李啟佳，　陸 華*，　鄧延莉

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，四川　成都　610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川　成都　610075）

右歸丸鼠血清恢復(fù)凍融小鼠卵巢的功能

李啟佳1，陸 華1*，鄧延莉2

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，四川成都610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都610075）

目的 探討右歸丸（熟地黃，附子，肉桂，山藥，吳茱萸，菟絲子，鹿角膠，枸杞子，當(dāng)歸，鹽杜仲）鼠血清對程序化凍融小鼠卵巢組織功能的影響。方法 40只6周齡ICR小鼠經(jīng)孕馬血清促性腺激素刺激，其卵巢經(jīng)液氮中凍存2 d后復(fù)蘇，將所有卵巢組織隨機(jī)分為空白組、空白血清組、尿促卵泡素組及右歸丸血清組。所有卵巢經(jīng)特殊DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后從左側(cè)卵巢中取出未成熟卵母細(xì)胞，微滴法培養(yǎng)24 h觀察并計(jì)算小鼠卵細(xì)胞體外第一極體（PB1）排出率。并通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)基中雌二醇（E2）水平，右側(cè)卵巢組織中小鼠成熟促進(jìn)因子（MPF）、卵泡刺激素受體（FSH-R）及黃體生成激素受體（LH-R）水平。結(jié)果 卵巢組織凍融后，右歸丸血清組的卵母細(xì)胞成熟率、卵巢組織中的MPF、FSH-R和LH-R的水平高于尿促卵泡素陽性組和空白組。右歸丸血清組體外培養(yǎng)基中E2水平較空白血清組高，并顯著高于空白組。結(jié)論 右歸丸有可能在臨床上成為一種輔助凍存卵巢組織功能恢復(fù)有效的補(bǔ)腎中藥復(fù)方。

程序化凍融；小鼠卵巢組織；右歸丸；含藥血清

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎藏精”、“腎主生殖”，腎與女性生殖功能關(guān)系密切。補(bǔ)腎中藥和方劑對女性生殖功能的調(diào)控在臨床上有明顯的作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，臨床上補(bǔ)腎中藥有促進(jìn)卵泡成熟、增加卵泡數(shù)量和改善卵巢儲(chǔ)備功能的作用［1-6］。近年實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，含補(bǔ)腎中藥鼠血清加入卵細(xì)胞體外培養(yǎng)基中，可促進(jìn)小鼠未成熟卵細(xì)胞生長發(fā)育，主要是促進(jìn)卵細(xì)胞核成熟，并且不增加成熟卵細(xì)胞細(xì)胞骨架的異常率［7］。并發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制與增強(qiáng)卵細(xì)胞成熟促進(jìn)因子調(diào)節(jié)亞基Cyc1in B1的表達(dá)有關(guān)。

在臨床治療中，為保持接受化療、放療或?qū)π韵賹?shí)施手術(shù)患者的生育能力，需進(jìn)行卵母細(xì)胞、胚胎或卵巢組織的冷凍儲(chǔ)存。但是成熟卵細(xì)胞對溫度變化敏感以及修復(fù)細(xì)胞內(nèi)損傷的能力較低，且在冰晶的形成過程中會(huì)導(dǎo)致紡垂體損傷或減數(shù)分裂期出現(xiàn)異常，因此，臨床很少采用卵子冷凍。胚胎的冷凍效果相對較好，但所需時(shí)間較長，會(huì)耽誤患者的治療，且只適用于那些已經(jīng)結(jié)婚或同意接受供精的患者，不適于青春前期的兒童，因而對癌癥患者的臨床應(yīng)用也有一定局限性。而將卵巢組織冷凍是將數(shù)百個(gè)不成熟卵泡保存起來，既不需要卵巢刺激，也不會(huì)耽誤癌癥治療，因而在保存婦女生育能力方面具有較大潛力［8］。

但是，卵巢組織經(jīng)冷凍后再復(fù)蘇過程必定對生殖細(xì)胞的功能有一定損壞［9］。如上所述，補(bǔ)腎中藥無論在體內(nèi)還是體外對生殖細(xì)胞功能均有促進(jìn)作用。那么，補(bǔ)腎中藥能否幫助冷凍卵巢組織功能恢復(fù)呢？因此，本研究旨在探索右歸丸鼠血清是否能夠在小鼠卵巢組織凍融后的體外培養(yǎng)階段對卵巢功能有影響。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境 清潔級(jí)ICR雌性小鼠40只，分批次購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，5周齡，體質(zhì)量21～24 g，許可證號(hào)：SCXK（川2008-24）。二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)條件（清潔無塵，空氣新鮮，溫度18～22℃，相對濕度50%～60%，噪音85 dB以下，氨質(zhì)量濃度20mg/L。通風(fēng)換氣8～12次/h）適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

