楊梅等

摘要：對(duì)印度塊菌接種美國(guó)山核桃合成菌根苗技術(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：用印度塊菌孢子接種美國(guó)山核桃無(wú)菌苗，3個(gè)月后形成根尖淡乳色的、基部淡黃色的、黃褐色外生菌根。外生菌根為單軸狀和羽狀結(jié)構(gòu)，外延菌絲為透明、半透明、近直角分支、絮狀著生在菌根表面，菌根橫切面上能觀察到形狀像馬蹄形的哈蒂氏網(wǎng)結(jié)構(gòu)。在Leica S6D解剖鏡測(cè)量單根菌根平均長(zhǎng)為0.16 cm，平均直徑為0.039 cm。分子測(cè)序ITS序列同源性為100%，同時(shí)采用的是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，測(cè)序峰圖清晰、無(wú)重疊峰，由此可以確定美國(guó)山核桃形成菌根的只有印度塊菌。

關(guān)鍵詞：印度塊菌；美國(guó)山核桃；菌根；外延菌絲

中圖分類號(hào)：S664.104文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0267-03

塊菌為子囊菌類中的塊菌目（Tuberales）塊菌科（Tuberaceae）塊菌屬（Tuber spp.）的一類地下珍貴食用真菌[1]。營(yíng)養(yǎng)豐富且具有奇異香味，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值為世人所矚目，因產(chǎn)量有限，國(guó)際市場(chǎng)上供不應(yīng)求，價(jià)格昂貴，并始終排在所有食用菌之首[2]，被譽(yù)為 “餐桌上的鉆石、地下黃金”[3]。

攀枝花是商業(yè)印度塊菌的天然理想產(chǎn)區(qū)之一，野生塊菌最高產(chǎn)量可達(dá)100 t/年，在我國(guó)塊菌外貿(mào)出口中占有重要地位，成為山區(qū)農(nóng)民增收致富的主要來(lái)源，在四川省米易縣、鹽邊縣和仁和區(qū)的一些采集塊菌的村子，平均每戶年收入2 000元左右，最高的可達(dá)6萬(wàn)元。由于其市場(chǎng)價(jià)格極高而市場(chǎng)需求日甚，人們超強(qiáng)度采挖，導(dǎo)致塊菌資源顯著減少，瀕臨滅絕，已經(jīng)危及到塊菌的可持續(xù)發(fā)展和永續(xù)利用。因此，發(fā)展塊菌的人工栽培勢(shì)在必行，而塊菌菌根苗培育是實(shí)現(xiàn)塊菌人工栽培的前提?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)已報(bào)道的果樹與塊菌共生的樹種僅有板栗和榛子，2種樹種都是中高海拔的植物，而對(duì)低海拔的經(jīng)濟(jì)果樹與塊菌共生的研究未見報(bào)道。美國(guó)山核桃[Carya illinoensis （Wangenn.） K.Koch]屬胡桃科高大喬木，是世界上四大堅(jiān)果之一[4]。美國(guó)山核桃殼薄，易取仁，出仁率50%～70%，含油率70%～80%，不飽和脂肪酸含量60%左右，且不飽和脂肪酸和對(duì)人體有益的各種氨基酸比油橄欖高。美國(guó)山核桃定植后4～5年開始掛果，10年開始盛產(chǎn)，盛產(chǎn)期50～70年，產(chǎn)量達(dá)1 500～3 750 kg/hm2，國(guó)際市場(chǎng)上6～8美元/kg，國(guó)內(nèi)超市60～120元/kg，是普通核桃的4～6倍，是唯一一個(gè)適合低海拔栽培的核桃品種。

塊菌屬于菌根真菌，它必須與適合的宿主植物形成共生關(guān)系，否則無(wú)法形成子實(shí)體[5]。根據(jù)“適樹適菌”的原則，為實(shí)現(xiàn)美國(guó)山核桃和塊菌栽培效益的最大化，本試驗(yàn)開展了印度塊菌接種美國(guó)山核桃合成菌根技術(shù)的研究，采用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)的方法確定印度塊菌與美國(guó)山核桃能形成菌根[6]，并觀察在菌根生長(zhǎng)過程中的形態(tài)變化，建立了美國(guó)山核桃與印度塊菌合成菌根苗的顯微檢測(cè)方法，為實(shí)現(xiàn)印度塊菌人工栽培提供科學(xué)依據(jù)。本研究為印度塊菌的人工栽培提供新的共生樹種，填補(bǔ)了低海拔區(qū)域沒有果樹與塊菌共生的空白，對(duì)實(shí)現(xiàn)塊菌與果樹栽培效益的最大化有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1塊菌菌種在攀枝花市場(chǎng)上購(gòu)買成熟度高、個(gè)頭大、外型好、無(wú)損傷、香味相對(duì)較濃的印度塊菌子實(shí)體作為菌種（圖1、圖2 ）。

