陳海波，　馬鳳森，*，　方劍喬，　方 芳

（1.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江　杭州　310014；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江　杭州　310009）

馬錢子組分對人HaCaT細胞毒性作用的比較

陳海波1，馬鳳森1，2*，方劍喬2，方 芳2

（1.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州310014；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江杭州310009）

目的 研究馬錢子生物堿及其不同組分對人永生化表皮細胞系HaCaT細胞的毒性作用。方法 體外培養(yǎng)HaCaT細胞，加入相同質(zhì)量濃度的馬錢子堿、士的寧、馬錢子堿與士的寧的混合物，和馬錢子總生物堿作用于細胞24 h后，采用MTT比色法測定不同生物堿的細胞增殖抑制作用；流式細胞儀檢測對HaCaT細胞的凋亡，比較馬錢子生物堿不同組分對HaCaT細胞的毒性作用。結(jié)果 士的寧對HaCaT細胞的抑制率和細胞凋亡率大于馬錢子堿；馬錢子堿和士的寧混合物組對HaCaT細胞的抑制率和細胞凋亡率大于馬錢子總生物堿。結(jié)論 馬錢子生物堿組分均對HaCaT細胞存在細胞毒作用，呈劑量依賴關(guān)系，但馬錢子堿的細胞毒性明顯小于士的寧。

人永生化表皮細胞；細胞毒性；馬錢子總生物堿；馬錢子堿；士的寧

馬錢子Strychni Semen為馬錢子科植物馬錢子Strychnos nux-vomica L.及云南長籽馬錢Strychnos pierriana A.W.Hi11的干燥成熟種子，它的主要有效成分為馬錢子生物堿，約占2%～5%，現(xiàn)已分離得到16個生物堿，其中最重要的為番木鱉堿（士的寧，strychnine）和馬錢子堿（布魯生，brucine），約占總生物堿的70%。馬錢子生物堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛的功效，臨床與實驗治療類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）效果顯著［1-3］。

目前，馬錢子治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用和實驗性研究方面，主要有口服制劑和經(jīng)皮給藥制劑兩類［4］。其中，經(jīng)皮給藥制劑可以降低直接口服毒性藥物馬錢子的中毒風險［5-6］。雖然有文獻報道了動物實驗研究馬錢子制劑的皮膚刺激性，但是從細胞水平研究馬錢子生物堿不同組分對皮膚的毒性作用，筆者尚未見國內(nèi)文獻報道。

本研究利用體外培養(yǎng)HaCaT細胞，觀察馬錢子總生物堿（tota1 strychnos a1ka1oids，TSD）及其不同組分對HaCaT細胞的毒性作用的影響，以進一步探索馬錢子應(yīng)用于抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的更為合理的炮制、提取和馬錢子經(jīng)皮給藥系統(tǒng)制備方法，為馬錢子的安全、有效利用提供科學依據(jù)。

1　實驗材料

1.1細胞 人永生化表皮細胞系，HaCaT細胞購自武漢細胞庫。

1.2試劑與藥品 馬錢子堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110706-200505，純度95.9%）；士的寧對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110705-200306，純度97%）；馬錢子堿純品（南京澤朗植提技術(shù)有限公司，批號ZL110116，純度97.2%）；士的寧純品（南京澤朗植提技術(shù)有限公司，批號ZL110120，純度96.2%）；馬錢子總生物堿（本實驗室自制，批號20120828，含馬錢子堿27.01%、士的寧26.95%、馬錢子總生物堿67.38%）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司，批號130624）；MTT（sigama分裝，批號M2128）；BU-ANNEXIN V-FITC凋亡試劑盒（Biouniquer Techno1ogy公司，批號BUAP0102）；PBS（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號20130104）；0.25%Trypsin&0.02%EDTA（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號13091701）；0.25%Trypsin（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號20130722）；RPMT 1640培養(yǎng)液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號13080208）；DMSO（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號130815）。