1.2試劑 孕馬血清購于寧波第二激素廠；注射用尿促性素（HMG）和注射用尿促卵泡素（FSH）購于麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、透明質(zhì)酸酶和礦物油購于美國Sigma公司；人輸卵管液（HTF）、HEPES緩沖液、卵裂液（C1eavage）和蛋白代用品（SPS）購于美國Quinn's公司；胎牛血清（FBS）和雙抗購于美國Gibco公司；小鼠雌二醇（E2）、MPF、FSH-R、LH-R及肌動(dòng)蛋白ELISA試劑盒、大鼠FSH、LH、雌二醇（E2）及孕酮（P）ELISA試劑盒均購于Cusabio華美生物；甲醇為色譜純購于Honeywe11 Burdick&Jackson公司；磷酸為色譜純購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3儀器 3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；CK40型倒置顯微鏡（O1ympus公司）；體視顯微鏡（O1ympus公司）；Mu1tiscan spectrum酶標(biāo)儀（Thermo公司）；A11egra 64R型高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mi11i-Q純水儀（美國Mi11ipore公司）；AB 265-5型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；島津LC2010C液相色譜系統(tǒng)柱溫箱、紫外檢測器、四元低壓梯度輸液泵、真空脫氣機(jī)、系統(tǒng)控制器、SPD-M10Avp二極管陣列檢測器、Shimadzu反相C18色譜柱組成（日本島津公司）。

1.4右歸丸鼠血清的制備

1.4.1血清樣品前處理方法 用蛋白沉淀法進(jìn)行血漿樣品前處理，即取血漿150μL，加入高氯酸-甲醇液（15μL 50%高氯酸+5μL甲醇），漩渦振蕩2 min，再20 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試液待檢。

1.4.2分離空白血漿樣品及含藥血漿樣品條件

Shimadzu反相C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相A為MeOH，流動(dòng)相B為0.1% H3PO4水溶液（0～28 min，10%→70%A；28～38 min，70%→100%A）；體積流量1.0 mL/min，溫度30℃，檢測波長259 nm，進(jìn)樣量70μL。

1.4.3右歸丸鼠血清的制備 取體質(zhì)量220～250 g的SD大鼠［清潔級(jí)，6～8周齡，許可證號(hào)：SCXK（川）2004-15。飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～70%，10 h/14 h明暗交替，每3 min自動(dòng)換氣1次，常規(guī)全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，雌雄分開飼養(yǎng)于不銹鋼飼養(yǎng)籠內(nèi)］，雌雄兼用，隨機(jī)分為兩組，即正常對照組、右歸丸組。試驗(yàn)前禁食不禁水16 h，各給藥組分別一次性給予右歸丸復(fù)方（5.0 g/kg），給藥劑量為20 mL/kg，正常對照組給予等劑量的蒸餾水。分別于給藥后30、60、90 min眼底靜脈叢取血，3 000 r/min離心10 min，分離各給藥組各時(shí)間點(diǎn)血清即得。

1.5自行配制的培養(yǎng)液和凍存液

1.5.1組織洗液 FBS20%（V/V）+RPMI 1640培養(yǎng)基，主要用于去掉卵巢組織表面多余的脂肪組織。需實(shí)驗(yàn)當(dāng)天提前1 h配制，并預(yù)熱至37℃。

1.5.2PBI培養(yǎng)基、平衡液、復(fù)蘇液和DAP 213凍存液 配方均參考Fujio等［9］文獻(xiàn)中提到的Whittingham［10］的配方。

1.5.3卵巢組織體外培養(yǎng)基 DMEM高糖培養(yǎng)基（含有NaHCO3，L-半胱氨酸，0.25 mo1/L HEPES），雙抗（青霉素+鏈霉素）1%（V/V），F(xiàn)BS10%（V/V），HMG 100 IU/L?？瞻籽褰M在基本培養(yǎng)基中加入3%（V/V）空白鼠血清，F(xiàn)SH組在基本培養(yǎng)基中加入0.3 IU/mL FSH，右歸丸血清組在基本培養(yǎng)基中加入3%（V/V）右歸丸鼠血清。卵巢組織復(fù)蘇當(dāng)天，提前1 h將卵巢組織體外培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃。

