劉 貝，　王淑美，　王佰靈，　許亞韜，　閆二磊，　胡旭光，　梁生旺

（廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東　廣州　510006）

三棱的環(huán)二肽類成分抗凝活性

劉 貝，王淑美，王佰靈，許亞韜，閆二磊，胡旭光，梁生旺*

（廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

目的 研究從三棱中分離得到的環(huán)-（酪氨酸-亮氨酸）、環(huán)-（苯丙氨酸-苯丙氨酸）和環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）這3個環(huán)二肽類成分的體外抗凝活性。方法 使用試劑盒測定三棱乙醇提液分離得到3個環(huán)二肽類成分對取自雄性SD大鼠腹主動脈貧血小板血漿的凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）及凝血酶時間（TT）。結(jié)果 環(huán)-（酪氨酸-亮氨酸）、環(huán)-（苯丙氨酸-苯丙氨酸）和環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）均可使大鼠血漿PT、APTT和TT顯著延長（P＜0.1）。前二者未呈現(xiàn)出量效關(guān)系，后者呈現(xiàn)正性量效關(guān)系。結(jié)論 三棱的環(huán)二肽類成分均具有抗凝活性，以環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）的抗凝作用尤為顯著。

三棱；環(huán)-（酪氨酸-亮氨酸）；環(huán)-（苯丙氨酸-苯丙氨酸）；環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）；抗凝血；凝血酶原時間；活化部分凝血活酶時間；凝血酶時間

三棱為黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.的干燥塊莖，首載于《本草拾遺》，現(xiàn)為《中國藥典》收載，其味苦、性平，入肝、脾經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛等功能［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，三棱被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病，腫瘤及婦科各類疾病的治療［2-3］。三棱的化學(xué)成分復(fù)雜，含有黃酮和黃酮苷、苯丙素苷、甾體及其苷、有機(jī)酸等化合物［4-5］，雖然現(xiàn)代化學(xué)和藥理研究已部分闡明了化學(xué)成分和臨床應(yīng)用之間的聯(lián)系［6-7］，但是還有很多活性成分未被找到。因此進(jìn)一步揭示三棱中化學(xué)成分與臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用之間的聯(lián)系，對于指導(dǎo)臨床用藥和新藥開發(fā)有非常重要的意義。

本課題組前期對三棱醇提液進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)研究，利用有效成分跟蹤法從本植物中分離得到3個環(huán)二肽類成分：環(huán)-（酪氨酸-亮氨酸）（cyc1o-（Tyr-Leu））（化合物A），環(huán)-（苯丙氨酸-苯丙氨酸）

（cyc1o-（Phe-Phe））（化合物B），環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）（cyc1o-（Phe-Tyr））（化合物C）［8-9］。本實驗通過觀察其對凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時間（activated partia1 thrombop1astin time，APTT）及凝血酶時間（thrombin time，TT）的影響，對此3種環(huán)二肽進(jìn)行體外抗凝活性的初步研究，以期為抗血栓天然藥物的開發(fā)提供新的依據(jù)。

1　材料

1.1動物 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～250 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008-0020。

1.2藥物與試劑 凝血酶原時間PT試劑盒、活化部分凝血激酶時間APTT試劑盒和凝血酶時間TT試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號分別是20130314、20130201、20130314；肝素（Sigma公司，批號20120509）；水合氯醛（廣州思樂生化試劑有限公司）；生理鹽水（貴州天地藥業(yè)有限公司，批號A13011209）；二甲基亞砜（DMSO）（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；枸櫞酸鈉（分析純，天津市百世化工有限公司，批號0110）。

1.3儀器 臺式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；電熱恒溫水浴鍋（HHS型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FA1104型電子分析天平（上海天平儀器廠）；秒表（上海星鉆秒表有限公司）；EP管（上海申翔化學(xué)試劑有限公司）；移液槍（北京華匯通科技發(fā)展有限公司）；注射器（上海楚定分析儀器有限公司）。

2　方法

2.1血漿制備 大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分裝于含0.4 mL，109 mmo1/L枸櫞酸鈉抗凝液的塑料離心管，每管約3.6 mL，立即輕輕顛倒混勻。3 000 r/min離心15 min，收集上清，即得貧血小板血漿（PPP），在2 h內(nèi)進(jìn)行實驗，或-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2環(huán)二肽類成分的制備［9］

2.2.1三棱有效部位的提取 取中藥三棱的干燥塊莖14 kg，粉碎成粗粉，置多功能提取罐中，用60%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，過濾，合并續(xù)濾液，回收乙醇，干燥，得總浸膏752 g。將總浸膏混懸于水中，超聲20 min，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并各萃取液，減壓回收，得石油醚部位浸膏26 g，三氯甲烷部位浸膏34 g，乙酸乙酯部位浸膏11.5 g，正丁醇部位浸膏42 g，見路線圖1。

圖1　三棱有效部位的提取路線圖Fig.1　Extracting process of effective fraction of Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.