1.3主要儀器 倒置相差顯微鏡（Leica）；細胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma 3111）；全波長酶標儀（MDS4）；流式細胞儀（Epics A1tra）；紫外-可見分光光度計（UV-1600PC）；液相檢測器（LC-10AT）；電子天平（PT-1004/205）。

2　實驗方法

2.1HaCaT細胞的培養(yǎng) HaCaT細胞在37℃，5%CO2相對飽和濕度培養(yǎng)條件下，用含12%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100 μg/mL）的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期，用于給藥試驗。

2.2主要試劑溶液的制備

2.2.1馬錢子總生物堿 取馬錢子總堿適量溶解于細胞培養(yǎng)液中，過濾除菌，HPLC測得含馬錢子堿0.16 mg/mL、士的寧0.16 mg/mL，紫外分光光度法測定含馬錢子總生物堿0.40 mg/mL。4℃冰箱保存，備用。

2.2.2馬錢子堿溶液 取馬錢子堿純品溶解于細胞培養(yǎng)液中，過濾除菌，HPLC測得馬錢子堿質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL，4℃冰箱保存，備用。

2.2.3士的寧溶液 取士的寧純品溶解于細胞培養(yǎng)液中，過濾除菌，HPLC測得其質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL，4℃冰箱保存，備用。

2.2.4馬錢子堿士的寧混合物溶液 取馬錢子堿純品、士的寧純品溶解于細胞培養(yǎng)液中，過濾除菌，HPLC測得馬錢子堿質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL，士的寧質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL，4℃冰箱保存，備用。

2.3重復性試驗 精密吸取同一馬錢子堿與士的寧的混合物含藥培養(yǎng)液（含馬錢子堿0.141 mg/mL，士的寧0.101 mg/mL）6份，每份0.5 mL，用流動相定容至5 mL，0.45μm微孔濾膜過濾，進樣檢測，計算得到馬錢子堿和士的寧峰面積的RSD值分別為1.89%、1.60%。

2.4加樣回收率測定 取馬錢子堿士的寧混合物含藥培養(yǎng)液1.0 mL（含馬錢子堿0.063 mg/mL，士的寧0.062 mg/mL）6份，分別加入0.2 mL的馬錢子堿、士的寧混合貯備液（含馬錢子堿0.486 mg/mL，士的寧0.565mg/mL），混勻，流動相定容至10mL。HPLC測定含有量，計算回收率，結(jié)果見表1。測得馬錢子堿、士的寧的平均回收率分別為103.3%、102.1%，RSD值分別為1.25%、1.27%。2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一馬錢子堿與士的寧的混合物含藥培養(yǎng)液（含馬錢子堿0.141 mg/mL，士的寧0.101 mg/mL）分為4組，6份/組。于0 h時檢測組1的馬錢子堿、士的寧；24 h時檢測組2（4℃）的馬錢子堿、士的寧，組3（室溫）的馬錢子堿、士的寧；48 h時檢測組4（4℃）的馬錢子堿、士的寧。每份取0.5 mL，用流動相定容至5 mL，0.45μm微孔濾膜過濾，進樣，測定。結(jié)果見表2。

表1　馬錢子堿、士的寧加樣回收率（n=6）Tab.1 Resu Its of recovery tests for brucine and strychnine（n=6）

表2　培養(yǎng)液中馬錢子堿、士的寧的穩(wěn)定性（n=6）Tab.2 StabiIity test of brucine，strychnine in m edium（n=6）