2　方法

2.1小鼠分組 將40只ICR雌性小鼠隨機(jī)分為4組，10只為一組，分別為空白組、空白血清組、FSH組及右歸丸血清組。

2.2小鼠卵巢組織的凍存 雌鼠處死前48 h，均腹腔注射孕馬血清1 mL（500 U/mL）促排卵。鑷子、解剖剪、眼科鑷、眼科剪常規(guī)酒精消毒準(zhǔn)備。促排后44～48 h將雌鼠斷頸處死，酒精消毒下腹部，剪開皮膚及腹膜，迅速用眼科鑷鈍性分離出子宮及雙側(cè)卵巢，并用眼科剪剪下雙側(cè)卵巢組織。將剪下的左右兩側(cè)卵巢組織分別放入對應(yīng)側(cè)的組織洗液（預(yù)熱至37℃）中，體視鏡下鈍性分離卵巢表面多余的脂肪組織和結(jié)締組織。將處理后的兩側(cè)卵巢組織分別放入對應(yīng)側(cè)的卵巢體外培養(yǎng)基（預(yù)熱至37℃）中收集。每3～4個(gè)卵巢組織放入對應(yīng)側(cè)的緩沖液（4℃）中預(yù)處理5 min，并剪成約1 mm×2 mm×2 mm的組織塊。預(yù)處理后的卵巢組織放入對應(yīng)側(cè)的凍存管中，每個(gè)凍存管中放入一個(gè)卵巢的組織塊，并加入60μL緩沖液，4℃下靜置15 min。再向每個(gè)凍存管中加入DAP 213凍存液120μL，每個(gè)凍存管再在0℃冰水中靜置30 min。然后將凍存管放入程序降溫盒（-1℃/min）中，置于-80℃冰箱中過夜。第2天將凍存管放入液氮罐中凍存2 d。

2.3小鼠卵巢組織的復(fù)蘇 將凍存管從液氮罐中取出，在室溫中放置30 s，然后向凍存管中加入900μL復(fù)蘇液（預(yù)熱至37℃）稀釋，用1 mL移液管吸出凍存液及復(fù)蘇液，再用眼科鑷輕輕將卵巢組織夾至含有PBI培養(yǎng)基（預(yù)熱至37℃）的60 mm皿中洗滌，最后放入體外培養(yǎng)基中（48孔板培養(yǎng)1 d，每孔400μL體外培養(yǎng)基，每孔一個(gè)卵巢）培養(yǎng)24 h。

2.4取卵 將體外培養(yǎng)24 h后的左側(cè)卵巢組織轉(zhuǎn)移至含有PBS（預(yù)熱至37℃）的35 mm皿中洗滌，然后迅速移至HEPES微滴中（預(yù)熱至37℃，35 mm皿，每個(gè)皿4個(gè)HEPES微滴并蓋礦物油）。右側(cè)卵巢組織不作處理，待用。

用1 mL空針挑破卵巢組織，體視鏡下找出卵母細(xì)胞，用制好的無菌巴氏管將卵細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有HTF微滴的35 mm皿中（提前4 h配制并預(yù)熱至37℃，上面蓋礦物油），15 min取一個(gè)卵巢。迅速將35 mm皿放入CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，飽和濕度）中培養(yǎng)24 h。

2.5觀察卵母細(xì)胞體外成熟情況 從培養(yǎng)箱中取出35 mm培養(yǎng)皿，放在熱臺(tái)上，通過倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。如卵細(xì)胞外面有顆粒細(xì)胞包繞，用制好的無菌巴氏管反復(fù)吹打，去掉顆粒細(xì)胞后再觀察，并記錄各個(gè)微滴卵細(xì)胞成熟數(shù)。以卵細(xì)胞排出第一極體（PB1）作為成熟的指標(biāo)，成熟率=PB1個(gè)數(shù)/總卵細(xì)胞數(shù)。

