俞 娟，　劉勁松，　王 剛，　王 諍，　蔡百祥，　王國凱

（安徽中醫(yī)藥大學藥學院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽　合肥　230012）

響應(yīng)面法優(yōu)化馬蘭多糖提取工藝研究

俞 娟，劉勁松，王 剛，王 諍，蔡百祥，王國凱*

（安徽中醫(yī)藥大學藥學院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽合肥230012）

目的 通過響應(yīng)面法研究和優(yōu)化馬蘭多糖的提取工藝。方法 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面法的設(shè)計，對馬蘭多糖的提取工藝各因素進行優(yōu)化。結(jié)果 最佳優(yōu)化提取工藝是料液比為25∶1，提取時間為1.55 h，提取次數(shù)為4次。在該優(yōu)化條件下，馬蘭多糖的實際平均提取率為8.17%。結(jié)論 該優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠，實驗值與建立的模型預測值基本一致。

馬蘭；多糖；響應(yīng)面法；提取工藝

馬蘭為菊科植物馬蘭屬馬蘭Kalimeris indica（L.）Sch-Bip的帶根全草，全國均有分布［1］?，F(xiàn)代藥理研究證明，馬蘭具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗胃潰瘍等作用［2-3］，在四川民間常用其煎服，用于治療胃脘疼痛以及慢性胃炎，頗具療效［4-5］。且有研究表明馬蘭多糖具有抗胃潰瘍作用［6-7］。響應(yīng)面分析法是一種廣泛用于優(yōu)化工藝條件的方法［8］。本實驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬蘭多糖的提取工藝，為馬蘭的工藝研究提供理論依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1材料 馬蘭藥材于2014年購自亳州藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學楊青山鑒定為菊科植物馬蘭K.indica（L.）Sch-Bip的干燥全草。憑證標本（No.200401）保存于安徽中醫(yī)藥大學藥物化學系天然藥化研究室。所用試劑均為分析純。

1.2儀器 UV759CRT分光光度計（島津）；DZF6050型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HH-S恒溫水浴鍋（江蘇國勝實驗儀器廠）；十萬分之一電子天平（賽多利斯公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1多糖提取 稱取馬蘭藥材50 g，加蒸餾水，回流提取，濃縮，真空干燥至恒定質(zhì)量，稱定質(zhì)量。

2.2馬蘭多糖的測定（硫酸-苯酚法［9］）

2.2.1標準曲線的制備 取葡萄糖對照品0.100 0 g，精密稱定，置于100 mL量瓶中加蒸餾水溶解并定容至刻度。準確吸取對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于10 mL刻度試管中，分別加入2.0 mL蒸餾水，再分別加6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，加水定容至刻度，靜置10min，再放入沸水浴中15min。同法制得空白對照。在多糖最大吸收波長490nm處測定其吸光度，計算其標準曲線回歸方程Y=7.74Ⅹ-0.0301（r=0.9991），表明多糖在0.105～0.504mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2供試品溶液制備 取樣品0.1000g，配成100mL溶液，精密移取0.50mL于10mL試管中，按“2.2.1”項下操作，測定吸光度，計算馬蘭多糖的提取率：提取率（%）=多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）×溶液體積（mL）×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量（g）×10-3×100

2.2.3精密度 取同一份供試品溶液，連續(xù)平行測定6次，RSD值為1.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.4重復性 精密稱取樣品6份，精密稱定，按“2.2.1”項下同法進行提取，分別測定吸光度，RSD值為1.3%，表明本法重復性良好。

2.2.5穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液，在0、5、10、20、30、60min分別測定其吸光度，RSD值為0.7%，表明樣品溶液在60min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6加樣回收率 取已知含有量的多糖提取物6份，精密稱定，分別加入對照品，按“2.2.1”項下同法進行處理，分別測定吸光度，計算平均回收率為99.4%，RSD值為1.9%，結(jié)果表明本法回收率良好。

2.3單因素水平試驗 結(jié)果如圖1所示，最佳料液比25倍，最佳提取時間1.5h，最佳提取次數(shù)3次。

圖1　單因素試驗結(jié)果

2.4響應(yīng)面法優(yōu)化馬蘭多糖的提取工藝

2.4.1實驗結(jié)果及分析 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，按照中心組合試驗設(shè)計原理［10］，參考文獻［11-14］選取料液比、提取時間、提取次數(shù)進行三因素三水平的實驗設(shè)計，因素水平分別以-1、0、1編碼，以馬蘭多糖的得率為響應(yīng)值，見表1。