結(jié)果顯示在室溫和4℃下存放24 h，馬錢子堿、士的寧含有量基本無變化；在4℃下存放48 h，馬錢子堿、士的寧含有量穩(wěn)定、無明顯變化。

2.6MTT法檢測藥物對HaCaT細胞增殖的影響取對數(shù)期的HaCaT細胞，用含體積分數(shù)0.25%胰酶和0.01%EDTA-Na的消化液消化，1640培養(yǎng)液洗滌離心（1 500 r/min，6 min），調(diào)整細胞密度為1×108個/L，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔中加入100μL細胞懸液，培養(yǎng)12 h使細胞貼壁后，分別加入200μL 4個不同質(zhì)量濃度的馬錢子總生物堿、馬錢子堿與士的寧的混合物、士的寧、馬錢子堿（見表3）。每個樣品設(shè)5復孔。以含細胞不加藥物的1640培養(yǎng)液作為標準對照，以不含細胞的1640培養(yǎng)液作為空白對照。給藥培養(yǎng)24 h后，每孔加入含0.5 mg/mL MTT的工作液200μL；培養(yǎng)4 h后，除去MTT的工作液，再每孔加DMSO 100 μL，搖床搖勻，室溫、避光孵育10 min，在波長570 nm處用酶標儀測吸光度值。計算細胞相對抑制率，相對抑制率計算公式如下：相對抑制率R%=［1-（樣品孔吸光度/標準對照孔吸光度）］×100%。

表3　增殖試驗中不同給藥質(zhì)量濃度（mg/m L）Tab.3 Different drug concentrations in ceIIproIiferation（mg/m L）

2.7流式細胞術(shù)檢測藥物對HaCaT細胞凋亡的影響 根據(jù)上述增殖抑制結(jié)果，細胞凋亡試驗選用藥物分別為馬錢子堿溶液（含馬錢子堿0.098 mg/mL）、士的寧溶液（含士的寧0.104 mg/mL）、馬錢子總生物堿溶液（含馬錢子堿0.096 mg/mL、士的寧0.101 mg/mL）、馬錢子堿與士的寧混合物溶液（含馬錢子堿0.103 mg/mL、士的寧0.103 mg/mL）。取對數(shù)期細胞接種至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，分別加上述含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，設(shè)對照組（只加細胞不加藥物），收集細胞，調(diào)整密度為5× 105個/mL，取0.5 mL結(jié)合緩沖液（binding buffer）懸浮細胞，加入5μL Annexin V-FITC，5μL碘化吡啶（Propidium Iodide），混勻，室溫避光孵育10 min，用流式細胞儀進行檢測。以上每組重復3次。

3　結(jié)果

3.1馬錢子生物堿不同組分對細胞形態(tài)的影響

在顯微鏡下觀察空白對照組的HaCaT細胞為多邊形且聚集生長（如圖1所示）。馬錢子堿、士的寧處理24 h后，觀察到細胞數(shù)量略有減少，僅有部分細胞的細胞質(zhì)皺縮，核致密，體積變小等改變（如圖2、圖3所示）。馬錢子堿與士的寧的混合物、馬錢子總生物堿處理24 h后，觀察到細胞數(shù)量明顯減少，且大部分細胞發(fā)生細胞質(zhì)皺縮，核致密，體積變小等改變（如圖4、圖5所示）。結(jié)果表明馬錢子堿、士的寧和馬錢子總生物堿均對細胞有一定的毒性，馬錢子堿對HaCaT細胞的毒性較士的寧對HaCaT細胞的毒性小，馬錢子總生物堿對HaCaT細胞的毒性較馬錢子堿與士的寧的混合物對HaCaT細胞的毒性小。

圖1　空白對照組細胞Fig.1　HaCaT ceIIof non-treated controIs

圖2　馬錢子堿處理后細胞Fig.2　HaCaT ceII treated w ith brucine

圖3　士的寧處理后細胞Fig.3　HaCaT ceIItreated w ith strychnine

圖4　馬錢子堿與士的寧的混合物處理后細胞Fig.4　HaCaT ceII treated w ith the m ixture of brucine and strychnine

圖5　馬錢子總生物堿處理后細胞Fig.5　HaCaT ceII treated w ith TSD

3.2馬錢子生物堿不同組分對細胞增殖的影響

分別加入不同質(zhì)量濃度的馬錢子堿、士的寧、馬錢子堿與士的寧的混合物和馬錢子總生物堿，作用于HaCaT細胞24 h后，采用MTT比色法檢測藥物對HaCaT細胞增殖抑制作用，并計算其抑制率（見表4），間接的表明藥物對細胞的毒性。