2.6測定E2及大鼠血清激素成分 將各個(gè)卵巢組織的體外培養(yǎng)基吸出，用小鼠E2的ELISA試劑盒測定培養(yǎng)基中的E2水平。

將同批次右歸丸鼠血清樣本、空白鼠血清樣本各取出6個(gè)，用大鼠FSH、LH、E2、P的ELISA試劑盒分別進(jìn)行鼠血清中FSH、LH、E2、P水平的測定。

2.7肌動(dòng)蛋白（Actin）、成熟促進(jìn)因子（MPF）、卵泡刺激素受體（FSH-R）及黃體生成激素受體（LH-R）的測定 將右側(cè)卵巢組織取出，每只卵巢組織加入500μL蛋白裂解液勻漿并離心，取上清液進(jìn)行成熟促進(jìn)因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體和肌動(dòng)蛋白（Actin）的檢測。肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，成熟促進(jìn)因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體的濃度值均與肌動(dòng)蛋白濃度值進(jìn)行比較，所得數(shù)據(jù)分別為成熟促進(jìn)因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體水平的相對值，將上述相對值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

各組數(shù)據(jù)均在SPSS 19.0軟件包下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。均數(shù)比較采用T檢驗(yàn)，率的比較采用單因素方差分析和T檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1各組卵細(xì)胞體外成熟率的比較 小鼠卵巢組織經(jīng)程序化冷凍復(fù)蘇后分別采用空白鼠血清、FSH和鼠右歸丸含藥血清處理24 h，分離出未成熟的卵細(xì)胞用微滴法比較卵細(xì)胞成熟的情況，即第一極體（BP1）出現(xiàn)率?？瞻讓φ战M、空白血清組、FSH組和右歸丸鼠血清組的PB1出現(xiàn)率見表1。右歸丸鼠血清組第一極體（PB1）出現(xiàn)率與其余3組相比，P＜0.05，0.01，0.01和0.01。代表圖像見圖1。

3.2各組培養(yǎng)基中E2的比較 小鼠卵巢組織經(jīng)程序化冷凍復(fù)蘇后分別采用空白鼠血清、FSH和鼠右歸丸含藥血清處理24 h。然后測定培養(yǎng)液中E2的量?？瞻讓φ战M、空白血清組、FSH組和右歸丸鼠血清組體外培養(yǎng)液中E2質(zhì)量濃度分別為（339.5±11.8）pg/mL、（456±4.03）pg/mL、（486.05±8.95）pg/mL和（507.9±7.58）pg/mL（圖2）。右歸丸鼠血清組較空白血清組高（P＜0.05），并顯著高于空白組（P＜0.01）。FSH組和空白血清組體外培養(yǎng)基中E2水平均顯著高于空白組（P＜0.01）。見圖2。

表1　各組卵細(xì)胞體外成熟率的比較（±s）Tab.1 Com parison of the in vitro maturation rate of oocytes（±s）

表1　各組卵細(xì)胞體外成熟率的比較（±s）Tab.1 Com parison of the in vitro maturation rate of oocytes（±s）

注：各組數(shù)據(jù)one-way variation分析，F(xiàn)=4.107，P=0.032。各組數(shù)據(jù)兩兩比較，采用T檢驗(yàn)：與FSH組比較，▲P＜0.05；與空白血清組比較，※P＜0.05

分組卵細(xì)胞數(shù)PB1數(shù)PB1出現(xiàn)率/% 135 10 7.47±5.00空白血清組200 13 6.15±3.49 FSH組238 16 5.80±6.27右歸丸鼠血清組156 19 12.35±3.60空白對照組▲※

圖1　各組卵細(xì)胞第一極體出現(xiàn)的代表性圖片F(xiàn)ig.1　Pictures of oocytes w ith the first poIar body

圖2　各組培養(yǎng)基中E2水平Fig.2　Concentration of estradioIin themedium

3.3 各組小鼠卵巢組織肌動(dòng)蛋白（Actin）、成熟促進(jìn)因子（MPF）、卵泡刺激素受體（FSH-R）及黃體生成激素受體（LH-R）的比較 小鼠卵巢組織經(jīng)程序化冷凍復(fù)蘇后分別采用空白鼠血清、FSH和右歸丸鼠血清處理24 h，然后測定卵巢組織中肌動(dòng)蛋白、成熟促進(jìn)因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體水平。結(jié)果見表2。右歸丸鼠血清組的卵巢組織中的成熟促進(jìn)因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體的水平高于FSH組和空白組。