表1　響應(yīng)面優(yōu)化三因素三水平

以料液比（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）為自變量，以馬蘭多糖含有量（Y）為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.5b軟件進行三因素三水平的響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計及結(jié)果

分析上述數(shù)據(jù)，回歸方程為：Y=8.00+0.25A+ 0.43B+0.45C+0.028AB-0.42AC-0.34BC-0.87A2-0.91B2-0.29C2。結(jié)果可知，三個因素對馬蘭多糖提取率的影響大小為：C＞B＞A。結(jié)果見表3。注：*P＜0.05為顯著水平，**P＜0.01為極顯著水平

表3　擬合回歸分析結(jié)果

表3表明A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2因素對多糖的提取率影響顯著，表明三個因素對馬蘭多糖的提取均有顯著的影響；其中料液比和提取時間以及提取時間和提取次數(shù)的交互作用也會對馬蘭多糖提取率帶有顯著影響。進一步分析方程方差可知，由總模型P＜0.001可知本實驗所選取的二次多項式模型具有高度的顯著性；失擬項為0.1824＞0.05，故失擬項不顯著；R2=0.9757和R2

Adj= 0.9444說明模型可以解釋94.44%響應(yīng)值的變化，只有總變異的5.56%不可以用此模型解釋，說明該模型的擬合度較好。

2.4.2 響應(yīng)面圖與等高線圖分析 根據(jù)多元回歸方程得到的三因素對馬蘭多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。圖2說明料液比和提取時間之間的交互作用不顯著；當料液比不變，馬蘭多糖提取率隨著提取時間的增大表現(xiàn)為先上升后下降；當提取時間不變，馬蘭多糖提取率隨著料液比的增大表現(xiàn)為先上升后下降。

圖2　料液比與提取時間對馬蘭多糖提取率的響應(yīng)面及其等高線

圖3說明料液比和提取次數(shù)之間的交互作用顯著；當料液比較小，馬蘭多糖提取率隨著提取次數(shù)的增大表現(xiàn)為先上升后下降，當料液比達到一定值，馬蘭多糖提取率隨著提取次數(shù)的增大趨于平緩；當提取次數(shù)不變，提取率隨著料液比的增大表現(xiàn)為先上升后下降。

圖3　料液比與提取次數(shù)對馬蘭多糖提取率的響應(yīng)面及其等高線

圖4說明提取時間和提取次數(shù)之間的交互作用顯著；當提取時間較小，馬蘭多糖提取率隨著提取次數(shù)的增大表現(xiàn)為先上升，當提取時間達到一定值，馬蘭多糖提取率隨著提取次數(shù)的增大表現(xiàn)為先上升后下降；當提取次數(shù)不變，馬蘭多糖提取率隨著提取時間的增大而先上升后下降。

圖4　提取時間與提取次數(shù)對馬蘭多糖提取率的響應(yīng)面及其等高線圖

2.4.3最佳條件預測及驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.5b軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到馬蘭多糖提取的最佳工藝條件是料液比為24.84∶1；提取時間為1.55 h；提取次數(shù)為3.73次。馬蘭多糖提取率的理論值為8.18%?？紤]實際情況，確定最佳提取工藝條件是料液比為25∶1；提取時間為1.55 h；提取次數(shù)為4次。在此條件下提取3批，實際提取率分別為8.13%、8.18%、8.19%，平均值為8.17%，與理論值8.18%接近。

4　討論

目前關(guān)于多糖提取工藝研究報道主要通過正交實驗設(shè)計，而其只通過因素水平組合，無法優(yōu)選出因素的最佳組合。本實驗采用響應(yīng)面法，將因素與結(jié)果的關(guān)系進行多項式擬合，優(yōu)選馬蘭多糖最佳提取工藝。首先采用單因素試驗確定因素水平，進一步應(yīng)用響應(yīng)面分析法考察因素對提取的影響，采用二次回歸設(shè)計得到馬蘭多糖提取率的回歸模型，驗證試驗表明了該模型的可靠性。

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R284.2

B

1001-1528（2015）01-0222-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.051

2014-08-28

國家自然科學基金項目（81303220）；安徽省自然科學基金項目（11040606M220）

俞 娟（1981—），女，碩士，講師，主要從事中藥化學成分研究。Te1：（0551）68129055，E-mai1：54795150@qq.com

王國凱（1981—），男，博士，副教授，主要從事中藥化學活性成分研究。Te1：（0551）68129167，E-mai1：wanggk7779 @163.com