同質(zhì)量濃度樣品組中，與馬錢子堿組比較，士的寧組在質(zhì)量濃度1～4組時對細胞的抑制作用均明顯大于馬錢子堿（P＜0.01）；而在低質(zhì)量濃度樣品5組時，士的寧的抑制作用較馬錢子堿低（P＜0.05），如表4。

同質(zhì)量濃度組中，與馬錢子總生物堿組比較，馬錢子堿與士的寧的混合物組在各質(zhì)量濃度時對HaCaT細胞的抑制作用均明顯大于馬錢子總生物堿（P＜0.01），如表4。

3.3馬錢子生物堿對HaCaT細胞凋亡的影響 馬錢子堿、士的寧、馬錢子堿士的寧的混合物和馬錢子總生物堿，分別作用于HaCaT細胞24 h后，流式細胞術(shù)測定不同藥物對HaCaT細胞凋亡作用的結(jié)果見表5。

表4　馬錢子生物堿不同組分對HaCaT細胞增殖的抑制（±s，n=5）Tab.4 Effect of different components of strychnos aIkaIoids on HaCaT ceIIproIiferation（±s，n=5）

表4　馬錢子生物堿不同組分對HaCaT細胞增殖的抑制（±s，n=5）Tab.4 Effect of different components of strychnos aIkaIoids on HaCaT ceIIproIiferation（±s，n=5）

注：與同質(zhì)量濃度組的馬錢子堿組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同質(zhì)量濃度組馬錢子堿士的寧組混合物比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別編號馬錢子堿/%士的寧/%馬錢子堿與士的寧的混合物/%馬錢子總生物堿/% 1 16.11±5.07 55.86±6.16**76.53±3.25 67.47±2.96△2 12.79±5.28 27.34±3.72**53.64±6.20 12.68±5.75△△3 11.34±3.69 26.89±4.76**31.68±5.10 8.80±5.41△△4 8.98±3.83 23.44±3.99**26.73±8.25 8.83±4.60△△5 8.50±2.95 3.58±0.74*11.75±3.99 1.65±0.06△△

表5　馬錢子生物堿不同組分對HaCaT細胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.5 Effect of strychnos aIkaIoids on HaCaT ceIIapoptosis（±s，n=3）

表5　馬錢子生物堿不同組分對HaCaT細胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.5 Effect of strychnos aIkaIoids on HaCaT ceIIapoptosis（±s，n=3）

注：與馬錢子總生物堿比較，△△P＜0.01

組別早期凋亡率/% 5.63±1.33士的寧組7.05±2.29馬錢子總生物堿組5.10±0.44馬錢子堿士的寧混合物組23.0±2.08馬錢子堿組△△

4　討論

類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種以慢性進行性關(guān)節(jié)滑膜病變?yōu)樘卣鞯娜硇宰陨砻庖咝约膊?。其中大量的臨床研究和實驗研究均證明［7-8］，馬錢子在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎方面具有顯著效果，其中主要有效成分及有毒成分為馬錢子堿和士的寧等生物堿類物質(zhì)。

馬錢子的毒性研究大多采用動物實驗進行［9-10］，該方法的周期相對較長，藥品用量大等不足。而細胞實驗可以快速、準確、高效的篩選藥物和檢測藥物的毒性，如抗腫瘤藥物的篩選。趙春玲等［11］采用染色法快速測定了白眉蝮蛇去整合素（rAdinbitor）對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞黏附性的影響。李運曼等［12］以DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ為研究靶點，研究紫草素對人白血病K562細胞的增殖抑制的影響。K1ein等［13］以微管蛋白為靶點，研究紫杉醇和discodermo1ide（從海綿動物中分離得到的多羥基內(nèi)酯化合物）對A549肺癌細胞的作用，結(jié)果顯示兩物質(zhì)均能迅速導致其細胞有絲分裂的異常。Omari等［14］以HepG2/C3A細胞快速準確的證明了一系列化學混合物的毒性，為后續(xù)實驗研究提供基礎(chǔ)。