3.4空白鼠血清和右歸丸鼠血清中卵泡刺激素、黃體生成激素、雌二醇及孕酮的水平 均采用ELISA法測定。表3顯示，空白鼠血清中FSH水平最高，右歸丸鼠血清中FSH水平與FSH組中水平相當(dāng)?？瞻资笱逯蠰H水平較右歸丸鼠血清中LH水平高?？瞻资笱褰M培養(yǎng)基中原始E2和P水平較右歸丸鼠血清組培養(yǎng)基中原始E2水平略低。

表2　各組小鼠卵巢組織肌動(dòng)蛋白、成熟促進(jìn)因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體的比較（±s）Tab.2 Comparison of reIative concentration of Actin，MPF，F(xiàn)SH-R and LH-R in m ice ovary tissue（±s）

表2　各組小鼠卵巢組織肌動(dòng)蛋白、成熟促進(jìn)因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體的比較（±s）Tab.2 Comparison of reIative concentration of Actin，MPF，F(xiàn)SH-R and LH-R in m ice ovary tissue（±s）

注：與FSH組比較，▲P＜0.01；與空白對照組比較，※P＜0.01；與空白對照組比較，★P＜0.05；與空白血清組比較，＊P＜0.05

分組動(dòng)物數(shù)/只肌動(dòng)蛋白/（μmo1·mL-1）成熟促進(jìn)因子/（pg·mL-1）卵泡刺激素受體/（U·L-1）黃體生成激素受體/（pg·mL-1）空白對照組10 1.30±0.06 48.70±0.61 2.85±0.04 202.35±4.26空白血清組10 2.10±0.17▲76.50±4.46▲※4.55±0.26▲※236.35±7.46▲FSH組10 4.50±0.04 50.45±1.49 2.75±0.06 197.35±5.20右歸丸鼠血清組10 2.40±0.38※★83.50±1.82▲※4.20±0.22▲※294.65±6.8★※＊

表3　鼠血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成激素（LH）、雌二醇（E2）及孕酮（P）的水平（±s）Tab.3 Concentration of LH，F(xiàn)SH，E and P in rat serum（±s）

表3　鼠血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成激素（LH）、雌二醇（E2）及孕酮（P）的水平（±s）Tab.3 Concentration of LH，F(xiàn)SH，E and P in rat serum（±s）

注：各組數(shù)據(jù)兩兩比較，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，▲P＜0.01，※P＜0.01，★P＜0.05

血清樣本數(shù)/個(gè)FSH/（IU·L-1）LH/（ng·L-1）E2/（ng·L-1）P/（μg·L-1）空白鼠血清6 5.29±0.87 13.52±2.10▲22.10±1.18※3.74±0.54★右歸丸鼠血清6 4.07±4.12 1.56±0.07 9.57±0.89 5.08±1.13

4　討論

在凍存過程中，卵巢組織中的各級(jí)卵母細(xì)胞均停留在凍存前的發(fā)育階段，復(fù)蘇之后，無論體外培養(yǎng)還是植入體內(nèi)，均需要卵巢組織能最大限度的恢復(fù)功能，卵母細(xì)胞能夠重新啟動(dòng)發(fā)育過程，并最終形成具有生殖功能的成熟卵母細(xì)胞，達(dá)到保留生育能力的目的。因此在卵巢組織復(fù)蘇后對卵巢功能的干預(yù)非常有必要。由于體外培養(yǎng)只能模擬體內(nèi)的條件，有研究發(fā)現(xiàn)在合理的體外條件下，小鼠卵巢內(nèi)的卵泡有繼續(xù)發(fā)育的趨勢，培養(yǎng)2 d之內(nèi)的酶活性與正常的相比無明顯差異，因此對卵巢組織凍融后的體外干預(yù)時(shí)間應(yīng)在2 d之內(nèi)［17］。細(xì)胞凍存時(shí)，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)的許多酶和受體的活性均會(huì)降低，在凍存階段干預(yù)藥物影響不大。若在凍存前使用藥物進(jìn)行卵巢功能的干預(yù)，所需周期較長，并且對于非性腺腫瘤進(jìn)行放化療而需要保留生育能力的患者，并不需要在卵巢組織凍存之前進(jìn)行藥物干預(yù)，因此凍存前使用藥物進(jìn)行卵巢功能的干預(yù)，臨床應(yīng)用不是必須的。因此本研究將藥物干預(yù)時(shí)間選擇在復(fù)蘇后，并且只干預(yù)24 h。