1.1.2供試樹種從云南大理的漾濞購(gòu)買美國(guó)山核桃種子（圖3）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1塊菌的處理和菌種的制備將收集的印度塊菌先用牙刷輕輕洗凈表面泥土，在75%乙醇中浸泡3 min，然后在超凈工作臺(tái)上用乙醇燈火焰快速灼燒后與121～126 ℃高溫高壓滅菌2 h的河沙混合密封，并于3～5 ℃的溫度下冷藏保存?zhèn)溆?。將塊菌子實(shí)體取出，用粉碎機(jī)粉碎成直徑小于 1 mm 的顆粒，與高溫高壓滅菌2 h后用烘箱烘干的細(xì)土按照1 ∶10的比例混合，放置在3～5 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2育苗基質(zhì)的處理接種前培育幼苗所用的基質(zhì)按照珍珠巖 ∶蛭石=1 ∶1的比例均勻混合裝入布袋中，在121～126 ℃下滅菌2 h。移植和接種苗培育基質(zhì)按照腐殖土 ∶蛭石 ∶河沙=1 ∶1 ∶2的比列混合均勻，再用1 mol/L的生石灰溶液調(diào)pH值至7左右裝入布袋中，在121～126 ℃下滅菌2 h。

1.2.3接種前幼苗培育將美國(guó)山核桃種子用清水沖洗干凈，再用0.3%高錳酸鉀溶液浸種消毒48 h，清水沖洗干凈，用紗布包好放置在30 ℃的恒溫箱中進(jìn)行催芽，堅(jiān)持每天用清水沖洗，防治雜菌滋生，并撿出裂口的種子，未裂口的繼續(xù)放入恒溫箱中催芽。將裂口的種子播種于處理好的基質(zhì)中，在攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院溫室大棚中進(jìn)行育苗管理，待苗木生長(zhǎng)到3個(gè)月達(dá)到一定的木質(zhì)化即莖稈由綠色轉(zhuǎn)為褐色可接種（圖4）。

1.2.4塊菌接種方法接種時(shí)選擇根系發(fā)達(dá)、苗色較好的幼苗，用經(jīng)過消毒的剪刀剪去主根。在黑色硬塑料杯中先裝入1/3的上述滅菌基質(zhì)，將苗放入杯中，再將配置好的印度塊菌菌種按照每株含200萬(wàn)～700萬(wàn)個(gè)塊菌子囊孢子的劑量接種在幼苗根上，使幼苗根系與菌種緊密結(jié)合，最后添加滅菌基質(zhì)，壓實(shí)。接種后澆透定根水，掛牌并標(biāo)明接種時(shí)間、接種菌名。接種時(shí)設(shè)置相應(yīng)的未接種對(duì)照，將接種的幼苗和未接種的幼苗放置于攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院溫室大棚中培養(yǎng)，接種苗按常規(guī)管理，使基質(zhì)保持濕潤(rùn)，控溫不超過35 ℃，溫度過高要加遮陽(yáng)網(wǎng)或噴水降溫。

1.2.5試驗(yàn)設(shè)計(jì)與觀察本試驗(yàn)采用印度塊菌接種美國(guó)山核桃無(wú)菌苗，苗木接種3個(gè)月后開始每個(gè)月按5%隨機(jī)抽樣在Leica S6D解剖鏡下觀察菌根的感染情況；接種6個(gè)月后，按照接種苗木數(shù)量的10%進(jìn)行隨機(jī)抽樣，根部用清水洗凈泥土，再用解剖鏡Leica S6D檢查根部感染情況，隨機(jī)選取30個(gè)菌根測(cè)量菌根的長(zhǎng)度和粗度，隨意選取任意一株切取菌根的根尖作切片，在顯微鏡OLYMPYSBX-41 40倍下觀察菌根的外延菌絲、馬賽克現(xiàn)象、菌套，記錄其特征并照相。

1.2.6菌根分子檢測(cè)從已接種印度塊菌6個(gè)月后的美國(guó)山核桃菌根上采取20個(gè)左右，在Leica S6D解剖鏡下用軟毛刷刷掉泥土，清洗干凈后用改進(jìn)的CTAB法提取菌根的DNA，方法參照文獻(xiàn)[7]，通過測(cè)定其菌根ITS序列的辦法鑒定菌根上的真菌，ITS序列PCR擴(kuò)增引物為ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），擴(kuò)增片段測(cè)序后與接種用的印度塊菌的序列進(jìn)行比較，以確定形成菌根菌的是否是印度塊菌。

2結(jié)果與分析

2.1美國(guó)山核桃印度塊菌菌根特征與感染率檢測(cè)