本課題組已進行的研究表明馬錢子生物堿對類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療具有明顯療效，并且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)馬錢子堿對類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞的增殖抑制作用強于士的寧［15］。本實驗選用人永生化表皮細胞作為模型細胞，考察馬錢子生物堿對皮膚細胞的毒性作用。實驗結(jié)果顯示：馬錢子生物堿對HaCaT細胞的毒性呈劑量依賴性，隨著劑量的降低效果不斷減弱。在質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL、0.08 mg/mL、0.04 mg/mL和0.02 mg/mL時，士的寧對HaCaT細胞的毒性約為馬錢子堿的2.5倍；在各劑量組下，馬錢子總生物堿對HaCaT細胞的毒性均明顯低于馬錢子堿與士的寧的混合物。凋亡實驗顯示士的寧的作用強于馬錢子堿，且馬錢子總生物堿明顯低于馬錢子堿與士的寧的混合物，這也對進一步驗證了馬錢子生物堿各組分對HaCaT細胞的毒性，其結(jié)果與增殖抑制實驗一致。

本實驗發(fā)現(xiàn)馬錢子堿對HaCaT細胞的毒性低于同質(zhì)量濃度組士的寧的毒性，TSD對HaCaT細胞的毒性低于同質(zhì)量濃度組馬錢子堿與士的寧的混合物組的毒性。這提示在經(jīng)皮給藥治療類風濕性關(guān)節(jié)炎方面，馬錢子堿比士的寧具有更明顯的優(yōu)勢；總生物堿中其他組分可以明顯降低士的寧對HaCaT細胞的毒性，其具體機理尚不明確，值得進一步的實驗驗證。

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Cytotoxicity of com ponents from seeds of Strychnos nux-vom ica to human HaCaT keratinocytes

CHEN Hai-bo1， MA Feng-sen1，2*， FANG Jian-qiao2， FANG Fang2
（1.College of Pharmaceutics，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.The Third Clinical Hospital of Zhejiang ChineseMedical University，Hangzhou 310009，China）

AIM To study the cytotoxicity of a1ka1oids from Strychni Semen and its different components on HaCaT ce11，an immorta1ized human epiderma1 ce111ine.METHODS After in vitro HaCaT ce11s being cu1tured co-cu1tured with same concentrations of brucine，strychnine，and themixture of brucine and strychnine，tota1a1ka-1oids from Strychni Semen for 24 h，the number of viab1e ce11swas observed using the MTTmethod.The ce11apoptotic rate was detected and ca1cu1ated by f1ow cytometry.Cytotoxicity on HaCaT ce11was compared among a1ka1oids from Strychni Semen.RESULTS The pro1iferation rates and the apoptotic rate of strychnine on HaCaTwere greater than brucine at the same concentration，themixture of brucine and strychnine on HaCaTwere greater than tota1 a1ka1oids from Strychni Semen simi1ar1y in those two rates.CONCLUSIN The components of a1ka1oids from Strychni Semen have obvious cytotoxicity to HaCaT ce11in a dose-dependent re1ationship，meanwhi1e，cytotoxicity of brucine is 1ower than that of strychnine.

HaCaT ce11；cytotoxicity；tota1a1ka1oids from Strychni Semen；brucine；strychnine

R966

A

1001-1528（2015）01-0016-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.004

2014-01-19

浙江省重大科技專項重點社會發(fā)展項目（2010C13014），浙江省自然科學基金項目（Y2111194）

陳海波（1988—），男，碩士，研究方向：天然藥物及其制劑。E-mai1：haibochen1988@126.com

馬鳳森，男，教授，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)研究。Te1：（0571）88871500，E-mai1：merrigen@126.com

日期：2014-05-09

http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20140509.1117.001.htm1