MPF是一種蛋白激酶，在細(xì)胞從G2期進(jìn)入到M期時(shí)起著重要作用。MPF的活躍能促進(jìn)卵母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂。形態(tài)上，卵母細(xì)胞生發(fā)泡的破裂，跟破裂前幾小時(shí)MPF的活性增強(qiáng)有關(guān)。G2/M時(shí)，MPF被激活，促進(jìn)G2/M的轉(zhuǎn)變，可見，MPF在卵母細(xì)胞成熟過程中起著非常重要的作用，MPF的激活啟動(dòng)了減數(shù)分裂［18］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠卵巢組織凍融后，其中MPF的表達(dá)水平，右歸丸鼠血清組和空白血清組明顯高于FSH組和空白組。雖然右歸丸鼠血清組與空白鼠血清組之間對比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但前者M(jìn)PF的表達(dá)水平比后者高，且更穩(wěn)定（空白血清組標(biāo)準(zhǔn)差為4.46，右歸丸血清組標(biāo)準(zhǔn)差為1.82）。由此推測，右歸丸鼠血清可能通過增加卵巢組織中MPF的表達(dá)水平，促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，進(jìn)而促進(jìn)凍融后體外培養(yǎng)過程中卵母細(xì)胞的成熟。

顆粒細(xì)胞（Granu1osa Ce11）是卵泡刺激素（Fo11ic1e-Stimu1ating Hormone，F(xiàn)SH）作用于卵巢的靶細(xì)胞［19］。在FSH的作用下，竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞獲得黃體生成激素（Luteinizing Hormone，LH）受體。

雌激素（Estradio1，E2）的合成是由卵巢的卵泡膜細(xì)胞與顆粒細(xì)胞在FSH和LH的協(xié)同作用下完成的。卵泡膜細(xì)胞上的LH-R與LH結(jié)合后可使細(xì)胞內(nèi)膽固醇形成雌激素的前身物質(zhì)睪酮和雄烯二酮并進(jìn)入顆粒細(xì)胞。顆粒細(xì)胞上的FSH-R與FSH與結(jié)合后可激活芳香化酶活性，將睪酮和雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌二醇和雌酮。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中E2水平，右歸丸鼠血清組較空白血清組高，并顯著高于空白組，F(xiàn)SH組和空白血清組顯著高于空白組；小鼠卵巢組織中FSH-R的表達(dá)水平，右歸丸鼠血清組和空白血清組明顯高于FSH組和空白組。LH-R的表達(dá)水平，右歸丸血清組明顯高于FSH組和空白組，同時(shí)也高于空白血清組，而空白血清組高于空白組。由于FSH組與右歸丸鼠血清組培養(yǎng)基中FSH的水平基本相當(dāng)，故培養(yǎng)基中FSH的原始水平對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無必然影響。

由此推測，右歸丸鼠血清組雌激素（E2）水平較其他幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組更高，可能與FSH-R和LH-R的表達(dá)水平明顯提高有關(guān)，而FSH-R和LH-R的表達(dá)水平提高可以促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟。至于右歸丸鼠血清是否能提高凍融后卵巢組織睪酮（T）的水平，進(jìn)而通過這一途徑提高培養(yǎng)基中E2水平尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

在小鼠卵巢組織玻璃化凍存過程中，全程添加FSH更有利于卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的保持［20］。在小鼠卵巢自體移植時(shí)添加FSH可提前恢復(fù)卵巢組織血供［21］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然4次實(shí)驗(yàn)中FSH組取到的卵細(xì)胞數(shù)量最多，但是成熟率最低，且右歸丸鼠血清組的卵母細(xì)胞成熟率明顯高于該組。因此，我們認(rèn)為右歸丸鼠血清在本研究中對程序化凍融后的小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響作用強(qiáng)于FSH。

目前已知，竇狀卵泡期的顆粒細(xì)胞在FSH的持續(xù)作用下獲得黃體生成激素（Luteinizing Hormone，LH）受體。那么可以推測，卵巢組織中FSH-R的表達(dá)水平提高后，對FSH的結(jié)合能力提高，F(xiàn)SH對竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞的作用能力提高，從而提高LH-R的表達(dá)水平。

