是3.0%（n=5），可見測定方法的精密度較好。再對樣品在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，各自進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見表2。

表2　氨基酸的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　The result of amino acid recovery experiment

根據(jù)測量值，計(jì)算得羅漢參中混合氨基酸的加標(biāo)回收率在98.3%～104.4%之間。對于空白溶液在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，測定11次熒光強(qiáng)度，根據(jù)（S/N=3）計(jì)算得檢出限是1.1×10-8mol/L。

3　結(jié)論

本文研究了選用CdTe為熒光探針測定羅漢參中的混合氨基酸的方法。測定的羅漢參中含混合氨基酸總量是718.3mg/kg。測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，測定方法簡便，可推廣使用。揭示了羅漢參是富含氨基酸的營養(yǎng)食品，對人體健康有很高的食用價(jià)值。為人們認(rèn)識羅漢參提供了科學(xué)依據(jù)。

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CdTe as fluorescent probe to determ ine the m ixed am ino acids in Luohanshen

ZHANG Xiu-jing
（Chemistry and Chemical Engineering Faculty in Heze College，Heze 274015，China）

A new type of CdTe quantum dots（QDs）was p repared.The method was estab lished to determ ine the m ixed am ino acids in Luohanshen by CdTe as fluorescent p robe.After add ing the Co2+fluorescent quantum dots into the CdTe solution，the fluorescence intensity reduced.The reduced extent had a linear relationship w ith the concentration of Co2+in a certain range.After adding the am ino acids，the fluorescence intensity restored，and the quantum fluorescence intensity was linear w ith the concentration of am ino acids.In the m ixed acids standard solution w ith the linear range of 2.0×10-8mol/L to 5.5×10-7mol/L，the linear equation of the recovery intensity of quantum dots fluorescence and the m ixed acids concentration was y=1.04×106x+ 1.013.The correlation coefficient was R2=0.9995.The influence fac tors on the system caused by the different buffer solution，pH value and Co2+concentration，etc were exam ined.The result showed that，in borax buffer solution w ith pH=9.5，the Co2+solution 2.0×10-5mol/L could be better Cd Te fluorescence.The relative standard deviation used tomeasure the acture samp le（n=5）was 3.0%.The recovery rate was between 98.3%to 104.4%. The detection lim itwas 1.1×10-8mol/L.The method was sim p le，rap id and p ractical.

QDS；CdTe；Luo han shen；am ino acid

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0062-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.004

2014-06-17

張修景（1957-），男，本科，副教授，研究方向：譜學(xué)分析與食品的測定研究。

山東省“十二五”重點(diǎn)學(xué)科應(yīng)用化學(xué)資助項(xiàng)目（2011350-1）。