2.2.2環(huán)二肽類成分的分離純化 將所得乙酸乙酯部位11.5 g浸膏，使用約50 mL乙酸乙酯溶解樣品，干法拌樣，經(jīng)硅膠（200～300目）柱層析粗分，以三氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，TLC檢視，合并薄層行為相同的流份。圖2所示為乙酸乙酯部位的粗分流程圖。

Fr.38～Fr.40合并，減壓濃縮，用適量甲醇溶解，室溫放置，得到白色針狀結(jié)晶。根據(jù)化合物1H-NMR，13C-NMR數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)比對結(jié)果，確定分得化合物為環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）（化合物C），結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖2　乙酸乙酯部位的粗分流程圖Fig.2　Extracting process of ethyIacetate extract

圖3　環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）（化合物C）Fig.3　Com pound C（cycIo-（Phe-Tyr））

Fr.41～Fr.43合并，減壓濃縮，用適量三氯甲烷溶解，干法拌樣，經(jīng)硅膠（200～300目）柱層析細(xì)分，以三氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，TLC檢視，合并相同的流份。將Fr.2～Fr.4合并，室溫放置后析出白色針狀結(jié)晶，依據(jù)1H-NMR，13CNMR光譜測定數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)比對結(jié)果，確定該結(jié)晶也為環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）。Fr.41～Fr.43段的細(xì)分流程見圖4。將Fr.5～Fr.7合并，室溫放置后析出白色針狀結(jié)晶，通過測定1H-NMR，13C-NMR，HMBC，HMQC光譜和文獻(xiàn)比對，確定分得化合物環(huán)-（酪氨酸-亮氨酸）（化合物A），結(jié)構(gòu)式見圖5。

Fr.44～Fr.47合并，減壓濃縮，用適量三氯甲烷溶解，干法拌樣，經(jīng)硅膠（200～300目）柱層析細(xì)分，以三氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，TLC檢視，合并相同的流份。將Fr.5～Fr.9合并，減壓濃縮，用適量三氯甲烷溶解，干法拌樣，經(jīng)硅膠（200～300目）柱層析再細(xì)分，以三氯甲烷-甲醇等比例洗脫，TLC檢視，合并Fr.8～Fr.11，析出白色針狀色結(jié)晶，經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶得純針狀結(jié)晶化合物。根據(jù)化合物1H-NMR，13C-NMR數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)比對結(jié)果，確定分得化合物環(huán)-（苯丙氨酸-苯丙氨酸）（化合物B），結(jié)構(gòu)式見圖6。圖7所示為Fr.44～Fr.47段的細(xì)分流程圖。

圖4　Fr.41～Fr.43段的細(xì)分流程圖Fig.4　Extracting process of Fr.41-Fr.43

圖5　環(huán)-（酪氨酸-亮氨酸）（cycIo-（Tyr-Leu））（化合物A）Fig.5　Compound A（cycIo-（Tyr-Leu））

2.3環(huán)二肽類成分的純度測定 采用HPLC法對上述分得的3中環(huán)二肽進(jìn)行純度測定。色譜條件：色譜柱Phenomenex Luna（2）C18柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流動相乙腈-0.1%THF（20∶80）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10μL。以面積歸一化法計算，各化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于99.0%。

圖6　環(huán)-（苯丙氨酸-苯丙氨酸）（cycIo-（Phe-Phe））（化合物B）Fig.6　Compound B（cycIo-（Phe-Phe））

圖7　Fr.44～Fr.47段的細(xì)分流程圖Fig.7　Extracting process of Fr.44-Fr.47

2.4抗凝活性測定 將化合物A、B、C用DMSO溶解成0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的溶液，手工法測定各肽的APTT、PT和TT值。具體實驗分別按照凝血酶原時間PT試劑盒、活化部分凝血激酶時間APTT試劑盒以及凝血酶時間TT試劑盒說明進(jìn)行操作。對于每一個化合物，其4個質(zhì)量濃度下的APTT、PT和TT指標(biāo)各重復(fù)測定10次。

2.5結(jié)果記錄 加入相應(yīng)試劑立即混勻并開動秒表，試管仍浸于水浴中，至約10 s時取出，每隔2 s向上挑動至生成固體細(xì)絲終止計時，即得PT、APTT或TT時間。

3　結(jié)果

3.1化合物A的抗凝血活性 與空白組相比，化合物A的各質(zhì)量濃度組均可顯著延長大鼠血漿PT、APTT和TT值（P＜0.10，圖8），但并不表現(xiàn)出濃度依賴性。進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)化合物A對PT指標(biāo)作用明顯（P＜0.05），其次為APTT指標(biāo)和TT指標(biāo)。