此外，本研究結(jié)果還提示，LH-R的表達(dá)水平，右歸丸鼠血清組明顯高于FSH組和空白組，同時(shí)也高于空白血清組，空白血清組LH-R的表達(dá)水平高于空白組。

但在FSH-R表達(dá)水平的檢測結(jié)果中，右歸丸鼠血清組較空白血清組低，根據(jù)FSH-R和LH-R檢測數(shù)據(jù)的結(jié)果分析，推測：（1）空白血清能提高卵泡中FSH-R的表達(dá)水平，從而間接提高LH-R的水平；（2）右歸丸鼠血清，除了具有空白血清的相同成分以外，還含有右歸丸成分，在產(chǎn)生與空白血清相似的作用以外，還有可能直接提高LH-R的表達(dá)水平；（3）空白血清對FSH-R的表達(dá)水平作用強(qiáng)于右歸丸鼠血清，而右歸丸鼠血清對LH-R的表達(dá)水平作用強(qiáng)于空白血清。

對右歸丸鼠血清和空白血清中FSH、LH、E2和P水平的檢測提示，F(xiàn)SH和LH的水平，空白血清均顯著高于右歸丸鼠血清，但LH-R的表達(dá)水平，右歸丸鼠血清組高于空白血清組，而FSH-R的表達(dá)水平卻表現(xiàn)為右歸丸鼠血清組較空白血清組低，進(jìn)一步證實(shí)了鼠血清中右歸丸的成分對LH-R表達(dá)的作用強(qiáng)于其對FSH-R表達(dá)的作用。

中醫(yī)理論認(rèn)為，“腎藏精，主生殖”，《素問·上古天真論》（本文《素問》原文均引自《重廣補(bǔ)注黃帝內(nèi)經(jīng)素問》，北京：中醫(yī)古籍出版社，2003年）曰：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長，二七天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時(shí)下，故有子”?！疤旃铩毕喈?dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中各種與生殖相關(guān)的激素，而腎是天癸之源。卵子屬生殖之精的范疇，女性生殖系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是以腎-天癸-沖任-胞宮生殖軸的功能及其相互間的平衡協(xié)調(diào)為前提。卵子發(fā)育、成熟的過程中，腎精的充盛與否與卵泡是否能發(fā)育成熟密切相關(guān)，腎陽的推動(dòng)作用，能促進(jìn)卵泡的發(fā)育、成熟。對女性而言，腎中陽氣失于推動(dòng)作用，卵泡的發(fā)育、成熟均會(huì)受到影響。從而導(dǎo)致不孕。

對于腎陽不足而致不孕的患者，補(bǔ)腎助陽是臨床常用的治療手段。補(bǔ)腎助陽的經(jīng)典方劑之一“右歸丸”，出自明代著名醫(yī)家張景岳的《景岳全書·新方八陣》［11］。其功效為溫補(bǔ)腎陽，填精益髓。主治腎陽不足，命門火衰證。中醫(yī)婦科臨床應(yīng)用很廣泛，有報(bào)道右歸丸對腎陽虛型的不孕、滑胎、月經(jīng)后期等癥，只要辨證準(zhǔn)確，均有較好療效［12-13］。

前期對補(bǔ)腎中藥的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，含補(bǔ)腎中藥鼠血清加入卵細(xì)胞體外培養(yǎng)基中，可促進(jìn)小鼠未成熟卵細(xì)胞生長發(fā)育，主要是促進(jìn)卵細(xì)胞核成熟，并且不增加成熟卵細(xì)胞細(xì)胞骨架的異常幾率［8］。臨床上，在體外受精-胚胎移植過程中，采用滋腎或溫腎中藥進(jìn)行調(diào)理，能改善卵巢儲(chǔ)備功能，從而使體外受精-胚胎移植女性患者能募集到足夠數(shù)量的卵子［2］。補(bǔ)腎方藥可以顯著改善卵細(xì)胞成熟度［14］、增加患者的獲卵數(shù)［3-4］、提高優(yōu)質(zhì)卵率［5-6］。表明補(bǔ)腎中藥有促進(jìn)卵泡成熟、增加卵泡數(shù)量和改善卵巢儲(chǔ)備功能的作用。