對(duì)接種印度塊菌3個(gè)月的美國(guó)山核桃樹苗進(jìn)行菌根特征與感染率檢測(cè)，在Leica S6D解剖鏡40倍下觀察，未接種的美國(guó)山核桃未見任何菌根形成，僅見粗短的根毛，營(yíng)養(yǎng)根不膨大，先端尖銳（圖5）；接種的根較粗壯，基部淡黃色，頂端淡乳色、發(fā)亮的單軸和羽狀的菌根形態(tài)（圖6），印度塊菌與美國(guó)山核桃樹形成的菌根其外延菌絲呈棉絮狀（圖7、圖8）、透明、半透明的。Olympus CX41顯微鏡下作菌根切片10倍×40倍下觀察到外延菌絲近直角分支（圖9），菌絲是從根系表皮細(xì)胞間隙向皮層伸展，并在皮層細(xì)胞之間交織成網(wǎng)狀，可清晰看到菌絲在營(yíng)養(yǎng)根表面繁殖，層層交織形成菌套（圖10），用 Olympus CX41顯微鏡下作菌根切片10×40倍下觀察，印度塊菌接種美國(guó)山核桃的菌根橫切面上能觀察到形狀像馬蹄形的哈蒂氏網(wǎng)結(jié)構(gòu)（別稱馬賽克現(xiàn)象，圖11）。在Leica S6D解剖鏡下測(cè)量單根菌根長(zhǎng)0.16 cm，直徑為0.039 cm。在接種10個(gè)月后部分菌根開始老化，變成黃褐色至黑色；接種12個(gè)月以后，菌根老化，可見暗褐色及萎縮的老化菌根（圖12）。

對(duì)試驗(yàn)苗木接種3個(gè)月后的菌根進(jìn)行檢測(cè)，印度塊菌菌根感染率為40%左右。接種6個(gè)月后的菌根檢測(cè)結(jié)果顯示，菌根量較豐富，感染率為95%以上。

2.2美國(guó)山核桃印度塊菌菌根的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)（分子檢測(cè)）

通過對(duì)美國(guó)山核桃菌根的分子檢測(cè)，PCR 擴(kuò)增顯示，從美國(guó)山核桃菌根提出的DNA能得到較單一的700 bp左右的條帶。測(cè)序結(jié)果表明，與美國(guó)山核桃形成的菌根真菌為印度塊菌。ITS序列同源性為100%，同時(shí)采用的是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，測(cè)序峰圖清晰、無(wú)重疊峰。因此，與美國(guó)山核桃形成菌根的只有印度塊菌，沒有其他菌根類真菌。

3結(jié)論與討論

印度塊菌孢子接種到美國(guó)山核桃3個(gè)月開始形成淡乳色的菌根尖，6個(gè)月后菌根感染效果較好，感染率達(dá)95%以上菌根量較大，說明美國(guó)山核桃是印度塊菌很好的宿主植物。本研究采用形態(tài)學(xué)和分子檢測(cè)2種方法確定印度塊菌與美國(guó)山核桃能形成菌根，在塊菌栽培研究中具有重要的研究意義和極高的應(yīng)用價(jià)值。美國(guó)山核桃是唯一一個(gè)適合低海拔栽培的核桃品種，美國(guó)山核桃印度塊菌菌根苗接種成功填補(bǔ)了低海拔區(qū)域沒有經(jīng)濟(jì)樹種塊菌菌根苗的空白。美國(guó)山核桃和印度塊菌都是2個(gè)具有較大發(fā)展前景的產(chǎn)業(yè)，美國(guó)山核桃接種印度塊菌的成功，邁出了兩大產(chǎn)業(yè)高效有機(jī)結(jié)合的第一步，美國(guó)山核桃塊菌菌根苗栽培成功將實(shí)現(xiàn)產(chǎn)值翻番。因此，美國(guó)山核桃塊菌菌根苗栽培易推廣，市場(chǎng)前景廣闊。

致謝：本研究過程中得到新西蘭塊菌專家王云博士和中國(guó)臺(tái)灣塊菌專家胡宏道教授的指導(dǎo)，特此感謝！

參考文獻(xiàn)：

[1]Jasmina G，Radmila V，Jele-Na V. Evidence of trufles in Serbia[J]. Mycotaxon，1997，65：211-222.

[2]陳應(yīng)龍，弓明欽. 塊菌資源多樣性及其地理分布[J]. 中國(guó)食用菌，2000，19（6）：25-26.

[3]蔡珠兒. 吃松露[J]. 中國(guó)企業(yè)家，2007（12）：108-109.

[4]張日清，呂芳德. 優(yōu)良經(jīng)濟(jì)樹種——美國(guó)山核桃[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，1998（4）：202-206.

[5]Marx D H，Cordel C E，Maul S B，et al. Ectomycorrhizal development on pine by Pisolithus tinctorious in bareroot and container seedling nurseries.I.Efficacy of various vegetative inoculum formulations[J]. New Forests，1989（3）：45-56.

[6]蘇開美，李樹紅，楊麗芬，等. 印度塊菌、夏塊菌與化香樹合成菌根苗技術(shù)初探[J]. 中國(guó)食用菌，2012，31（3）：10-12.

[7]張紅，秦蓮花，譚琦，等. 用改進(jìn)的CTAB法提取香菇基因組DNA[J]. 上海大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，12（5）：547-550.