圖8　不同質(zhì)量濃度化合物A對大鼠血漿PT，APTT，TT的影響Fig.8　InfIuence of com pound A on p Iasma APTT，TT and PT

3.2化合物B的抗凝血活性 與空白組相比，化合物B的各質(zhì)量濃度組均可顯著延長大鼠血漿PT、APTT和TT值（P＜0.10，圖9），但并不表現(xiàn)出抗凝時間隨質(zhì)量濃度增高而延長的特點(diǎn)。進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)化合物B對TT指標(biāo)作用明顯（P＜0.01），其次為APTT指標(biāo)和PT指標(biāo)。

圖9　化合物B對大鼠血漿PT，APTT，TT的影響Fig.9　InfIuence of compound B on p Iasma APTT，TT and PT

3.3化合物C的抗凝血活性 與空白組相比，化合物C的各質(zhì)量濃度組均可顯著延長大鼠血漿PT、APTT和TT值（P＜0.10，圖10），且表現(xiàn)出較明顯的質(zhì)量濃度依賴性（圖11）。進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)化合物C對PT、APTT和TT指標(biāo)作用強(qiáng)度相當(dāng)（P＜0.01）。

圖10　化合物C對大鼠血漿PT，APTT，TT的影響Fig.10　InfIuence of compound C on p Iasma APTT，TT and PT

圖11　化合物C與PT，APTT，TT值的量效關(guān)系Fig.11　M eans p Iots of PT，APTT and TT against different concentrations of compound C

4　討論

血液凝固是由凝血因子按一定順序相繼激活而生成的凝血酶最終使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白的過程。因此，凝血過程可分為凝血酶原酶復(fù)合物的形成、凝血酶的激活和纖維蛋白的生成3個基本步驟。其中，凝血酶原酶復(fù)合物可以通過內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑生成。兩條參與途徑的主要區(qū)別在于啟動方式和參與的凝血因子不相同，但兩條途徑中的某些凝血因子可以相互激活，兩者間相互密切聯(lián)系并非各自獨(dú)立［10］。

本實驗選取了凝血酶原時間PT、活化部分凝血活酶時間APTT及凝血酶時間TT作為化合物A、 B、C的體外抗凝活性檢測指標(biāo)［11-12］。APTT、PT和TT分別代表3條不同的凝血途徑［13］。PT主要用于篩選檢測外源凝血系統(tǒng)的FⅡ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ及相關(guān)因子的抑制物的試驗，通過在待測血漿中加入過量的組織凝血活酶和鈣離子，使凝血酶原變?yōu)槟?，后者使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。APTT常用于內(nèi)源性凝血系統(tǒng)（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子）的篩選及肝素抗凝治療的監(jiān)測。以各種激活劑（如白陶土）激活待測血漿中凝血因子Ⅻ，Ⅺ，再以磷脂作為凝血的活性表面，激活內(nèi)源凝血途徑，使凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶，凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，導(dǎo)致血漿的凝固。TT是檢測凝血、抗凝及纖維蛋白溶解系統(tǒng)功能的一個簡便試驗，檢查待測血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的能力。

實驗中設(shè)定α值為0.10，當(dāng)P值小于0.10為有顯著性差異。大鼠個體間的血凝情況存在差異，考慮到本研究的目的在于考察三棱中環(huán)二肽的抗凝活性，所以在統(tǒng)一性別的基礎(chǔ)上每組設(shè)置10只大鼠，而并未對其個體的血凝差異進(jìn)行深入研究。依據(jù)現(xiàn)有結(jié)果，認(rèn)為可通過增加樣本量的方法來減小標(biāo)準(zhǔn)差。中藥三棱是一味破血止痛的良藥，有賴于其中多種化學(xué)物質(zhì)組的共同作用而非某單體化合物的單一功效，本研究結(jié)果證明了三棱中的環(huán)二肽類化合物屬于其藥效物質(zhì)成分之一，但具體的抗凝機(jī)制與構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

實驗結(jié)果顯示，化合物A、B、C均能在體外顯著延長大鼠血漿PT、APTT、TT值，表現(xiàn)出抗凝活性。化合物C的3個指標(biāo)項下的時間均數(shù)隨質(zhì)量濃度增高而延長，當(dāng)達(dá)到4 mg/mL時，抗凝作用進(jìn)一步加強(qiáng)，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系但不顯著，各劑量組間無顯著性差異（P＞0.10）；實驗中不同劑量梯度的化合物A和B對各指標(biāo)的影響也未呈現(xiàn)出量效關(guān)系。這可能與實驗的操作方法有關(guān)。本實驗采用手工法進(jìn)行化合物的體外抗凝活性評價，操作誤差較大，從而使標(biāo)準(zhǔn)差過大，一定程度上削弱了不同藥物濃度組間均數(shù)的差異［14］?？赏ㄟ^改用儀器測量的方法來減小標(biāo)準(zhǔn)差。