右歸丸作為溫補(bǔ)腎陽的經(jīng)典方，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)進(jìn)行了多項(xiàng)研究。徐曉娟［15］等運(yùn)用體外培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)，將右歸丸水提液直接加入培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)右歸丸水提液高劑量組（0.18 g/mL）可明顯增加顆粒細(xì)胞雌激素、孕酮分泌量，同時(shí)顯著增加顆粒細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平。方云蕓［16］等通過建立雄激素致排卵障礙型不孕大鼠模型，第80日齡開始給藥，5周后股動(dòng)脈取血，用放免法檢測血中E2和T水平。發(fā)現(xiàn)右歸丸能夠增加血清中E2水平、降低血清中T的水平。因此推測右歸丸有可能通過促進(jìn)T轉(zhuǎn)化為E2這一途徑，達(dá)到促排卵和助孕安胎的功效。

在本課題中，凍存的小鼠卵巢組織均被置于-196℃的液氮中，極低的外界溫度滿足寒邪生成的條件，在凍存過程中，小鼠卵巢組織功能停滯，相當(dāng)于中醫(yī)理論中寒邪所致的機(jī)體機(jī)能下降。而卵巢組織復(fù)蘇后，在卵巢組織體外培養(yǎng)基中加入具有溫腎助陽功效的右歸丸鼠血清，結(jié)果表明其能明顯促進(jìn)凍融后小鼠卵巢組織功能的恢復(fù)。也從另一個(gè)方面為溫陽促進(jìn)生殖提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)說明右歸丸在體內(nèi)、體外均對生殖有促進(jìn)作用。

但右歸丸鼠血清促進(jìn)凍融后小鼠卵巢組織功能恢復(fù)的更深入的機(jī)制，還需后續(xù)研究。

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Rats'serum containing Yougui PiIIs regains frozen-thawed mouse ovarian function

LIQi-jia1， LU Hua1*， DENG Yan-1i2
（1.The Second Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610041，China；2.The Clinical School of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China）

AIM To exp1ore the effects of rat serum containing Yougui Pi11s（Rehmanniae Radix praeparata，Aconiti lateralis Radix praeparata，Cinnamomi Cortex，Cinnamomi Cortex，Evodiae Fructus，Cuscutae Semen，Cervi Cornus Colla，Lycii Fructus，Angelicae sinensis Radix，Eucommiae Cortex）on the function of programmed frozen-thaw ofmouse ovarian tissue in vitro.METHODS Ovarieswere co11ected from 40 6-week-o1d ICR mice，which were stimu1ated by pregnantmare serum gonadotropin.A11ovarian tissue were cryopreserved in 1iquid nitrogen and recovered after two days.Then，the ovarieswere random1y assigned into four groups：b1ank group，b1ank serum group，fo11ic1e-stimu1ating hormone（FSH）group and Yougui Pi11s serum group.A11ovarieswere cu1tivated in specia1DMEM medium for24 hours，and immature oocyteswere removed from the 1eft-side ovaries.Fina11y，the exc1usion rates of the first po1ar body of oocytesweremeasured under amicroscope and an inverted microscope.E2（estradio1）1eve1s of themedium were assayed by an ELISA.At the same time，contents ofMPF，F(xiàn)SH-R and LHR of ovarian tissues in the right sidewere determined by ELISAs.RESULTS The oocytesmaturation rate and the 1eve1s of MPF，F(xiàn)SH-R and LH-R in the Yougui Pi11s serum group were significant1y higher than those in the FSH group and b1ank group.E21eve1s of cu1turemedium in the Yougui Pi11s serum group were higher than those of the b1ank serum group and b1ank group.CONCLUSION The present resu1ts suggest that Yougui Pi11smay be an effective formu1a to assist the function recovery of frozen-thawed ovaries in c1inica1practice.

programmed frozen-thaw；mouse ovary tissue；Yougui Pi11s；serum contained drugs

R285.5

A

1001-1528（2015）01-0021-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.005

2014-01-15

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2010CB530403）；國家自然科學(xué)基金（81173288）；四川省科技廳青年基金（2010JQ0038）

李啟佳（1986—），女，碩士生，醫(yī)師，從事中醫(yī)藥對女性生殖調(diào)控的研究。E-mai1：1qj_1etty@126.com

陸 華（1964—），女，博士，研究員，從事中醫(yī)藥對女性生殖調(diào)控的研究。E-mai1：kjc1h@126.com