此外，不同化合物對PT、APTT及TT指標(biāo)的作用強(qiáng)度也不盡相同：化合物A對PT指標(biāo)作用明顯，其次為APTT指標(biāo)和TT指標(biāo)；化合物B對TT指標(biāo)作用明顯，其次為APTT指標(biāo)和PT指標(biāo)；化合物C對PT、APTT和TT指標(biāo)的作用強(qiáng)度相當(dāng)。此3種化合物對各指標(biāo)敏感性的不同提示各化合物的抗凝機(jī)制存在差異：化合物A主要通過外源性凝血途徑產(chǎn)生抗凝作用；化合物B的抗凝機(jī)制主要與血漿纖維蛋白原水平及纖維蛋白形成的速度有關(guān)；化合物C可能對內(nèi)源性及外源性凝血系統(tǒng)共同途徑產(chǎn)生抗凝作用。結(jié)合化合物A、B、C的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)A與C均含有對羥苯基的結(jié)構(gòu)片段，B與C均含有芐基結(jié)構(gòu)片段，A含有一個異丙基片段而B和C均不含此結(jié)構(gòu)?？梢酝茰y，若化合物中含有對羥苯基的取代結(jié)構(gòu)，則該物質(zhì)更傾向于通過干擾外源性凝血途徑而達(dá)到抗凝作用，同時也會激發(fā)內(nèi)源性途徑的某些凝血因子繼而使凝血效應(yīng)放大；抑或作用于內(nèi)源性及外源性凝血系統(tǒng)共同途徑產(chǎn)生抗凝效果。若化合物中含有芐基結(jié)構(gòu)片段，則該物質(zhì)更傾向于通過干擾血漿纖維蛋白原至纖維蛋白的轉(zhuǎn)變而達(dá)到抗凝效果。本實驗不能說明化合物的抗凝作用與其結(jié)構(gòu)的疏水性有相關(guān)關(guān)系［15］。

綜上，環(huán)-（酪氨酸-亮氨酸）、環(huán)-（苯丙氨酸-苯丙氨酸）及環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）均為首次從本植物中分離得到的環(huán)二肽類成分，經(jīng)體外實驗研究證實各化合物均具有抗凝活性，以環(huán)-（苯丙氨酸-酪氨酸）的抗凝作用尤為顯著并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，進(jìn)而分析推測了此三種化合物的體外抗凝作用機(jī)制。但在本實驗中，各化合物的量效關(guān)系均不明顯，且不清楚其究竟作用于凝血系統(tǒng)的何環(huán)節(jié)或作用于何因子，此外，當(dāng)3種成分疊加作用時抗凝效果如何，這些都有待于深入研究。

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Anticoagu Iant activity of cycIic dipeptides from Sparganii Rhizome

LIU Bei， WANG Shu-mei， WANG Bai-1in， XU Ya-tao， YAN Er-1ei， HU Xu-guan，LIANG Shen-wang*
（Department of Chinese Traditional Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510240，China）

AIM To study the in vitro anticoagu1antactivity of cyc1odipeptide（cyc1o-（Tyr-Leu），cyc1o-（Phe-Phe）and cyc1o-（Phe-Tyr））iso1ated from Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.METHODS The specia1 kits were used to measure anticoagu1ant activity with p1ate1et poor p1asma co11ected from abdomina1 aorta ofma1e SD rats，inc1uding prothrombin time（PT），activated partia1 thrombop1astin time（APTT）and thrombin time（TT）. RESULTS PT，APTT，TT were pro1onged by the addition of cyc1o-（Tyr-Leu），cyc1o-（Phe-Phe）and cyc1o-（Phe-Tyr）.The former two presented no dose-effect re1ationship but the 1atter did.CONCLUSION Of three cyc1odipeptides from S.stoloniferum，a11 the three show anticoagu1ant activities with cyc1o-（Phe-Tyr）being by far themost effective.

Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.；cyc1o-（tyr-1eu）；cyc1o-（phe-phe）；cyc1o-（phe-tyr）；anticoagu1ation；prothrombin time（PT）；activated partia1 thrombop1astin time（APTT）；thrombin time（TT）

R285.5

A

1001-1528（2015）01-0034-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.008

2014-02-14

劉 貝（1989—），女，碩士生，主要從事中藥質(zhì)量控制研究。Te1：（020）39352172，E-mai1：1iubei_cpu@163.com

梁生旺（1954—），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量控制及新藥研發(fā)研究。Te1：（020）39352172，E-mai1：sw1iang371@163.com